Terapia genica

Immunodeficienze Primitive

Le immunodeficienze primitive sono patologie genetiche globalmente molto frequenti con una prevalenza di 1/500-1/1.000 nati che in gran parte sono poco gravi o asintomatiche e sono caratterizzate da difetti a carico della fagocitosi, dell'immunità umorale, dell'immunità cellulare o di entrambe e dalla ricorrenza di infezione anche da microrganismi opportunisti (ad esempio i deficit della fagocitosi determinano delle frequenti infezioni da batteri e miceti, i difetti dei linfociti B determinano delle infezioni da batteri, parassiti e virus ed i difetti dei linfociti T determinano delle infezioni da virus, batteri intracellulari, miceti e protozoi).

Un esempio di immunodeficienza primitiva è l'Immunodeficienza Combinata Severa o SCID (Severe Combined ImmunoDeficiency) che è caratterizzata da una mancanza di funzione dei linfociti T e B e spesso anche delle Natural Killer e da un quadro di infezioni ricorrenti.

può essere dovuta a mutazioni in diversi loci genici come il gene per l'adenosinadeaminasi che causa un accumulo di purine (ADA-SCID), il gene per la fosforilasi deinucleotidi purinici che causa un accumulo di purine, il gene per la subunità γ common dei recettori di IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21 che causa difetti nel signalling delle cellule B e T (X-SCID), il gene per la chinasi JAK3 a valle dei recettori citochinici che causa difetti nel signalling delle cellule B e T, il gene per la chinasi ZAP-70 a valle del T-Cell Receptor che causa difetti nel signalling delle cellule T ed i geni TAP1 e TAP2 coinvolti nel complesso MHC-I che causano un difetto nella processazione degli antigeni. Un altro esempio di immunodeficienza primitiva è la malattia granulomatosa cronica o CGD (Chronic Granulomatous Disease) che è caratterizzata da un deficit dell'ossidasi dei fagociti che permette la produzione di anione superossido per la distruzione dei.batteri edei miceti all'interno dei fagosomi ed è dovuta al deficit delle proteine gp91 e p47 .phox phox
La proteina gp91phox è codificata da un gene presente sul cromosoma X, quindi la X-CGD è maggiormente presente nei soggetti di sesso maschile, mentre i soggetti di sesso femminile presentano una ridotta attività enzimatica senza la ricorrenza delle infezioni.
La terapia convenzionale si basa sulla terapia delle infezioni e su una terapia mirata alla correzione dell'immunodeficienza, in particolare in alcuni casi è possibile somministrare la proteina mancante in forma naturale o ricombinante come nel deficit di immunoglobuline (somministrazione di IVIG) o nel deficit di adenosina deaminasi (somministrazione di PEG-ADA) oppure se il difetto si esprime nelle cellule di origine emopoietica è possibile effettuare un trapianto di midollo osseo da un donatore compatibile (non è disponibile per tutti i pazienti, quindi i soggetti affetti).senza donatore sono candidati alla terpia genica). La terapia genica delle immunodeficienze primarie richiede un’espressione stabile del transgene, quindi inizialmente sono stati utilizzati solo i vettori retrovirali (principalmente il Virus della Leucemia Murina di Moloney, MMLV) e recentemente i vettori lentivirali che permettono una trasduzione ex vivo di cellule staminali emopoietiche CD34 prelevate dal midollo osseo o dal sangue periferico dopo mobilizzazione con fattori di crescita e di linfociti T del sangue periferico; inoltre, questa metodica necessita di purificare le cellule riceventi, di selezionale i cloni transfettati e di analizzare la capacità clonogenica delle cellule staminali dopo la trasfezione. Per quanto rigurda i modelli preclinici, la mancanza di modelli mutanti naturali per l’ADA-SCID ha causato delle difficoltà nei primi studi di terapia genica ma adesso sono disponibili dei topi geneticamente modificati anche se non sempre il difetto genico.causa nell'animale una patologia corrispondente a quella umana; in tempi recenti, sono stati ottenuti buoni risultati di terapia genica nei topi knock-out per il gene JAK3 (fenotipo dell'Immunodeficienza Combinata Severa), p47 e gp91 (fenotipo della Malattia phoxGranulomatosa Cronica) anche se è stata riscontrata un'efficacia variabile a seconda della presenza di infezioni con dosi letali di microrganismi o di mielosopressione (o "condizionamento non mieloablativo del midollo") per avvantaggiare le cellule trasdotte. Per quanto riguarda gli studi clinici per l'ADA-SCID, sono stati effettuati numerosi trials con vettori, cellule e trattamenti diversi, in particolare è stato approvato dall'EMA un protocollo privo di effetti collaterali che prevede l'utilizzo di cellule staminali emopoietiche CD34 prelevate dal midollo osseo, trasdotte con il Virus MMLV e reinfuse nel paziente dopo un pre-trattamento con Busulfan per migliorare.avanzate. Le retinopatie ereditarie sono patologie prevalentemente monogeniche con una prevalenza di 1/2.000 individui dovute ad una mutazione di oltre 150 geni che causano delle forme geneticamente e fenotipicamente eterogenee caratterizzate da cecità dovuta ad una disfunzione oppure alla degenerazione dei fotorecettori o dell'epitelio retinico pigmentato; le forme più frequenti sono rappresentate dalla renitite pigmentosa, dall'amaurosi congenita di Leber, dalla malattia di Stargardt e dall'acromatopsia. I primi vettori utilizzati sono stati i vettori adenovirali che però avevano un'espressione a breve termine a causa dell'eliminazione delle cellule trasdotte dovuta all'attivazione di una risposta immunitaria contro le proteine virali anche se l'utilizzo dei vettori adenovirali gutless rimangono un'opzione per quelle forme di retinopatia ereditaria che necessitano dell'inserzione di geni di grandi dimensioni; in tempi

