Appunti Tecnologie Ricombinanti

Clonaggio

Clonare vuol dire creare copie identiche di una molecola, cellula o organismo. Il clonaggio invece è una tecnica che consiste nella separazione di uno specifico frammento di DNA dal suo cromosoma che verrà poi unito a un’altra molecola di DNA che servirà a veicolarlo in una cellula al fine di riprodurlo in numerose copie.

Cos'è il clonaggio genico

Consiste nel prendere un frammento di DNA di nostro interesse ed inserirlo in un vettore per produrre una chimera. Il vettore agisce da veicolo che trasporta il DNA in una cellula ospite e ne permette la replicazione all’interno di essa. Dopo un notevole numero di divisioni cellulari si produce una colonia o clone di cellule ospiti identiche e sulla piastra verranno individuati i cloni contenenti il frammento in vari modi. Una componente fondamentale del clonaggio è il vettore, che deve avere capacità di entrare e di riprodursi. I principali sono i plasmidi e i vettori virali.

Tecniche per manipolare il DNA

Dapprima bisogna preparare il DNA purificato e una cosa fondamentale è la possibilità di tagliarlo grazie a enzimi di restrizione. Poi si procede con l’analisi dimensionale dei frammenti, alla ligazione e alla individuazione del metodo più corretto per introdurre il frammento nelle cellule ospiti. Infine si procede all’identificazione delle cellule che contengono il frammento di nostro interesse.

Perché non sostituire il clonaggio con la PCR? Per la PCR bisogna conoscere gli inneschi per entrambe le estremità del gene da clonare. Inoltre, quest’ultimo deve essere di 5-40 Kpb, dimensione non sempre riscontrabile. Il clonaggio genico è fondamentale per diversi scopi: produzione di proteine umane, creazione di piante resistenti ad insetti o a stress ambientali, cura di malattie…

Plasmidi

Sono molecole circolari di DNA a doppio filamento. Hanno al loro interno uno o più geni che conferiscono caratteri utili al batterio e che eventualmente diano un fenotipo riconoscibile dall’operatore; hanno un’origine di replicazione propria, tranne nel caso degli episomi che si replicano integrandosi nel cromosoma batterico; variano per dimensioni e numero di copie, infatti nelle cellule batteriche ne troviamo di diverse caratteristiche.

Il plasmide si divide autonomamente rispetto al cromosoma, a meno che non sia troppo piccolo e quindi obbligato a usare il corredo enzimatico replicativo dell’ospite. Altri invece, come già detto, si comportano da episomi. Generalmente hanno dimensioni inferiori alle 10 Kpb.

Batteriofagi

Hanno una struttura semplice, caratterizzata da:

• Un genoma a DNA (raramente RNA), con un numero limitato di geni.
• Un capside proteico che riveste il DNA.

Li dividiamo in:

• Fagi testa-coda, che sono dotati di una testa icosaedrica che contiene il genoma e di una coda, ovvero una struttura cava, utilizzata per trasferire il genoma nell’ospite, dotata di fimbrie (zampe).
• Fagi filamentosi, che appaiono come lunghi filamenti dotati di un capside costituito da meno proteine rispetto al testa-coda.

Per riprodursi, iniettano la loro molecola di DNA a doppio filamento lineare all’interno del batterio. Il primo evento che accade all’interno dell’ospite è la circolarizzazione del DNA fagico, e da qui può avere due destini:

• Via lisogena: consiste nell’integrazione casuale del DNA fagico all’interno del cromosoma batterico e sua successiva replicazione insieme al cromosoma batterico stesso, risultando presente anche nella progenie. Dopodiché, a causa di una qualche agente causale (temperatura, UV, raggi X…), il DNA fagico si scinde dal cromosoma batterico e inizia il ciclo litico.
• Ciclo litico: una volta nella cellula, dal DNA fagico vengono sintetizzate le proteine utili a formare i nuovi virus; quindi si ha una rapida replicazione di λ e della sua introduzione in virus completi. Infine, si ha una sintesi di proteine litiche che porteranno alla lisi del batterio, col rilascio di una gran numero di virus nell’ambiente circostante.

Se tutto ciò accade in terreno liquido osserveremo che il brodo di coltura diventerà più limpido, mentre su terreno solido osserveremo delle placche di lisi, dandoci la possibilità di individuare quale colonia (o clone) è stato infettato dal virus.

Esercitazione: estrazione DNA

Noi dobbiamo essere in grado di ottenere preparazioni pure di almeno 3 differenti tipo di DNA: DNA cromosomale da cellule (spesso la fonte dei geni da clonare), DNA plasmidico, DNA fagico.

