Tecnologie ricombinanti

STUDIARE LA STRUTTURA DEL GENOMA A CUI IL GENE APPARTIENE

Negli eucarioti esistono diversi livelli di controllo regolabile dell'espressione genica:

• Controllo trascrizionale: consiste nell'attivazione o repressione della trascrizione del gene in RNA.
• Controllo post-trascrizionale: consiste nella modificazione dell'RNA, in modo che esso diventi idoneo ad essere tradotto. Nello specifico, le modificazioni che si verificano sono lo splicing, per la rimozione degli introni, e la modificazione delle estremità del trascritto, ovvero l'aggiunta della coda di poli A all'estremità 3' e l'aggiunta del CAP all'estremità 5'.
• Controllo del trasferimento dell'RNA prodotto e modificato dal nucleo al citosol.
• Controllo pre-traduzionale: consiste nella degradazione di eventuali RNA che non devono essere tradotti.
• Controllo traduzionale.
• Controllo post-traduzionale: consiste nella modificazione delle proteine prodotte per far sì che esse diano origine ad un prodotto biologicamente attivo.

e nel rilascio di altre proteine nella propria forma nativa, cioè tali proteine non vengono modificate e pertanto sono inattive, quindi saranno degradate.

Identificazione di una sequenza di regolazione

Una sequenza di regolazione è una regione di DNA in grado di regolare l'espressione di un gene (attivarla o reprimerla) grazie al legame con una proteina regolatrice. Tale sequenza è posta a monte del gene che controlla. Se si identifica il punto in cui la proteina lega il DNA è possibile individuare la sequenza di regolazione. Questa indagine può essere effettuata utilizzando il metodo del footprinting o il metodo della gel retardation (rallentamento su gel).

Gel retardation

La gel retardation è una elettroforesi su gel che consente di separare le molecole di DNA nudo dalla molecola di DNA legata alla proteina regolatrice. I passaggi di tale tecnica sono:

1. La regione di DNA a monte del gene viene digerita da una endonucleasi di restrizione ed i...

frammenti ottenuti vengonoposti in presenza della proteina regolatrice.- La proteina regolatrice si lega solo al frammento checontiene la sequenza di regolazione del gene, mentre tutti glialtri frammenti rimangono come DNA nudo.- I frammenti ottenuti vengono sottoposti a gel elettroforesi edurante la corsa il frammento legatoalla proteina regolatrice migra più lentamente rispetto ai frammenti liberi, in quanto la proteina ne provoca un aumento del peso molecolare, per cui al termine della corsarisulta separato dagli altri frammenti.

Studio della funzione di una sequenza di regolazioneLe tecniche di gel retardation e di footprinting ci consentono di identificare la presenza di possibilisequenze di regolazione a monte di un gene, ma non forniscono informazioni sulla funzione diqueste sequenze. Per questo è stata messa a punto l'analisi di delezione. Questa tecnica si basa sulpresupposto che effettuando una delezione a livello di una sequenza di regolazione, si

distinguere l'espressione del gene clonato, sotto il controllo della sequenza di regolazione deleta, dall'espressione del gene già presente nell'organismo, sotto il controllo di una sequenza di regolazione intatta. Per risolvere questo problema vengono utilizzati i geni reporter, i quali vengono legati alla sequenza di regolazione deleta a monte del gene clonato, rimpiazzando tale gene. Il vantaggio nell'utilizzo dei geni reporter è che essi sono in grado di conferire alla cellula ospite un fenotipo riconoscibile, precedentemente assente nella cellula (come ad esempio una colorazione), e quantificabile, cioè è possibile misurare il livello di espressione del gene reporter (ad esempio misurare l'intensità della colorazione).

Tra i geni reporter più utilizzati abbiamo:

• Gene lacZ: proviene da E.Coli ovvero un enzima in grado di rompere legami β-1,4-glicosidici. Per cui utilizzando un

substrato con tali legami’espressione del gene reporter lacZ può essere rilevata tramite un test istochimico, basato sulla presenza o assenza di colorazione sulle colonie formate dalle cellule ospiti (che possono essere sia procariotiche che eucariotiche).

- Gene cat: proviene da E.Coli e produce la cloroamfenicolo acetiltransferasi, in grado di conferire resistenza al cloroamfenicolo. Quindi tramite un terreno contenente cloroamfenicolo è possibile rilevare l’espressione fenotipica del gene reporter e quantificare tale espressione in base alla quantità di cloroamfenicolo da somministrare per inibire la crescita cellulare.

- Gene lux: proviene dalle lucciole e produce la luciferasi, in grado di conferire bioluminescenza, quindi una caratteristica rilevabile fenotipicamente con strumenti adeguati.

- Gene dhfr: proviene da E.Coli e produce la diidrofolato reduttasi, ovvero un enzima che conferisce resistenza al metotrexato, un farmaco in grado di inibire la proliferazione cellulare.

Gene GFP: proviene da una medusa e produce la proteina fluorescente verde, in grado di conferire alla cellula ospite fluorescenza, una caratteristica fenotipica rilevabile con un misuratore di fluorescenza. Modificando la sequenza amminoacidica del sito attivo della proteina fluorescente verde e rilevando la sequenza nucleotidica complementare, sono state prodotte diverse forme del gene GFP, in grado di conferire differenti colorazioni.

Gene uidA: proviene da E.Coli e produce la glucoronidasi, in grado di scindere un gruppo di acidi β-D-glucuronici, conferendo una colorazione alla cellula ospite. Per cui ponendo nel terreno di crescita delle cellule ospiti un substrato incolore come l'acido-5-bromo-4-cloro-3-indolil β-glucuronico, solo le cellule contenenti il gene reporter, scindendo questo composto, acquisiranno una colorazione azzurrina.

presenza di un fluorimetro sarà anche possibile quantificare il livello di espressione del gene reporter, utilizzando però un altro substrato. In presenza del gene reporter uidA le cellule ospiti principalmente utilizzate sono cellule vegetali.

I geni reporter possono anche essere utilizzati per studiare l'espressione di specifiche sequenze collocate in vari distretti degli organismi transgenici. Infine possono essere utilizzati anche per produrre le proteine di fusione, costituite dalla porzione proteica che vogliamo studiare attaccata alla proteina codificata dal gene reporter. Grazie alle proteine di fusione è stato possibile monitorare il percorso che una proteina fa nella cellula e quindi è stato possibile capire quali sono le modificazioni post-traduzionali a cui vanno incontro le proteine e qual è il destino delle proteine.

Come effettuare la delezione: supponiamo di partire dalla sequenza a monte di un gene e di voler individuare le

sequenza controllo, per vedere l'effetto che questa delezione ha sul gene reporter. Quindi effettuando questo procedimento di volta in volta per le varie sequenze controllo rilevate si effettua una dissezione di tutta la porzione amonte del gene. In alcuni casi le sequenze controllo possono essere vicinissime tra loro o addirittura sovrapposte, per cui eliminando una sequenza controllo è possibile rimuovere anche l'altra. In questi casi piuttosto che la delezione si preferisce utilizzare la tecnica della mutagenesi sito che consiste nell'introdurre nella sequenza che vogliamo analizzare una mutazione. Per specifica, cui se la sequenza ora mutata determina un'espressione alterata del gene che regola, sapremo che essa è una sequenza controllo. La tecnica della mutagenesi sito specifica è molto efficace in quanto, essendo le sequenze controllo delle sequenze consenso, quindi uguali almeno nell'80 % degli una mutazione a livello anche di uno solo