Tecniche microscopiche e molecolari in anatomia patologica

Lezione 1

TECNICHE MICROSCOPICHE E BIOMOLECOLARI IN ANATOMIA PATOLOGICA

L’ambito di maggiore complessità è quello della patologia neoplastica. La rapidità con cui si accumulano le

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conoscenze in merito a questo ambito è elevata la disciplina ha avuto accelerazione esponenziale nel produrre

conoscenza, è molto difficile stare al passo. Nel 1914 Boveri per la prima volta ipotizzò che per le neoplasie ci

fosse base cromosomica mentre dopo cinquant’anni viene identificata la traslocazione ricorrente del cromosoma

Philadelphia. Il primo oncogene è stato identificato nel 1976, nel 1990 è iniziato il progetto genoma umano. Ci

sono voluti tredici anni per sequenziare completamente il genoma umano.

Possiamo identificare, in termini di interpretazione e lettura di questa patologia:

• Era pre-genomica in cui le neoplasie e i fattori di rischio sono valutati a livello di popolazione. Oggi

l’obiettivo è quello di avere un rischio individuale, non più uno globale. Le neoplasie vengono classificate

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sulla base della loro morfologia microscopica utilizzando dei criteri istogenetici oggi la gran parte delle

classificazioni codificate delle neoplasie (blue books who) sono di tipo istologico e molecolare.

• Era genomica

• Era post-genomica

Oggi la gran parte delle classificazioni codificanti le neoplasie ha permesso di produrre biomarcatori e molecole

utilizzati per prognosi e imaging. I pazienti con le neoplasie in era pre-genomica erano trattati in modo empirico

con chemioterapici, sfruttando la diversa capacità di replicazione delle neoplasie quindi con strategie che tuttavia

non si basavano sulle basi biologiche delle singole neoplasie. Negli ultimi 10-15 anni abbiamo assistito ad uno

shift di paradigmi interpretativi con variazione del focus della ricerca: nell’era pre-genomica si volevano

individuare dove si trovassero i geni e come fossero fatti, oggi ci interessa capire come funzionano questi geni tra

di loro. Si passa quindi da genomica strutturale a genomica funzionale, da genomica a proteomica. Dalla diagnosi

molecolare di uno specifico difetto, oggi si tende a cercare di interpretare quale sia la suscettibilità individuale

delle malattie. Servono tecniche che analizzano diversi geni alla volta per fornire una visione globale dei fenomeni

biologici. Maggiore interesse anni fa era rivolto ai disordini monogenici, tuttavia gran parte delle patologie

clinicamente rilevanti sono malattie multifattoriali.

Le neoplasie sono patologie genetiche molto complesse, sono in gioco eventi di varia natura e portata

(riarrangiamenti cromosomici, delezioni interegioni, mutazioni, amplificazioni). Tutti questi eventi richiedono per

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essere interpretati ed analizzati tecnologie diverse negli ultimi anni sono state introdotte nuove tecnologie che

consentono di comprendere e valutare la complessità del genoma neoplastico; gli arrays e i sequenziamenti di

condividono la capacità di produrre un’enormità di informazioni analitiche a basso costo e di

nuova generazione

fornire informazioni conglobali quantitative e completamente integrate con le pipeline bioinformatiche.

La complessità della neoplasia consiste anche nel fatto che non si tratta di una malattia stabile nel tempo ma, dal

punto di vista genetico, è caratterizzata da un progressivo accumulo di modificazioni. Le neoplasie non nascono

come le osserviamo all’inizio clinicamente, il cancro è caratterizzato da modificazioni genetiche ed epigenetiche

che nel corso del tempo vengono selezionate seguendo un concetto darwiniano finalizzato a produrre una cellula

neoplastica che possa alterare le difese fisiologiche indispensabili per mantenere l’integrità biologica

La gran parte di queste modificazioni hanno piccoli effetti, le mutazioni di tipo

dell’individuo. driver hanno

invece effetto dominante. Globalmente, tutte le modificazioni hanno quindi un ruolo nell’incremento della fitness

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di una cellula tumorale le cellule neoplastiche presentano mediamente dalle 50 alle 100 alterazioni somatiche a

seconda del tipo di tumore, alcune limitanti nel caso delle mutazioni driver o altre addizionali che contribuiscono

poco o affatto possono essere identificate (passenger). Quel che definisce la biologia del tumore è il profilo

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mutazionale completo, il panorama genetico di ogni neoplasia il contesto genetico in cui ricerchiamo certe

alterazioni e mutazioni contribuisce all’effetto clinico patologico. Devono quindi essere ricostruite immagini

sempre più complete dal punto di vista molecolare; il profilo di espressione trascrittomico di una neoplasia

descrive quel che è dal punto di vista biologico, decodificare questi dati consente di identificare individualmente le

neoplasie e definire strategie personalizzate per il trattamento.