Estrazione DNA batterico

Consiste principalmente in 4 fasi:

• Crescita e raccolta della coltura batterica.
• Rottura delle cellule e liberazione del loro contenuto.
• Rimozione delle componenti che non siano DNA.
• Concentrazione della soluzione di DNA ottenuta.

Abbiamo 2 grandi tipi di terreni di coltura: i terreni definiti e i terreni non definiti. I primi vanno usati quando la cellula deve crescere in condizioni ben precise, fornendo inoltre minerali e glucosio; i secondi sono più generici, come il terreno di Luria-Bertani, all’interno del quale si è osservato che la replicazione batterica (E.coli) avviene ogni 20 min a 37°C. Il ritmo di crescita batterico segue un andamento ben preciso: all’inizio si osserva una lag phase, poiché le cellule osservabili sono troppo poche; poi c’è una crescita esponenziale fino al raggiungimento di una fase di plateau (equivalente a una concentrazione di 2-3*10⁹ cellule/ml), per poi decrescere nella death phase, poiché si esauriscono i substrati per la sopravvivenza.

Questa crescita può essere osservata registrando la D.O. a 600 nm, lunghezza d’onda alla quale 1 unità di D.O. corrisponde a 90,8*10⁶ cell/ml. Noi ci fermiamo a 0,4-0,5. Si prosegue poi con una centrifugazione a 8000 rpm per 10 min, recuperando il pellet e risospendendolo. Da 1 litro di a densità cellulare max si può ridurre il volume fino a 10 ml.

Il passo successivo consiste nella rottura della parete batterica con metodi chimici o fisici. Per E.Coli si usano generalmente metodi chimici, ovvero il lisozima con EDTA e SDS. Il lisozima rompe il legame β-1,4 fra NAG (N-acetilglucosammina) e NAM (acido N-acetilmuramico): questi due insieme formano il monomero del peptidoglicano che costituisce la parete. L’EDTA è un chelante per ioni bivalenti che stabilizzano le membrane e l’attività di enzimi come le nucleasi. Il Sodium Dodecil Solfato lega i lipidi e le proteine, alterandone la struttura. Quindi una centrifugazione farà depositare i detriti sul fondo, mentre DNA, RNA, proteine e carboidrati rimarranno nel sovranatante.

Si procede al trattamento con una soluzione di fenolo, cloroformio e alcol isoamilico, in rapporto 25 : 24 : 1. Il fenolo denatura le proteine facendole precipitare e fa da solvente per proteine ricche in AA aromatici; il cloroformio completa la denaturazione delle proteine, solubilizza i lipidi e, grazie alla sua elevata densità, facilita la separazione fra fase acquosa (contenente DNA deproteinizzato) e fase organica (fenolica), stabilizzando l’interfaccia fra le due fasi. L’alcol isoamilico riduce la schiuma che si forma durante l’estrazione, che potrebbe danneggiare il DNA, poiché questa soluzione è in continua agitazione per favorire il contatto fra le varie molecole.

Terminata l’agitazione, individueremo 3 fasi:

• Una fase acquosa superiore, contenente DNA ed RNA;
• Una fase intermedia, contenente le proteine denaturate;
• Una fase inferiore, contenente proteine solubili.

Se le proteine sono molte, bisogna ripetere l’operazione, anche si aumenta il rischio di rottura del DNA. Pertanto, si preferisce un trattamento con proteasi precedente al fenolo. Per quanto riguarda l’RNA, verrà rimosso con RNAsi.

Nel caso la soluzione sia troppo diluita, si fa una precipitazione con un volume doppio di etanolo, in presenza di cationi monovalenti come il sodio, a -20°C, formando il sale di sodio del DNA. Questo è insolubile in etanolo, pertanto precipita. Dal momento che si usa un volume doppio di etanolo assoluto, si procede a un lavaggio con etanolo al 70%.

Se la soluzione è abbastanza concentrata si può sfruttare la capacità del DNA di aderire al vetro, immergendo nella soluzione una pipetta Pasteur sigillata su fiamma. I frammenti piccoli di DNA rimarranno in soluzione, anche i ribonucleotidi derivanti dall’RNAsi. Per vedere se il DNA è puro si effettua una lettura a 260nm, lunghezza d’onda alla quale 1 D.O. corrisponde a 50μg/ml di dsDNA oppure a 40μg/ml di DNA o RNA. Misurando a 280nm e facendo un rapporto fra le due D.O. se è 1,8 il DNA è puro. L’assorbanza a 230nm invece rileva la presenza di carboidrati, fenoli e peptidi e il rapporto con quella a 260 in questo caso deve essere 2,2. Nel caso di oligonucleotidi a singolo filamento, come i primer per la PCR, avremo 20μg/ml.

