tesina ACV in EBV

EFFETTO DEL ACV

TRIFOSFATO SU

DNA POLIMERASI

VIRALE E

CELLULARE

A- Inibizione DNA pol. virale,

α- pol. e β-pol.

B- inibizione con omissione del substrato dGTP

C- inibizione su poli-primer sintetico

DIAPOSITIVA DA CANCELLARE

• I presenti studi mostrano che il trifosfato di aciclovir inibisce la DNA polimerasi associata all'EBV in misura

molto maggiore di quella che inibisce le ALFA- e BETA-polimerasi dell'ospite. La forma trifosforilata del

farmaco si comporta come un classico inibitore competitivo della DNA polimerasi EBV rispetto al dGTP

.Queste osservazioni, insieme all'apparente inefficace fosforilazione dell'ACV nelle cellule infette da EBV

(risultati non pubblicati), in contrasto con la fosforilazione selettiva e sorprendente nelle cellule infette da

HSV, ci portano a proporre che l'elevata sensibilità dell'EBV DNA polimerasi associato verso ACV trifosfato

spieghi l'inibizione della replicazione dell'EBV. In questo caso è sufficiente una piccola quantità di farmaco

fosforilato, fosforilato forse dalla timidina ospite o dalle chinasi nucleosidiche puriniche, per inibire l'EBV. I

risultati presentati in Fig. mostrano l'effetto del trifosfato ACV sulle DNA polimerasi virali e cellulari. Con il

DNA del timo di vitello attivato come modello (Fig. 1A), la polimerasi associata all'EBV è fortemente inibita

dall'aumento delle concentrazioni di trifosfato di ACV. A 100 microM viene rilevata poca attività residua,

mentre alfa e beta polimerasi conservano il 50% e il 90% dell'attività residua, rispettivamente, alla stessa

concentrazione. Con l'omissione di dGTP dai substrati, l'entità dell'inibizione si riduce a concentrazioni

comparabili del farmaco (Fig. 1B). Per decidere se l'estensione dell'inibizione dipende dalla composizione

del modello di primer, abbiamo anche studiato l'effetto di questo composto trifosforilato su poli-primer

sintetico (dA) • (dT) 12-18. L'entità dell'inibizione è molto meno con questo modello. I risultati indicano che

il trifosfato di ACV compete in modo più efficiente con il dGTP che con altri trifosfati di desossi-nucleoside e

che l'inibizione da parte del trifosfato ACV di polimerasi virali e cellulari dipende dalla composizione di base

del primer per stampi. Una maggiore inibizione si osserva con il DNA del timo di vitello attivato, mentre

l'uso di poli (dA) • (ciT) 12-18 come primer per stampi produce un'inibizione molto inferiore.

COSTANTI

D’INIBIZIONE

DIAPOSITIVA DA CANCELLARE

• L'affinità della polimerasi associata all'EBV per l'aciclovir

trifosfato (Ki = 0,015 f 0,002 AM) è quasi 100 volte

maggiore di quella dell'alfa-polimerasi (Ki = 1,5 f 0,05

gM) (Tabella 1 ). Inoltre, la potenza inibitoria

differenziale dell'analogo per le due polimerasi è

ulteriormente migliorata dal fatto che i loro valori di Km

apparenti per il substrato competitivo, dGTP,

differiscono in maniera precisamente reciproca (Tabella

1). Pertanto, una maggiore affinità del trifosfato di ACV

verso la polimerasi EBV rispetto alle polimerasi

specificate dall'HSV-1 spiega il fatto che, nonostante

l'incapacità di rilevare la timidina chinasi specifica

dell'EBV e l'apparente inefficace fosforilazione dell'ACV,

B:

A: 1- Reazione in

1- Reazione in presenza di

3

presenza ACV 3 ddTTP anziché

trifosfato e 2 dTTP;

2

anziché dGTP; 2- Reazione in

2- Reazione in presenza di 4

presenza di 3 1 1 dNTP;

dNTP senza 3- Reazione in

dGTP; presenza di 3

3- Reazione in

CINETICA DELLA DNA POLIMERASI

dNTP senza

presenza di 4

VIRALE IN PRESENZA DI INIBITORE dTTP

dNTP.

DIAPOSITIVA DA CANCELLARE

• è stato dimostrato che il trifosfato di ACV non è solo un inibitore competitivo della DNA polimerasi

specificata da HSV-1, ma anche un substrato per questo enzima. L'incorporazione del monofosfato di

ACV ha comportato una riduzione del tasso di reazione della DNA polimerasi virale da HSV-1 in vitro

con DNA del timo di vitello attivato come primer per stampi. Questo risultato ha portato alla

conclusione che l'incorporazione del monofosfato di ACV nei termini 3 'del DNA porta alla fine della

catena, una base per l'inibizione della replicazione del virus. Al fine di determinare se lo stesso

meccanismo è operativo nelle reazioni mediate dalla DNA polimerasi di EBV, è stata misurata la

cinetica della reazione di catalisi della pol. virale in presenza e assenza di trifosfato di ACV.

• I risultati in Fig. 3A mostrano che la reazione della DNA polimerasi espressa da EBV, sebbene inibita,

è proseguita linearmente per un lungo periodo di tempo quando il trifosfato di ACV è stato sostituito

con dGTP come substrato. Tali cinetiche di reazione sono possibili solo se l'effetto del farmaco è

competitivo rispetto al substrato. Al contrario, la velocità della reazione di E. coli DNA polimerasi I in

presenza di ddTTP, un terminatore a catena ben caratterizzato, è rapidamente diminuita dopo i primi

minuti di linearità (Fig. 3B). Risultati non pubblicati mostrano anche che quando la cinetica della

reazione viene seguita con la DNA polimerasi EBV in presenza di ddTTP, nel tempo si ottiene una

reazione lineare ma depressa. Pertanto, le differenze nella cinetica di reazione tra DNA polimerasi

espressa da EBV ed E. coli DNA polimerasi I rispettivamente in presenza di trifosfato ACV e ddTTP,

indicano una diversa modalità di inibizione della sintesi del DNA da parte dei due inibitori con i

rispettivi enzimi.

CONCLUSIO DUE POSSIBILI

NI MECCANISMI

A B

LEGAME INIBIZIONE

IRREVERSIBILE DI COMPETITIVA DI

DNA-POL. VIRALE DNA POL. VIRALE

CON LA CATENA DI RISPETTO dGTP

DNA

B PREVALENTE:

1- INIBIZIONE INVERTIBILE IN VITRO CON ECCESSO DI dGTP

2- INIZIBIZIONE RIDOTTA IN ASSENZA DI dGTP

3- CINETICA DI INIBIZIONE LINEARE

4- RISULTATI SULLA PREINCUBAZIONE ESCLUDONO IL LEGAME IRREVERSIBILE

5- RIDUZIONE DI GENOMA VIRALE NELLE CELLULE INFETTE