Le neoplasie non sono composte da cellule tutte uguali. I tumori sono eterogenei il che ha implicazione importante

per profilazione e terapie ma anche per comprendere l’evoluzione –

temporale delle neoplasie la risposta iniziale al

farmaco e la successiva resistenza, per esempio, è spiegabile dal fatto che la neoplasia è eterogenea dal punto di

vista clonale e l’applicazione di una terapia seleziona progressivamente una parte delle cellule di questo tumore

che sono resistenti. L’entità e la dimensione del fenomeno dell’eterogeneità tumorale è stata rivelata di recente

grazie alla possibilità di disporre di tecniche di sequenziamento che sono in grado di sequenziare molto

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profondamente i genomi hanno la capacità di ottenere su un tessuto decine di migliaia di sequenze di uno stesso

tratto di DNA. Attraverso l’applicazione di tecniche bioinformatiche si può così ricostruire l’assetto filogenetico

dei cloni tumorali in una neoplasia. Uno dei tumori in cui è stato fatto questo esercizio per la prima volta è il

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carcinoma renale a cellule chiare grazie al sequenziamento profondo di aree multiple di una stessa neoplasia è

stato possibile ricostruire le varie relazioni che esistono tra le cellule che la costituiscono. Ci sono molti tipi di

relazioni dal punto di vista evolutivo: evoluzione lineare, evoluzione più ramificata come appunto nel carcinoma

renale a cellule chiare in cui le mutazioni comuni a tutte le cellule (truncali) sono poche (una sola in questo caso).

In questo caso, la neoplasia nel corso della sua evoluzione ha progressione ramificata, ogni ramo è caratterizzato

dalla presenza di diverse mutazioni driver che si separano dal punto di vista tanto molecolare quanto spaziale

(nella neoplasia occupano aree adiacenti). In questo tumore singoli subcloni occupano nicchie spazialmente

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distinte e funzionalmente diverse nel gioco della selezione clonale singoli cloni possono prendere

l’evoluzione neoplastica. Alcune mutazioni driver resistenti a

progressivamente il sopravvento e dominare

determinati farmaci sono presenti su alcune cellule, altre invece rimarranno insensibili alla terapia e prenderanno

infine il sopravvento questo spiega le ricadute e le metastasi. Esistono diversi modelli di evoluzione tumorale:

alcuni sono caratterizzati da profili lineari, altri ramificata simile alla speciazione allopatrica. In alcuni tumori

l’evoluzione antagonistica fa sì che i cloni si trovino in competizione tra loro e in altri sono stati invece descritti

fenomeni di cooperazione tra i cloni (evoluzione simbiotica). –

Nel genoma di una cellula tumorale è scritto tutto la storia della neoplasia la storia può essere ricostruita

delle lesioni e lo studio delle relazioni clonali all’interno della neoplasia.

attraverso il sequenziamento profondo

Un modello è quello dei tumori mammari tripli negativi, negativi a recettori estrogenici ed altri marcatori

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targettabili. Questi tumori sono stati sequenziati in modo molto profondo il genoma di queste cellule è stato

paragonato ad una sorta di pergamena in cui restano tracce che ci permettono di capire la storia della vita del

dell’evoluzione

tumore. Il tempo della vita di una neoplasia non scorre con la stessa velocità a tutti i momenti

naturale della malattia; inizialmente è richiesto un tempo fisico molto lungo perché si selezionino alcuni difetti

chiave per stabilire mutazioni driver nelle neoplasie (i cloni ancestrali selezionano cellule quiescenti non molto

rappresentate ma con elevata capacità di replicazione > staminali). Perché la cellula staminale si trasformi è

necessario molto tempo, da questa poi si svilupperanno dei subcloni in un altro largo lasso di tempo atto alla

diversificazione clonale. Un tumore al microscopio seppure classificato clinicamente come neoplasia precoce, dal

punto di vista genetico è già molto diversificato e probabilmente gran parte è dominata da cloni altamente

selezionati. Quando queste lesioni arrivano ad essere clinicamente significative allora il tempo accelera molto:

