Mappe Appunti Tecnologie ricombinanti

dentro genoteche cercare frammento

individuare clone specifico particolari sonde

DNA circolare vettore plasmidico

chiuso vettore inserzione

aperto

tanti individui replicarsi ospite

ogni 20 min E.Coli introduzione

colonie batteriche in cellula vivente

tappe principali

trasformazione serve per inserimento vettore

selezione ospiti frammento DNA replicarsi

molecola ricomb. originaria essere espresso

amplificazione

manipolazioni analisi molecola DNA

clonaggio origine naturale

molecolare vettore

da RNA messaggeri frammenti modificata funzionalità specifiche

DNA doppio filamento retrotrascrizione mRNA con frammento DNA esogeno

ricombinante

da retrotrascrizione cDNA cuciti insieme molecola chimerica

clonazione genoteca cDNA

dentro vettore

inserimento in ospite genoteca genomica

provenienza frammenti

trascritta in RNA genoteca cDNA

determinato momento parte espressa

determinate condizioni

DNA genomico frammenti

isolati da organismo

isolare DNA genomico

frammentazione

messo in vettore a DNA clonazione genoteca genomica

E.Coli inserimento in ospite

dentro i batteri collezione frammenti

genoma originale

framm. interesse cercare dentro collezione

eucariote crescita

genetica ben nota terreni poco costosi

non patogeno caratteristiche DNA esogeno

prolifera lievito stabilità

proteine mammiferi replicazione clone colonie indipendenti

proteasi attive svantaggi

manipolazione difficile semplicità prima trattati

analisi elementi regolativi applicazioni specifiche breve tempo

ospiti vantaggi

varia origine tanto DNA esogeno accumulo plasmidi

sistemi x modificazioni grande vantaggio espressione

espressione proteine frammenti codificanti

tempi lunghi difficili produrre produzione

eucarioti procarioti (batteri)

no espressione alta non folding corretto

no clonaggio base applicazioni avanzate origine eucariotica no modifiche p.t.

cellule costose proteine tossiche x batterio

svantaggi contaminazione

non enzimi

1 copia

batterico DNA circolare doppio filam.

grande

più copie genoma

doppio filam. DNA circolare plasmidico

extracromosomiale replicaz.

enzimi ospite piccoli

enzimi diversi tanti siti sequenza DNA carta di identità DNA mappe di restrizione tagliare DNA

