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scegliere isol. qualunque framm gene intronialmeno 1 copia genomica rappresentativitàespressione in quel tessuto varia cDNA frammenti cDNA vettoriRNA messaggeri determinato momentoespressicDNA condizione specificaquando scegliere isol. cDNA codificantiparte espressa genomacDNA complementare RNA doppio filamentofattore di trascrizione cDNA ricerca cellulelisareaffinità DNA saleimmunizzazione estrazione RNA kit separare acidi nucleicipeptidi importanzaanticorpi DNAsifarmacosintetizzate eluizione mRNA stampoproteinebatteri lunghi 2-3 kbisolare RNA messaggerimolto velocemente resinaeterologhe colonninegenoteca cDNAgrandi quantità membranada cDNA oligo dT complementare coda poliAtempi brevicorretto folding no modifiche p.t. RT-PCRprimer oligo dTfino a 10kb plasmidici vettore 1 filamento antisensofagici clonaggiosonde marcate polimerasistamposcreening indietro 3'OHanticorpi 2 filamentoHairpin loop nucleasi s1secondo filamentoaltro caso coda poliCretrotrascrizione

RNA poliadenilati terminal transferasi stretch nucleotidi 3' primer oligodGprimer gene specifico ibridaz. reg. 3'OHclonazione spec. cDNA sequenza nota in parte solo particolare mRNARNAsi H rimoz. RNAscegliere tanti frammenti RNA strutture secondarietutti stesso vettore clonazione condizioni reazioneE. coli trasformazione non sempre funziona RNA lunghi cDNA non completibatteri con stesso cDNA piccola colonia vettore plasmidico primer oligo dtscreening piastrare su Agar primer randomreverse trascrittasigene specifico obiettivo genoteca campione specifico reaz. stacca primaRNA poliadenilati precursori globuli rossi caso 1 primer oligodT no ibridaz. tutto filamentooligo dT primer incompleti al 5'reverse trascrittasi cDNA incompleti esanucleotidi complementarinucleasi s1 hairpin loop necessario caso 2 random priming punti casualiklenow secondo filamento cDNA cloning incompleti al 5'/3'RNAsialcuni più rappresentati cDNA tutti diversi 1) reverse

trascrittasicosa è 2) PCRisolare cDNAcDNA incompletimRNA rarigel utilità tessutonon solo 2 bande specifico mRNA tipo cellulareembrionequantizzare molecole+ rappresentato RT-PCR oligo-dTRNA ribosomiale RNA poliadenilato ibridazionemarker M coda poliAcontrollo negativo reverse trascrittasi copia cDNA first strand 3'reverse trascrittasi indietro 3'OHNO amplicone solo PCR RT- elettroforesi primer di GNO RT stretch di Ccome funziona secondo filamentobanda singola 3'OHGAGcDNA perf. 5'primer diversi sequenza conosiuta primer gene specificoframmenti piccoli ibridazione specificaEZretrotrascr. non bene primer specificoPCR amplificazione Taq polimerasitermociclatoregenoteca cDNA isolato cDNA spec. non completorecupero porzioni RT-PCRporz. 5' non notaRACE porz. 3' notaibridazione primer porz. nota più vicino a porz non notaporz. 5' nota 1 retrotrascrizione 1 filamentoporz. 3' non nota 2 filamento1 filamento complement. coda poliA

primer T terminaltransferasisequenza di C

primer specifico 2 retrotrascrizione filamento 1 rt2 filamentopiù vicino a porz non nota polimerasi complementare

PCR 3' RACE sequenza di G filam sconosciuto

5' RACE polimerasiamplif. cDNA ottenuto

PCR stessi primer cDNA completo sequenziamprimer diversi

inserti grandi batteriofago lambda virionireplicazione lisi liberazione particelle fagicheliticobatteriofagi danni raggi UVdue stili di vita con DNA battericolisogeno replicazione integrazionelimpide via liticaplacche di lisi opache lisogeniabraccio destrobraccio sinistro charon 16alfa-ricombinazionesito EcoRIframmento interrotto lacZ'frammento si placche bianchelacZ' interrotto XGal temperato entrambi i ciclino frammento placche blu lineareDNA lineare testa DNAconcatameri doppio filamentotratti multipli packaging batteriofago struttura ancoraggio estremità stickyliberazione spazio taglio concatameri enzimi testa siti cos lambda coda iniezione DNA

circolaredimensioni - lambda modificati 40 genisiti restrizione rimossi braccio sinistro proteine testac1 dentro repressore 1 sito di restrizione genoma non essenzialefino a 14 kb 3 gruppi parte centrale rimossa vettorigenoteche cDNA inserzione braccio destro geni ciclo liticorepressore non funzionainizio lisi conferma vettoriplacche limpidetanto DNA rimozionetra 2 siti di taglio frammento stufferDNA estraneo rimosso x clonaggio fino a 22 kbplacche blu sostituzionestuffer sìno frammento presenza placche buon fineplacche bianche stuffer nosì frammento intero DNA genoteche genomichemembrana nylon trasferimento DNAsondaDNA cDNA codificante x proteina specif.denaturazione ricerca clonimembrana su foglietto NaOH pH selezione batteri frammento specificodenaturaz. con sale pH valori norm. colony hybridizationSDS lisiDNA/RNA marcato screeningsondaradioattivasoluzione ibridaz. ibridazionesacchettinosali opzionistuzzicadenti toccare coloniein nuova membrana colonie con DNA

bersaglio pallini neriposizione colonia guardare piastra madre NO grandi dimensioni genoteche cDNA

digestione con EcoRI pronto x clonazionecompatibilitàvettore di inserzione agg. sito di restrizionetesta tanti cDNA linkerproteine particelle fagiche frammenti di DNA estremità bluntcoda packaging in vitroinfezione batteri no taglioplacche piastra metilasi EcoRI metilazione frammento no linker riempimentoeliminazione frammento stufferpurificazione DNAclonaz. taglio gel mantenimento vettoreunica banda DNA non digerito destro e sinistrosmir DNA digerito casetteinserzione frammentopurificazione bracciaquantità enzima mantenimento vettoreparametri variabili controllo2-3 h ideale continuadigestione parziale DNAt incubazione cos-bd-fr-bs-cos15 kb frammenti utili concatamerivettori ditaglio gel sostituzione impacchettamento vettoriapposite colonie solubilizzazione frammenti utili packaging in vitro teste fagolavaggi membrana utilitàtutto il DNA ricostruz. frammenti

placca 1