cloni dominanti in tumori eterogenei sono caratterizzati da centinaia o migliaia di mutazioni che sono spesso più

del set di mutazioni condiviso da tutte le cellule tumorali. Nel corso di evoluzione neoplastica ci sono eventi di

diversificazione clonale tardiva caratterizzati dalla capacità di generare eventi genetici catastrofici, in grado di

produrre un’instabilità tale da indurre un numero elevatissimo di mutazioni. Sono fenomeni cromotripsi che

dell’evoluzione in una marcia molto più alta –

spostano la scala temporale quando si realizzano questi eventi i

tumori vanno incontro ad importante accelerazione tanto genetici quanto clinici. Sono questi eventi che

riconosciamo nei fenomeni di progressione di una neoplasia (da benigna a maligna, da confinata a metastatica). È

complicato quindi cercare di comprendere a livello del singolo gene, è più semplice quindi fare riferimento a via

biologiche complesse di geni che cooperano per svolgere la stessa funzione. Ad esempio, il carcinoma del

pancreas può essere descritto sulla base della deregolazione di 12 pathway multigenici funzionali distinti.

Uno dei primi strumenti utilizzati per descrivere funzionalmente

le neoplasie e ricostruire vie di segnale e profili di espressione

sono gli arrays. Gli arrays sono collezioni ordinate di frammenti

genici, inizialmente erano spot plasmidici su membrana

nitrocellulosica ora invece sono oligonucleotidi che vengono

litografati su una superficie (chip) di silicio. Su un singolo chip

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possiamo interrogare centinaia di migliaia di geni diversi è una

delle tecnologie ad oggi più comprensiva nello studio delle

neoplasie, consente di ottenere una immagine globale del profilo

di espressione di una neoplasia. Gli arrays sono un modo di

analizzare su larga scala, parallelamente eventi genetici e si

possono quindi applicare in modi diversi. Quando gli arrays sono

stati per la prima volta applicati alle neoplasie è risultato chiaro

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che la morfologia da sola non può descrivere in modo completo la biologia dei tumori hanno aumentato di

ordini di grandezza la capacità di interpretare le neoplasie. Nelle leucemie dell’infanzia, nei linfomi, in alcuni

sarcomi, hanno rivoluzionato i criteri classificativi aumentando di numero di grandezza i target molecolari che

possono essere identificati nella patologia. I microarrays sono ad oggi l’approccio più comprensivo e

produttivo alla quantificazione dell’espressione genica, producono una quantità enorme di dati. Tutti questi

metodi non solo accelerano e riducono i costi, ma il vero salto dal punto di vista culturale è il fatto che sono

metodi che consentono di ottenere una descrizione globale di un fenomeno biologico complesso. Oggi è

l’interpretazione dei dati il fattore limitante: c’è bisogno di integrazione con banche dati ed interfacce

bioinformatiche. L’applicazione più semplice e produttiva degli arrays di espressione è quella classificativa: il

set di geni espresso o le mutazioni di un tumore sono una immagine molecolare di quel che è la neoplasia,

rappresentando quindi delle impronte digitali del tumore ed impiegabili quindi per la classificazione

morfologica dei vari tipi di tumori.

Uno dei primi esempi di applicazione degli arrays è stata la classificazione di una classe di linfomi (neoplasie

cellule linfatiche non danno massa, sono cellule circolanti) che per anni ha eluso la classificazione

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morfologica per quanto si sapesse è una classe eterogenea, ma si trattava di linfomi b-diffusi a grandi cellule

con cellule grandi ed atipiche che crescono senza seguire precisa architettura nella proliferazione.

L’applicazione degli arrays ha dimostrato che sono classificabili in almeno tre o quattro tipi tumorali diversi a

seconda del loro profilo di espressione; la classificazione molecolare è clinicamente rilevante, sono stati visti i

marcatori antigenici ed ora è possibile riprodurre questa classificazione molecolare utilizzando un pannello

anticorpale con tecniche immunoistochimiche su preparati istologici convenzionali. Lo stesso è stato applicato

ad altri tipi di linfomi. –

Questo stesso approccio viene applicato in modo indistinto a tutti i tumori uno dei primi esempi per i tumori

solidi è quello dei tumori mammari. Nel 2004 utilizzando arrays di espressione è stato possibile descrivere i

sottotipi molecolari di questa neoplasia. La profilazione di neoplasie attraverso arrays di espressione ha dei

la trascrizione c’è la traduzione, quindi un livello di controllo

limiti concettuali perché comunque dopo

traslazionale per cui la proteomica aggiunge un livello ulteriore. I dati ottenuti sono complessi, esistono profili

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di espressione comuni che si riscontrano in diversi tumori prima di arrivare ad applicazione clinica dei

profili di espressione sono necessari processi rigorosi di validazione attuati sull’istologia; la rilevanza

biologica dei diversi livelli di espressione dei geni deve essere accurata.

