Terapia genica

Introduzione alla terapia genica

Negli anni '40 si scopre che il DNA è la fonte delle informazioni genetiche. Negli anni '60 sono scoperti gli enzimi di restrizione e le ligasi che permettono il trasferimento genico nei batteri e successivamente, negli anni '70, iniziano a diffondersi i metodi di clonaggio, sequenziamento e trasfezione di vettori plasmidici anche in cellule eucariote. In seguito, negli anni '80 è stata inventata la PCR che ha permesso di facilitare e velocizzare le operazioni di clonaggio e sono stati sviluppati i primi vettori retrovirali che hanno permesso di effettuare il primo trial clinico di terapia genica sull’uomo nel 1988, il quale ha suscitato molte speranze e ha dato i primi risultati (ma anche i primi effetti collaterali) nella prima decade del 2000.

Attualmente, sono consolidate alcune terapie geniche efficaci (come nel caso della SCID) e si stanno sviluppando nuove tecnologie quali la Next Generation Sequencing, lo sviluppo di nuovi vettori sempre più innovativi ed il genome editing.

Definizione di terapia genica

Non è facile dare una definizione univoca e precisa della terapia genica. In particolare, il Dizionario Academic Press di Tecnologia della Scienza la definisce come "l'introduzione di un gene in una cellula allo scopo di correggere una malattia ereditaria o di migliorare un genoma", mentre uno dei pionieri della terapia genica, Kenneth W. Culver, la definisce come "l'inserzione di un gene funzionante nelle cellule di un paziente per correggere un errore innato del metabolismo o per fornire una nuova funzione".

Più generalmente, è possibile definire la terapia genica come una terapia basata sull'utilizzo di sequenze di acidi nucleici; in particolare, possono essere utilizzati geni codificanti per proteine che sono inseriti in vettori di espressione ("vera terapia genica") oppure piccoli acidi nucleici non codificanti detti oligonucleotidi, considerati sia come un approccio farmacologico sia come un approccio di terapia genica.

Applicazioni della terapia genica

La terapia genica può essere per fini terapeutici nella cura delle malattie ereditarie monogeniche con fenotipo recessivo (come ad esempio la fibrosi cistica, l'emofilia, le distrofie muscolari e le malattie oculari) che colpiscono complessivamente meno del 2% della popolazione generale, nella cura di malattie non ereditabili ad alto impatto per le quali non esistono cure definitive (come ad esempio il cancro, le malattie cardiovascolari, le infezioni e le patologie degenerative del sistema nervoso centrale e dell’occhio) e nella creazione di vaccini genetici.

Ma può essere impiegata anche per fini non terapeutici come il doping genetico (spesso subdolo da identificare), per fini estetici ed anti-aging e per migliorare la progenie (designed babies).

Reazioni avverse e sperimentazioni

È importante notare che il fatto che non si siano verificate delle reazioni avverse gravi nei primi 20 anni di applicazione della terapia genica è dovuto al prevalente utilizzo di questa tecnica nei pazienti oncologici (65%) che presentano una bassa aspettativa di vita in quanto muoiono prevalentemente per complicanze dovute al tumore, determinando una piccola finestra di sperimentazione.

Il primo trial clinico di terapia genica è stato approvato nel 1988 ed è stato condotto dal medico immunologo americano Steven Rosenberg. L'obiettivo era trasferire il gene dell’IL-2 all'interno di linfociti prelevati da pazienti affetti da un cancro in stadio avanzato. Tuttavia, il primo trial utilizzava un approccio di terapia genica per permettere il trasferimento del gene di resistenza alla neomicina nei linfociti, quindi si trattava di uno studio di gene marking.

Successivamente, il secondo trial di terapia genica che è stato approvato nel 1990 aveva l'obiettivo di transfettare il gene per l'enzima adenosina deaminasi all'interno dei linfociti autologhi prelevati da pazienti affetti da immunodeficienza combinata severa (ADA-SCID). In seguito al successo di questi due trials, la terapia genica ha conosciuto una crescita esponenziale nel periodo compreso fra il 1988 ed il 1999, fino a quando si è verificato il primo serio evento avverso che ha causato la morte di un paziente giovane, determinando una stabilizzazione nell'approvazione degli studi.