più recenti sono stati utilizzati i vettori lentivirali che però presentano un rischio di mutagenesi inserzionale ed i vettori adeno-associati che sono poco immunogenici, molto sicuri ed esistono alcuni sierotipi contropismo retinico, in particolare il vettore adeno-associato più utilizzato e con maggiore efficienza per la retina è il AVV2/8 che è un vettore ibrido formato dalla ITR di AAV2 e dalla capside di AVV8.

L’amaurosi congenita di Leber è una patologia ad ereditarietà autosomica recessiva caratterizzata dalla degenerazione progressiva della retina con perdita della visione dovuta alla mutazione di numerosi geni (attualmente ne sono conosciuti almeno 17), in particolare l’amurosi congenita di Leber di tipo 2 (LCA2) è presente nel 5-10% dei casi ed è dovuta alla mutazione del gene RPE65 (Retinal Pigment Epithelium-specific 65 kDa) presente sul cromosoma 1.

I primi studi condotti hanno utilizzato il vettore

adeno-associato AAV2 che presenta untropismo per la retina e sono stati utilizzati diversi modelli preclinici animali fra cui ilmaiale, il roditore ed i cani, anche se il modello migliore è rappresentato dal cane dapastore di Brie (o Briard Shepherd) che è stato scoperto nel 1988 quando in un allevamentosvedese sono nati 5 cuccioli affetti da cecità, incapacità di evitare gli ostacoli e nistagmo;43sono stati effettuati degli studi sui cani Briard con il vettore AAV2 con il transgene RPE65che prevedevano una singola iniezione subretinica e che hanno dimostrato unmiglioramento della funzione visiva. Successivamente sono stati condotti 3 studi cliniciindipendenti che hanno coinvolto 30 pazienti e hanno dimostrato che la terapia genicautilizzata è sicura ed efficace anche se l'effetto di espressione del transgene è perso neltempo.[Lancelot è stato il primo cane Briard Sheperd curato con la terapia genica]La retinite pigmentosa

è una degenerazione dei fotorecettori della retina associata ad una progressiva perdita della visione che porta inizialmente ad una cecità notturna e poi ad una cecità totale dovuta a diverse mutazioni nel gene della rodopsina che è il pigmento essenziale per la visione; in particolare, per le forme recessive è stato ipotizzato l'utilizzo di una terapia genica sostitutiva mentre per le forme dominanti è stato ipotizzato l'utilizzo di una terapia genica ablativa. LA TERAPIA GENICA DI ALTRE PATOLOGIE MONOGENICHE Altre patologie in fase di studio per l'applicazione della terapia genica sono l'adrenoleucodistrofia che è una patologia caratterizzata dalla demielinizzazione del sistema nervoso centrale dovuta alla mutazione del gene ALD (o ABCD1) curabile attraverso un trapianto di midollo con cellule staminali emopoietiche trasdotte con il transgene ALD mediante un vettore lentivirale che permette la sostituzione delle.

celluledella microglia (prevede un pre-trattamento mieloablativo) e la β-talassemia che è unapatologia dovuta alla delezione parziale o totale del gene per la catena β dell'emoglobinache è trattata con un trpianto di cellule staminali emopoietiche autologhe trasdotte con iltrangene della β-globina mediante un vettore lentivirale dopo pre-trattamentomieloablativo.Il primo prodotto di terapia genica autorizzato in Europa è stato Alipogene Tiparvovec(Glybera®) ed è utilizzato per la terapia del deficit di lipasi lipoproteica (LPL) che è unenzima coinvolto nel catabolismo dei trigliceridi, dei chilomicroni e delle VLDL eche èespresso dal tessuto adiposo, dal muscolo scheletrico e dal miocardio per essere rilasciatoin circolo; tale farmaco è un vettore adeno-associato AVV1 con tropismo per le cellulemuscolari contenente il transgene LPL (variante natuale gain-of-function presente nelS447X20% della popolazione

caucasica) sotto il promotore di CMV che è somministrato per via intramuscolare. Gli studi preclinici hanno dimostrato che questa terapia può ridurre significativamente la replicazione del virus e migliorare la risposta immunitaria dell'organismo. Inoltre, è stata osservata una riduzione dei sintomi e un aumento della sopravvivenza nei pazienti trattati con questa terapia. Tuttavia, ulteriori studi sono necessari per confermare questi risultati e valutare la sicurezza e l'efficacia di questa terapia nei pazienti umani.