malattie emoglobina mutazione siti restrizione ruolo sequenze specifiche

riconoscere DNA dominio riconoscimento

1 u: 1ug DNA

7-8,5 pH

mai cambio in E. Coli

37° temperatura DNA esogeno

parametri frammentato

scoperta

tempo frammentazione difesa

concentraz. utilizzo

calore metilasi

sistema restrizione e

EDTA taglio

arresto modificazione

precipitaz. sali metilazione porzioni DNA batterio no taglio

estraz. proteine

condiz. non ottimali 5'P

ruolo taglio ponte fosfodiesterico

framm non netti effetto star 3'OH

siti simili genere

nomenclatura specie

richiude ceppo

origine virale DNA ligasi

ATP dipendente enzimi di restrizione non sequenze riconosciute

sfalzate 37 ° I taglio riconoscimento sequenze specifiche

piatte 4-16° da 100 a 1000 bp a valle

unione DNA diversi sequenze specifiche

III

no complementarietà difficili taglio specifico da 25 a 27 bp al di fuori

3 tipi

molecole chimeriche

no riformaz. stesso sito restriz piatte sempre più usate

palindromia riconoscimento sequenze specifiche

estremità compatibili

facili sequenza riconosciuta

II taglio specifico

riformare stesso sito di restriz sfalzate complementari sequenze palindromiche

no palindromia metilasi

enzimi diversi endonucleasi

sequenze diverse isocaudameri

protrudring stesse estremità 5' protrudente

sfalzate 3' protrudente

estremità

se non metilata stesso punto nette asse di simmetria

isoschizomeri

stessa sequenza

se metilata punti diversi unico sito restrizione

cosa ho dentro? plasmide ricombinante vettore estremità compatibili

domanda esame inserto

enzimi restriz. due orientamenti

caratterizzazione plasmide risposta

sequenziamento clonaggio non ligasi richiudere estremità

direzionale self ligation

identiche fosfatasi alcalina defosforilare 5' vettore

più difficile estremità

temperature basse nette inibizione fosfatasi alcalina

inserimento frammento

concentraz. enzima 5' fosforilato frammento ligasi

sfalzate

vettore enzimi diversi estremità diverse

digestione

plasmide si richiude frammentino clonaggio

etidio bromuro direzionale

banda vettore gel agarosio diverse

tagliare elettroforesi estremità

2 bande protrudring/nette

sciogliere cubetto gel entrambe 5' protruding non compatibili

tampone

gel soluzione

DNA purificazione

legame DNA biglie/ colonnina

lavaggio

eluizione

conferma processo elettroforesi

vettore 1 banda

nucleotidi 3'OH

NO stampo terminal transferasi

3' protruding obiettivo estremità compatibili

dGTP vettore

dCTP frammento riempimento

5' protrudring

brevi tratti complementarierà strategia di

adattatori fill in DNA pol I E.Coli

EcoRI klenow

5' protruding clonaggio attività 5'-3' polimerasica

BamH1 risultato estremità piatte

primers DNA sintetico rimozione

enzima di restrizione sito di riconoscimento 3' protruding

frammento trimming

linker esonucleasi DNA pol fago T4

ligasi appaiamento risultato estremità piatte

estremità blunt

enzima di restrizione sito di taglio

5' protruding separare

pettine ruolo isolare

gel caratterizzare

vassoio

polimerizzazione componenti ddp

alimentatore campo elettrico migrazione

coperchio

recipiente setaccio molecolare dimensioni

tampone agarosio

tipo

dimensioni frammenti poliacrillamide

gel

curva di taratura

distanza migrazione asse x TAE

più comuni

dimensioni DNA asse Y TBE

pH costante

standard PM tampone di scorrimento (salino) forza ionica

marker

dimensioni frammenti confronto EDTA chela ioni divalenti

elettroforesi su gel scioglie agarosio

vedere bande intercalante Etidio bromuro

transilluminatore raggi UV alga rossa

nel tampone di scorrimento con agarosio agarosio dimensioni

concentraz. 0,7/2%

DNA solito in lab 1%

appesantire DNA glicerolo pozzetti

alla luce naturale seguire migrazione agarosio gel

stoppare migrazione necessità tecnica tampone di caricamento nastro adesivo estremità

inserimento DNA nel pozzetto vaschette scorrimento tampone salino di scorrimento

xilene cianolo colorante no in fondo

pettine

blu di bromofenolo pozzetti

migraz. indipendente da DNA piccole molecole naturali doppia elica

facili isolare

MCS dentro laz' in E.coli trasformazione

pUC18

sub beta galattosidasi in eucarioti trasfezione

esempi plasmidi vettori

molto usato in lab caratteristiche cicli di replicaz.

pBluescript

da pUC18 origine di replicaz. numerose copie

replicano autonomamente

integrità vettore solo uno x enzima 1+ geni resistenza antibiotici

ori no regioni cisregolative manipolazione vettori

localizzaz. particolare

amp no geni essenziali

enzima conveniente pro siti di restrizione unici

siti di restriz. unici

molteplici

più inserti elementi essenziali marcatore selezionabile

contro

clonaggi in frame ori

casi particolari dentro geni funzionali polylinker antibiotici betalattamasi idrolisi anello betalattamico

identificaz. plasmidi ricombinanti Plasmidi marcatori selezionabili geni che da resistenza all'amp

T7

SP6 per la replicaz. + copie vettore

promotori pol. di origine fagica estremità

x trascrizione in vitro 1 copia

x primer universali ori a controllo stringente grandi dimensioni

processo coordinato

maneggevoli numero copie

origine di replicazione piccole dimensioni

varie tecniche transformazione facile introdurli preferenze

vettori piccoli ori a controllo rilassato + copie

denaturazione metodi facile estrarli processo indipendente

rinaturazione limitata in pochi batteri

controlla largo spettro vasta gamma

specificità ospite shuttle 2 ori plasmidi diversi

competizione stessa ori

compatibilità altri plasmidi

22 minuti

tempo 37°

nutrienti luria

LB bertani

batteri + plasmide ricombinante agar 1,5%

solido

alfa-complementaz. colonie

seconda selezione

con enzimi di restriz. terreno beute

E. Coli

colony hybridization liquido 37°

colony PCR agitazione 121°

ricombinante sterili autoclave 20 min

non ricombinante presenza vettore antibiotici

amp marcatore selezione 4° 1 sett

1/1000 ha incluso prima selezione

antibiotico stoccaggio glicerolo 20%

crescita a confluenza lb agar -amp congelare -20° 1 anno

con gene amp -80° per sempre

ricombinante batteri con vettore lb agar +amp

non ricombinante incubazione CaCl2 ghiacciato

batteri competenti congelato -80°

Trasformazione

batteri + plasmidi

duplicazione LB agar ioni divalenti

stesso DNA cloni indipendenti elettroporazione

colonie corrente campo elettrico

miscela

se stesso x n volte replicaz. batterio pori transienti

con e senza amp vettore non ricombinante

solo senza amp inserto ioni divalenti

combinazioni

con e senza amp vettore + inserto (ricomb.) schermare cariche

calcio cloruro

solo senza amp niente