Nota: Nel corso degli anni '80 sono state eseguite le prime sperimentazioni non regolamentate da parte di un medico americano su pazienti affetti da talassemia, che hanno determinato il blocco della possibilità di sperimentazioni cliniche per alcuni anni in quanto non esistevano ancora dei presupposti sperimentali solidi.

Le malattie ereditarie monogeniche sono molto eterogenee, rare e necessitano di studi multicentrici e multinazionali per assicurare un numero sufficiente di pazienti.

Nota: Gli studi di terapia genica sono molto costosi, quindi le case farmaceutiche tendono ad investire nella ricerca sul cancro, che permette un grosso ritorno economico, mentre le charity come Telethon, formate da genitori e parenti di malati, tendono ad occuparsi delle patologie monogeniche.

Il database Wiley contiene un numero elevato di trials di terapia genica anche se alcune informazioni possono non essere indicate in quanto si tratta di un censimento volontario.

Nota: Per effettuare un trial clinico di terapia genica è necessario dimostrare la non nocività dell'intervento tramite un dossier sulla sperimentazione preclinica condotta in qualche modello animale che metta in luce anche gli eventuali effetti collaterali del trattamento.

Classificazione degli approcci terapeutici

• Strategie sostitutive di farmaci da somministrare in maniera continuativa al paziente che possono essere risolte attraverso un trapianto di organo oppure tramite una trasduzione transiente o stabile del gene deficitario.
• Strategie ablative che prevedono l'eliminazione chirurgica o farmacologica della causa di una patologia che possono essere affiancate da una terapia genica ablativa mediante l'utilizzo di RNA antisenso, ribozimi e RNA di interferenza.
• Strategie immunologiche profilattiche che rendono l'individuo reattivo contro uno specifico agente patogeno (come i vaccini) e terapeutiche (come il trasferimento adottivo di cellule immunitarie attivate o la somministrazione di anticorpi monoclonali) che possono essere affiancate da una terapia basata sui linfociti ingegnerizzati.

Transgene e trasduzione

Il transgene (transferred gene) è il gene terapeutico di interesse che è trasferito nel paziente. Con il termine trasduzione si intende il trasferimento di un gene effettuato con un mezzo qualsiasi che può essere declinato dai puristi in trasfezione quando il trasferimento è eseguito con metodi non virali ed infezione quando è effettuato con metodi virali (i vettori virali trasferiscono il transgene con un unico meccanismo non replicabile di infezione).

La trasduzione stabile si verifica quando il vettore si integra nel genoma della cellula ricevente in modo che possa essere ereditato, ma è presente un rischio intrinseco di mutagenesi inserzionale. La trasduzione transiente si verifica quando il vettore non si integra nel genoma della cellula ospite e la sua efficacia dipende dalla capacità della cellula trasdotta; infatti, le cellule in attiva proliferazione tendono a diluire progressivamente la concentrazione del transgene con l’aumentare del numero delle replicazioni.

Ad esempio, l'epitelio retinico è un tessuto in silenzio mitotico e rappresenta un sito privilegiato dal punto di vista immunologico in quanto, in condizioni fisiologiche, sono assenti fenomeni di replicazione, infiammazione ed angiogenesi, quindi i vettori non integranti possono avere una certa durata all'interno delle cellule. Inoltre, i vettori non integranti possono essere utilizzati negli studi di genomica funzionale per capire quale sia la funzione di un gene clonato in una cellula che non lo esprime fisiologicamente.

L'efficienza di trasduzione rappresenta la percentuale delle cellule trasdotte sul totale delle cellule esposte al vettore; tale grandezza è facilmente misurabile in vitro in quanto basta contare il numero di colonie presenti con il gene di interesse in seguito ad una specifica selezione, mentre in vivo è possibile utilizzare delle tecniche di imaging associate all'utilizzo della Green Fluorescent Protein.

Vettori nella terapia genica

I vettori possono trasportare uno o più transgeni all'interno di cassette di espressione provviste di un promotore e di una sequenza di poliadenilazione e sono, generalmente, associati ad uno o più geni di resistenza per permettere la selezione della popolazione trasdotta. I principali vettori che possono essere utilizzati nella terapia genica sono i vettori virali che sono ottenuti tramite la delezione dei geni di virulenza di alcune tipologie di virus quali i retrovirus, i lentivirus, gli adenovirus ed i virus adeno-associati (sono in fase di studio anche gli herpesvirus ed i poxvirus) ed i vettori non virali o plasmidi a DNA nudo che non presentano una struttura esterna di protezione come l’envelope ed il capside virali.

