Compendio di appunti di Tecnologie ricombinanti

STUDIO ESPRESSIONE E FUNZIONE DI UN GENE

Se si volesse fare uno studio della funzione e dell’espressione di un gene cosa si fa? Se si vuole studiare per

esempio la proteina derivante da un gene non parto dalla sequenza genomica, perchè ha dei problemi

legati alla presenza degli introni, e quindi le dimensioni del gene sono consistenti e non sempre facili da

clonare, ma si parte dall’mRNA che contiene gli esoni, ossia le sequenze codificanti che derivano dalla

sequenza iniziale. Quindi:

Prendo l’mRNA

• Lo isolo

• Lo trasformo in cDNA che viene poi clonato e sequenziato

•

Se invece volessi studiare la regolazione dell’espressione genica, quindi non sono interessato alla funzione

dle gene ma sono interessato a come il gene viene regolato da un punto di vista trascrizionale, prendo in

considerazione l’organismo di cui il gene fa parte. Se per esempio avessimo un organismo procariotico la

situazione sarebbe molto più semplice perchè il meccanismo di regolazione è quello degli operoni, mentre

per gli eucarioti la situazione è più complicata perchè l’espressione di un gene regolato da una regione che

si trova a monte del gene rappresentato dal promotore ha altre regioni che si trovano anche molto distanti

del gene stesso enhancer, silencer. Essi sono quindi regioni che vengono legate da uno o più fattori di

à

trascrizione, specifici o generici, che regolano l’espressione genica anche in momenti diversi della vita

cellulare. Bisogna quindi analizzare tale regioni, e un metodo tramite cui si può fare ciò è la tecnica EMSA

cioè l’analisi della mobilità elettroforetica del frammento di DNA. Essa

(Electroforetic Mobility Shift Assay),

si basa sul classico principio della corsa elettroforetica: le molecole più piccole si muovono più

velocemente, quelle più grandi più lentamente. Questo ovviamente vale per i frammenti di DNA che hanno

grandezza diversa, ma vale anche nel caso in cui lo stesso frammento di DNA è legato o meno al fattore di

trascrizione o a una proteina in generale. Nel caso in cui si ha un frammento a cui normalmente si lega il

fattore di trascrizione, ma esso ora non si lega, avrà una certa velocità sarà più leggero.

à

Se per esempio volessi vedere se p53 lega una regione a monte di p21, ciò che posso fare è frammentare la

sequenza a monte del genere di interesse. Questi frammenti verranno messi in presenza di p53 p53

à

potrebbe legarsi ad uno di questi frammenti. A questo punto si fa una corsa elettroforetica in assenza e in

presenza di p53 mi aspetto che quando si ha p53, la corsa del frammento verrà rallentata, quindi si potrà

à

concludere che p53 lega la regione a monte di p21 ma lega anche un altro frammento. Tale frammento

potrà poi essere recuperato dal gel ed essere sequenziato ho determinato la sequenza che lega p53.

à

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FOOTPRINTING

Il concetto di interazione tra DNA e proteina può essere anche usato per andare ad individuare la sequenza

di DNA legata ad una proteina X come si fa? Si sfrutta il fatto che se aggiungo alla miscela in cui si ha il

à

DNA con la proteina, la quale può legare una sequenza, la DNasi I, essa taglierà il DNA. se il DNA è legato ad

una proteina, tale frammento verrà protetto questo tipo di fenomeno prende il nome di

à

FOOTPRINTING.

Perchè tale sequenza viene protetta? Perchè essa legando ed interagendo con quella data porzione di DNA

viene protetta, e al termine si otterrà che tutto il DNA non legato alla proteina verrà degradato mentre

questa regione verrà conservata. Tale sequenza potrà quindi essere recuperata e sequenziata, tramite il

metodo Sanger, e per esempio potrebbe essere scoperto che il fattore trascrizionale X è in grado di legare

questa sequenza di DNA. Se quindi marcassi tante molecole di DNA e le facessi digerire dalla DNasi otterrei

una serie di frammenti, e se paragonassi lo stesso pattern di frammentazione di questa sequenza di DNA in

assenza del fattore di trascrizione con quella in cui vi è il fattore di trascrizione, vedrò a monte e valle tutti i

frammenti generati dalla DNasi e un gap in corrispondenza di tale regione non ci sono frammenti

à

generati dalla DNasi in assenza del fattore trascrizionale.

ChIP

Un’altra tecnica che si può utilizzare per studiare le interazioni tra DNA e proteina è la tecnica ChIP (o ChIP

dove ChIP sta per Chromatin Immuno-Precipitation, ossia un’immuno-precipitazione della cromatina.

Seq),

In ChIP Seq, alla precipitazione della cromatina, aggiungo uno step di sequenziamento.

Su che principio si basa la ChIP?