Quando si ha a che fare con cellule vegetali si incorre in 2 problemi principali: la grande resistenza della parete vegetale e la contaminazione da carboidrati ad alto PM. Il primo problema si può risolvere o con metodi fisici, come l’uso di un mortaio o di ripetuti congelamenti e scongelamenti, oppure enzimi proteolitici come pronasi, una miscela di almeno 4 enzimi proteolitici che tagliano in punti diversi, o la proteinasi K, così chiamata perché in grado di degradare anche la cheratina e quindi in grado di lavorare sufficientemente bene anche in presenza di EDTA, che sequestra ioni Ca²⁺ e ne riduce l’attività a 80%. Il problema dei carboidrati ad alto PM è dato dal fatto che non vengono rimossi dal fenolo. Si usa quindi il CTAB, che lega gli acidi nucleici e forma composti insolubili che precipitano. Il CTAB viene in seguito rimosso con NaCl 1M, quindi si effettuerà una precipitazione con etanolo, si aggiungeranno RNAsi e si otterrà DNA puro.

Un altro metodo sfrutta le resine a scambio ionico: una superficie cationica farà aderire il DNA e farà “scivolare” il resto e trattando in seguito con una soluzione anionica il DNA verrà “scacciato” e potrà essere recuperato.

Estrazione DNA plasmidico

Sono più o meno gli stessi passaggi per estrarre DNA totale, ma noi non vogliamo contaminazioni da parte del DNA cromosomale. Quindi sfruttiamo le diverse caratteristiche fisiche che ha il DNA plasmidico rispetto al DNA cromosomale, ovvero: dimensione e conformazione. Seppur entrambi circolari, il cromosoma si rompe facilmente in un segmento lineare. Oltretutto questo è attaccato alla parete, quindi se rompiamo delicatamente la parete otteniamo uno sferoplasto con il cromosoma che rimane adeso ai frammenti di parete; con un detergente laviamo poi la membrana, quindi centrifughiamo e otterremo il plasmide nel sovranatante. Tuttavia, rimarrà sicuramente una contaminazione che potrà essere rimossa sfruttando le differenze conformazionali fra i 2 DNA.

Il DNA plasmidico può assumere 3 conformazioni:

• Una forma supercoiled se entrambi i frammenti sono intatti.
• Una forma a circolo aperto se è presente una interruzione su uno dei 2 filamenti.
• Una forma lineare se entrambi presentano un'interruzione.

Queste 3 forme presentano velocità elettroforetiche diverse (decrescente): supercoiled, lineare, circolo aperto. Un altro metodo al quale si può ricorrere è l'innalzamento del pH a circa 12-12.5, valori in cui si deforma la forma lineare mentre la supercoiled rimane integra. Se poi abbasso nuovamente il pH i frammenti lineari si appaieranno in modo casuale e disordinato, quindi con una centrifugazione sarà facile ottenere il plasmide nel sovranatante.

Infine, si può usare una separazione in gradiente di CsCl: le proteine andranno in cima mentre gli acidi nucleici sul fondo. Se usiamo EtBr, questo si intercalerà più difficilmente nel supercoiled rispetto a quella rilassata e in quest'ultima ne abbassa la densità più di quanto succede nella supercoiled. Quindi preleviamo il DNA con una siringa, estraiamo l'EtBr con il butanolo e otterremo il DNA in fase acquosa sul fondo. Infine, mettiamo la soluzione di DNA e CsCl in un sacchetto per dialisi per eliminare il sale, ripetendo l'operazione cambiando il tampone.

Un problema a monte di tutto è che il DNA plasmidico è molto meno presente rispetto a quello cromosomale. Per far sì che il primo sia più abbondante si può usare cloramfenicolo, un antibiotico che inibisce la replicazione del DNA cromosomale ma non inficia la replicazione di quello plasmidico, che potrà essere presente in 1000+ copie.