Nota: I vettori virali presentano un'efficienza maggiore rispetto ai vettori non virali grazie alla presenza del capside e dell’envelope che sono capaci di riconoscere dei recettori specifici sulle cellule dell'ospite e di effettuare un’endocitosi recettore-mediata.

I vettori adenovirali e retrovirali sono le metodiche maggiormente utilizzate negli studi di terapia genica dal 1988 (comprendono circa il 40% dei trials clinici), mentre le metodiche con DNA nudo rappresentano poco meno del 20% degli studi. È importante notare che l'utilizzo dei diversi vettori si è modificato nel tempo, infatti l'utilizzo dei vettori retrovirali è diminuito da una percentuale del 45% nel 1995 al 20% nel 2016 e l'utilizzo delle metodiche di DNA nudo si è contratto mentre è aumentato notevolmente l'utilizzo dei vettori adeno-associati. Inoltre, nel 2005 è stato introdotto l'utilizzo dei vettori lentivirali (il cui virus parentale è HIV) che stanno attualmente spiazzando i vettori retrovirali e negli ultimi anni stanno aumentando i trial clinici che utilizzano la tecnica di CRISPR-Cas9.

Le proprietà dei vettori

La somministrazione del vettore può avvenire direttamente in vivo secondo diverse modalità oppure in vitro in cellule derivate dall’individuo (metodica detta anche ex vivo) in modo da ottenere delle cellule ingegnerizzate. Ogni vettore, sia che sia inoculato in vivo che in vitro, deve superare delle barriere a livello delle cellule per poter trasferire i geni di interesse, in particolare deve attraversare:

• Membrana plasmatica: che presenta degli specifici recettori che possono essere riconosciuti da alcune molecole presenti sull’envelope o sul capside dei vettori virali permettendo un’infezione ad alta efficienza secondo un meccanismo di endocitosi recettore-mediata che prevede la formazione di un’invaginazione e, conseguentemente, di un endosoma precoce che è caratterizzato da un pH di 6-5-7.5, all’interno del quale si verifica un accumulo di ioni H⁺ che favoriscono la fusione con i lisosomi permettendo la formazione di un endosoma tardivo caratterizzato da un pH di circa 5 che facilita la degradazione del contenuto endolisosomiale e l’inattivazione del recettore di membrana. Per quanto riguarda i vettori plasmidici, essi sono in grado di interagire con il TLR9 (Toll-Like Receptor) con una bassa efficienza grazie al riconoscimento delle sequenze di CpG non metilate presenti nel DNA plasmidico.
• Membrana dell’endosoma: in quanto il vettore deve uscire dall’endolisosoma per evitare la degradazione e per raggiungere il citoplasma della cellula ospite; per superare questa barriera sono state adottate strategie diverse, ad esempio gli adenovirus producono dei peptidi fusogenici oppure possono essere utilizzati dei lipidi fusogenici come la dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE) che subiscono una modifica conformazionale pH-sensibile per facilitare l’apertura dell’endosoma tramite un aumento della fluidità della membrana e dei polimeri complessati al DNA come la polietilenimina che funzionano come una spugna protonica capace di captare gli ioni H⁺ determinando un effetto tampone che riduce l’attivazione dei lisosomi e la degradazione del materiale contenuto al loro interno.
• Membrana nucleare: per permettere il raggiungimento del nucleo da parte del vettore (la membrana nucleare permette l’attraversamento per diffusione passiva solo a strutture di dimensioni inferiori a 10 nm o 30-60 kDa); le principali strategie per il superamento di questa barriera prevedono l’integrazione nel genoma in seguito al dissolvimento della barriera nucleare durante il processo di mitosi delle cellule (meccanismo attuato dai retrovirus) oppure la coniugazione del DNA plasmidico con peptidi dotati di segnali di localizzazione nucleare che sono delle sequenze di 5-20 amminoacidi capaci di legare il sistema di importazione nucleare, formato dalle α-importine e dalle β-importine, per facilitarne il passaggio attraverso la membrana anche in condizioni di quiescenza replicativa.