Inizialmente viene stabilizzata l’interazione tra la proteina e il DNA creando dei legami chimici tra

• queste due componenti

Liso le cellule

• Frammento il DNA per poterlo manipolare

• Faccio un’immuno precipitazione, cioè vado ad utilizzare degli anticorpi che riconoscono in modo

• specifico la proteina. Essi sono legati a delle particelle che appesantiscono di fatto l’anticorpo

Mescolo gli anticorpi, legati a queste particelle, al DNA frammentato

• L’anticorpo riconoscerà la proteina specifica

• Per centrifugazione gli anticorpi verranno trascinati verso il fondo perchè più pesanti

• 79

Elimino tutto ciò che vi è legato

• Alla fine è rimasto il materiale inerte, l’anticorpo, la proteina che lega l’anticorpo con eventual-

• mente il DNA legato dalla proteina in maniera covalente

Per analizzare il DNA elimino il cross-link, il quale è reversibile la reversione di questo legame

à

• permette di eliminare tutto ciò che non serve. Ho quindi purificato il DNA legato dal fattore di tra-

scrizione X

Il DNA, a questo punto, può essere quantificato

•

Posso poi anche andare a mappare la sequenza che ho sequenziato e vedere sul cromosoma dove sono le

sequenze legate dal fattore di trascrizione.

Queste tecniche permettono quindi di avere un quadro funzionale di ciò che si sta studiando.

Un altro modo per studiare la regolazione o l’espressione genica è andare a sostituire il gene di interesse

con un ossia un gene che permette una facile identificazione del prodotto per esempio

GENE REPORTER, à

GFP, la quale può essere usata come gene reporter perchè è una proteina fluorescente verde e, utilizzando

un microscopio a fluorescenza, si può quantificare la presenza del prodotto di questo gene, il quale è

controllato dalle regioni del gene di interesse. 30 marzo 2021

Determinazione della funzione di un gene

Per quanto riguarda la funzione di un gene abbiamo due tipi di approcci:

1. Analisi genetica diretta = è stata utilizzata per prima per tanto tempo quando ancora non erano di-

sponibili o così facilmente utilizzabili in laboratorio le tecniche di cui abbiamo parlato. Con questa

tecnica si parte dal fenotipo fino ad arrivare a identificare e studiare il gene che è responsabile o

che determina quel determinato fenotipo. Questa analisi genetica diretta ha visto per lungo tempo

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l'utilizzo dei mutanti quindi lo studio della funzione del gene viene fatto attraverso lo studio e

l’identificazione dei mutanti.

2. Analisi genetica inversa= cioè io parto da gene, lo clono, lo isolo, lo identifico, lo amplifico e poi

vado a vedere questo gene a cosa serve. Quindi da questo parto da questo presupposto per arri-

vare al fenotipo cioè alla funzione del gene.

Le tecnologie ricombinanti consento mutare in modo selettivo o anche aspecifico un gene per studiare gli

effetti fenotipici quindi ovviamente se noi abbiamo in gene e vogliamo studiare le caratteristiche,

dobbiamo mutare il gene e andare a vedere come queste mutazioni si riflettono a livello di fenotipo.

Abbiamo due grosse tipologie di mutagenesi:

Mutagenesi specifica

- Mutagenesi aspecifica.

-

Mutazione aspecifica vuol dire che noi mutiamo ma non riusciamo a controllare quello che in realtà è dove

avviene la mutazione e questo prevede l'utilizzo di agenti:

chimici

- agenti fisici

-

e quindi poi si ha una fase successiva che è la selezione dei mutanti che da il fenotipo caratteristico.

La mutagenesi specifica è diversa perché noi riusciamo a controllare la mutazione.

Questa si avvale di due tecniche:

PCR

- Mutagenesi Inserzionale (mediata da transposoni o KO) si va a mutare l’azione di un gene inse-

à

- rendo all’interno di quella sequenza il frammento che noi volevamo clonare.

Il clonaggio che avveniva per inserzione all'interno del lac è una sorta di knock out genico perché noi

andavamo a distruggere la vita di quel gene, infatti una volta avvenuto il clonaggio si andava a distruggere

completamente la funzionalità di quel gene.

Mutazioni

È una modifica a livello della sequenza del DNA e può dare luogo a diversi fenotipi:

ossia le mutazioni possono inattivare la proteina che viene codificata da quel gene se il gene è codi-

- ficante

oppure possono generare delle proteine che hanno qualcosa di conveniente cioè acquisisco delle

- caratteristiche particolari, migliorano la loro funzionalità ecc…

oppure emozioni che non hanno alcuna influenza come ad esempio le mutazioni silenti.

-

Diversi tipi di mutazioni:

Inserzionià in cui un frammento è stato inserito all'interno della nostra sequenza target

- Delezioni viene eliminata una parte di questa molecola di DNA

àquindi

- Mutazioni puntiformi in cui un solo nucleotide viene modificato.

à

-

La mutagenesi è utile perché: 81

Permette di alterare l’affinità tra enzima e substrato ad esempio il miglioramento del rendimento

- catalitico di una reazioneà quindi se prendiamo un enzima e lo andiamo a mutare magari riu-

sciamo a selezionare degli enzimi che hanno migliorato le loro la loro performance.

Cambiamento della tolleranza nei confronti del calore o la stabilità al pH ad esempio se vogliamo

- migliorare le prestazioni di un enzima ad esempio la resistenza alla denaturazione dovuta a calore o

pH o anche la sua funzione, possiamo andare a modificare o fare mutagenesi della sequenza del

DNA che codifica per quella proteina e quindi andare a studiare i vari fenotipiche e identificare

quelli che hanno migliorato le loro prestazioni

Aumento della resistenza nei confronti delle proteasi cellulari può essere utile per alcuni svi-

à

- luppi industriali o applicazioni industriali che possono riguardare vari aspetti.

Aumento della specificità di un enzima per il substrato quindi l'esempio questo ci perme