La quantificazione richiede perciò di applicare delle tipologie di tecnologie diverse, inoltre non basta vedere

diversi profili di espressione dei geni, è importante capire quali siano i fenomeni biologici alla base dei diversi

profili. In questo senso esistono saggi diversi:

• TMA - sono collezioni di piccoli frammenti di tessuto e consentono di moltiplicare il numero di

campioni tumorali che possono essere analizzati su un singolo vetrino con una sola reazione di

immunoistochimica.

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FISH analizza pochi target.

• –

Nanostring consente di ottenere profili di espressione molto quantitativi fino a 700/800 geni. È una

tecnologia automatizzata, permette di studiare in modo accurato i profili di espressione con un tempo

operatore molto ristretto. Il sistema può essere applicato allo studio dell’espressione, del genoma

fisico, delle proteine. Consiste in un sistema di cattura di molecole (DNA, RNA, proteine) su matrice

solida usando delle sonde che hanno codice colore: le sonde per le diverse proteine portano una coda

formata da una serie di sei fluorocromi che in diversa combinazione identificano la singola molecola

catturata. Le molecole vengono legate alla sonda, fissate su un supporto solido, linearizzate e un

microscopio è in grado di decifrare la sequenza di fluorocromi di ciascuna sonda per contarle

fisicamente. L’analisi può essere a livello di femtomoli (una singola copia per cellula) senza dover

ricorrere ad amplificazione (PCR) che introdurrebbe bias di rappresentazione di popolazione di

molecole complesse (alla fine della PCR il risultato non è così fedele alla situazione di partenza). È

una tecnologia molto sensibile che funziona molto bene, per quanto riguarda lo studio di espressione,

anche per acidi nucleici degradati. L’aspetto interessante di nanostring è che può essere utilizzata

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anche per catturare una proteina o DNA, anche in un singolo esperimento consente in linea di

principio di intravedere delle tecnologie di analisi tridimensionale dei fenomeni biologici, si può

esplorare la struttura fisica di genoma, trascrittoma e proteoma.

• qRT-PCR

• Array

• DNAsec

Un’altra tecnologia che ha sensibilmente cambiato lo studio delle neoplasie è il next generation sequencing.

Si tratta di un complesso di tecnologie di sequenziamento più correttamente definite come sequenziamento

massivo parallelo o ad alta produttività o di seconda generazione. Sono tecnologie che hanno rivoluzionato il

sequenziamento portandolo a diventare una tecnologia che costa molto poco e può essere applicato alla

diagnostica routinaria. Oggi un sequenziatore di seconda generazione può sequenziare interamente il genoma

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umano in ventiquattro ore ad un costo inferiore ai 1000 dollari ciò ha richiesto lo sviluppo di conoscenze in

numerosi campi, non è una tecnica immaginabile senza l’impiego della PCR o alla disponibilità di risorse

biologiche purificate a basso costo o ancora sistemi di rilevazione con fluorescenza. Gli avanzamenti nel

campo del sequenziamento nucleotidico definiscono una nuova era nella storia dell’umanità. Nel 1990 si

costasse circa quindici tonnellate d’oro, oggi costa

stimava che sequenziare un milione di nucleotidi

l’equivalente economico di 30g di alluminio.

I sequenziatori di prima generazione possono leggere fino a 900pb per sequenza ma da una resa per giorno che

non superava i 2.1 milioni di basi al giorno (meno dello 0.1% del genoma umano). Per sequenziare una volta il

genoma umano c’era bisogno di mille giorni, un sequenziatore HiSeq X invece sequenza frammenti più corti

ma ha una resa giornaliera di 50Gbp che è 16 volte il genoma umano. Ci sono sequenziatori di tutte le

dimensioni e costi: i sequenziatori Ion alloggiano diversi tipi di Chip e consentono quindi di gestire diversi

tipi di esperimenti diversi a seconda di quel che si vuole fare. Se poniamo su una scala logaritmica il numero

di pb per esperimento e la lunghezza di sequenziamento si può osservare come il sequenziament