Estrazione DNA fagico fago lambda

Prendiamo un brodo di coltura, inoculiamo il virus e procediamo con una centrifugazione, ottenendo il virus nel sovranatante. Il passaggio cruciale è dato da come si allestisce la coltura. Il titolo max in condizioni ottimali che si può ottenere per il fago λ è 10¹⁰/ml, ma da 1 ml si potranno ottenere solo 500 ng di DNA. Servono quindi 1-2-3 litri di coltura: questo sembra semplice, ma serve in realtà una certa abilità nel sapere aumentare il volume e mantenere le giuste proporzioni fra fago e batterio. Questo perché se il numero di batteri è troppo basso il fago non avrà sufficienti batteri da uccidere mentre se il numero di fagi è troppo basso i batteri saranno sempre numericamente superiori e non verranno uccisi tutti; per questo la coltura deve essere della giusta densità.

In natura il fago è lisogeno quindi per incrementare il titolo la coltura deve essere “indotta”, ovvero bisogna scatenare il distacco del profago dal cromosoma, ma questo è un evento poco controllabile. Per questo i ceppi λ utilizzati in laboratorio portano una mutazione temperatura sensibile ts sul gene cI (c uno). Il gene cI è uno dei responsabili del mantenimento del fago nello stato integrato nel cromosoma batterico. La mutazione cIts rende cI funzionale a 30° ma non a 42°. Oppure si usano direttamente fagi λ con delezioni su cI che potranno compiere solo ciclo litico. Le cellule non lisate e i residui di quelle lisate si rimuovono per centrifugazione. Per ridurre il volume della sospensione fagica si aggiunge polietilenglicole (PEG), perché questo composto causa l'aggregazione delle particelle fagiche, facendole precipitare sul fondo a seguito di centrifugazione. Delle volte è sufficiente deproteinizzare il precipitato, altre volte si usa il gradiente di CsCl.

Estrazione DNA fagico fago M13

Il fago M13 è un fago filamentoso che ha un DNA circolare a singolo filamento, la cui forma replicativa è a doppio filamento circolare (cerchio rotante). Questo entra nel batterio attraverso il pilus e non ne causa la morte, ma un rallentamento di crescita, e mentre cresce il fago viene man mano estruso. Quindi su terreno non troveremo placche di lisi, ma placche torbide; quindi estraiamo la forma replicativa che è uguale a un DNA plasmidico. Ottenere il genoma di M13 nella forma a singolo filamento è più facile rispetto a λ perché con M13 è facile ottenere alto titolo fagico fino a 10¹² fagi/ml in una coltura ad alta densità. Inoltre, non avremo DNA batterico contaminante derivato dalla lisi, quindi sarà sufficiente proseguire con una centrifugazione, decontaminazione con PEG e NaCl, risospensione del pellet ed estrazione fenolica, seguita da un'ulteriore centrifugazione.

Plasmidi e virus

Ora analizziamo le caratteristiche principali delle due classi di vettori maggiormente usati: DNA plasmidico e DNA fagico.

Plasmidi

Distinguiamo plasmidi piccoli e plasmidi grandi. I primi, non avendo numerosi geni, devono sfruttare l'apparato replicativo dell'ospite mentre quelli grandi possono replicarsi in maniera autonoma. Le caratteristiche principale dei plasmidi sono due:

• Dimensioni: quella ottimale ai fini del clonaggio è di circa 10kb anche se sono stati usati plasmidi molto più grandi, come nel caso del plasmide Ti di Agrobacterium tumefaciens che è di circa 250kb. La maggior parte di essi comunque è utilizzata come vettore solo dopo opportune modifiche che li rendono adatti allo scopo.
• Numero di copie: è caratteristico di ogni plasmide e in quelli naturali varia da 1 a 50. È utile che un vettore sia presente in copie multiple poiché sarà più facile purificarlo e inoltre avremo un effetto dose.

I plasmidi di grandi dimensioni, presenti in 1 o poche copie, si replicano insieme al genoma batterico: in questo caso si dice che sono sottoposti a un controllo stringente. I plasmidi di piccole dimensioni invece sono indipendenti e possono essere presenti fino a 1000 copie: in questo caso si ha controllo rilassato. Il numero di copie dipende anche dal tipo di origine di replicazione perché si è visto che origini di replicazione diverse danno numero di copie diversi.

Come avviene il controllo del numero di copie? L'inizio di replicazione si può controllare regolando ad esempio la disponibilità di primer, la disponibilità delle proteine coinvolte nella replicazione o la loro funzionalità. I plasmidi inoltre possono essere coniugativi o non coniugativi e vengono trasferiti col meccanismo del cerchio rotante. A volte più tipi di plasmidi possono trovarsi nello stesso batterio (in E.coli ne sono stati trovati 7): in questo caso i plasmidi si dice che sono compatibili; in caso contrario uno dei due verrà perso durante la replicazione. Esistono diversi gruppi di...