Alcune proteine che contengono le sequenze per l’importazione nucleare sono gli istoni, la proteina large T prodotta dal virus SV40 che contiene la sequenza KKKRK e il fattore trascrizionale NF-kB.

Si stima che il 50% del DNA nudo all’interno del citoplasma sia eliminato entro 1-4 ore.

Somministrazione in vivo e ex vivo

Per quanto riguarda la somministrazione in vivo, è necessario tenere in conto il fatto che l’efficienza di trasduzione è influenzata non solo dalle barriere cellulari, ma anche dalle barriere tissutali rappresentate principalmente dall’endotelio, dal tessuto connettivo e dalla barriera ematoencefalica, dalle barriere sieriche a causa della presenza di enzimi ad attività proteasica e nucleasica e del complemento (ad esempio il frammento C1 lega i vettori retrovirali inattivandoli), dalle barriere immunitarie nel caso in cui esista un’immunità preesistente nei confronti del vettore e dall’effetto di diluizione della concentrazione del vettore sia nel circolo ematico sia nelle cellule; un possibile accorgimento per permettere di aumentare l’efficienza della trasduzione è la strategia di targeting che permette di guidare il vettore verso uno specifico tipo cellulare.

Le principali vie di somministrazione in vivo sono la via sistemica intravenosa che permette al vettore di giungere in tutto l’organismo (spesso hanno una bassa efficienza a causa della degradazione del vettore per via enzimatica o immunologica) e la via locale che può essere diversa a seconda dei casi, infatti può essere intratumorale, cutanea, sottocutanea, intramuscolare, interna all’albero respiratorio, per os ed intraoculare; questa tecnica di somministrazione è utile per i vaccini genetici che permettono di produrre localmente una proteina che verrà presentata al sistema immunitario o che verrà diffusa nel circolo ematico.

Nota: Sono stati condotti dei trial clinici in pazienti affetti da anemia per poter permettere la trasduzione del gene dell’eritropoietina nel tessuto muscolare in modo che il suo prodotto genico potesse essere diffuso nel circolo ematico (rappresenta un’alternativa alla somministrazione intramuscolare di eritropoietina ricombinante).

La somministrazione orale dei vettori non è molto efficace per la presenza degli enzimi del tratto gastrointestinale anche se sono stati condotti degli studi per permettere la veicolazione dei vettori all’interno di un ceppo di Salmonella non patogeno.

Per quanto riguarda la somministrazione ex vivo, è importante che le cellule riceventi siano mantenute in vitro per il tempo necessario alla trasduzione e ad un’eventuale selezione successiva. In particolare, le principali sorgenti di cellule sono i linfociti del sangue periferico, le cellule staminali del midollo osseo che sono utilizzate per correggere le patologie ereditarie dei linfociti, le cellule dell’epitelio respiratorio, le cellule muscolari e le cellule tumorali. Le cellule utilizzate nella terapia genica possono essere autologhe (derivanti dallo stesso individuo in cui sono infuse per creare delle terapie su misura definite "tailored therapies"), singeniche (prelevate da un gemello con completa omologia genetica), allogeniche (derivanti da un individuo della stessa specie con un sistema di istocompatibilità diverso da quello del paziente) oppure xenogeniche (derivanti da una specie diversa da quella umana).

In alcuni casi, il mantenimento delle cellule in vitro può essere problematico; ad esempio, le cellule staminali hanno una scarsa capacità di proliferazione ed una scarsa durata in vitro e le cellule tumorali presentano una scarsa capacità di adattamento e sono difficilmente riconoscibili in vitro in quanto ogni tumore presenta una quota parte di cellule normali.

Nota: Le cellule xenogeniche trasdotte possono essere microincapsulate per confinarle sotto la cute del ricevente in modo da permettere il rilascio del fattore diffusibile prodotto ma non delle cellule, evitando l’attivazione del sistema immunitario.

I vettori virali sono caratterizzati da un’elevata efficienza di trasduzione anche se sono associati a difficoltà nella produzione, nella distribuzione e nella sicurezza (ad esempio, sono termolabili e necessitano della catena del freddo), mentre i vettori non virali sono caratterizzati da un’elevata sicurezza, da una maggiore facilità di produzione e di distribuzione (non necessitano di particolari attenzioni per la conservazione) ma presentano una scarsa efficienza di trasduzione.