Tecniche microscopiche e molecolari in anatomia patologica

MICROSCOPIA A CONTRASTO DI FASE

La microscopia a contrasto di fase è un metodo più diretto, si usa nei microscopi invertiti usati per osservare le cellule in vitro o cellule che crescono su piastre di coltura. Quando si fa passare un raggio luminoso attraverso un tessuto, alcuni raggi luminosi passano attraverso senza avere variazioni né di intensità, sono l'interazione del campione. Questo è uno dei sistemi ottici che converte raggi luminosi rifratti attraverso la direzione del raggio luminoso in modificazioni di luminosità visibili all'occhio umano.

Quando i raggi luminosi passano attraverso un mezzo di qualsiasi tipo, si modificano in funzione delle proprietà del tessuto, per esempio alcune sostanze saranno più o meno dense e determineranno una maggiore o minore luminosità del campione, cioè la capacità di variazioni di fase, tipo, l'ampiezza e la fase del raggio luminoso.

modificare la direzione del raggio luminoso, cambia a seconda della composizione chimica del campione. In alcune strutture la luce passa attraverso senza avere una riduzione di intensità, in altre, viene l'occhio umano è attenuata e rifratta, la fase, la direzione del raggio luminoso viene modificata molto o poco; solo sensibili a variazioni d'ampiezza dell'onda e non è in grado di apprezzare variazioni della direzione, della fase della luce. Le variazioni di fase forniscono implicazioni biologiche, perché le diverse strutture biologiche possono avere 3 diversi indici di rifrazione; la microscopia a contrasto di fase, è in grado di trasformare in variazioni di luminosità indivisibili variazioni nell'indice di rifrazione delle varie molecole. Il microscopio a contrasto di fase è un sistema ottico in grado di manipolare la luce di background rispetto alla luce che viene dispersa dalle varie sostanze che costituiscono il tessuto.

Contrasta il fondo rispetto agli oggetti, e attraverso dei sistemi ottici, filtri, obiettivi, è in grado di trasformare variazioni di fase in variazioni di luminosità. Per esempio, delle cellule che crescono in coltura su piastra, si riescono a distinguere i contorni delle cellule, applicando il contrasto si riconoscono molto meglio dettagli cellulari e subcellulari, la forma dei nuclei, di granuli, ecc.

MICROSCOPIA A LUCE POLARIZZATA

Un altro metodo che consente di migliorare il contrasto dei tessuti è l'uso della luce polarizzata che consente di visualizzare materiali birifrangenti, e questi sistemi ottici trasformano queste variazioni di fase in variazioni di luminosità. Sono tipicamente dei materiali birifrangenti delle sostanze con struttura regolare, come le sostanze cristalline. Questo sistema è utile per identificare materiale estraneo, se si hanno deposizione di Sali, per esempio, ci sono molte patologie come quelle polmonari, legate a inalazioni di polveri minerali.

silicosi, asbestosi, e utilizzando la luce polarizzata si riesce ad evidenziare la deposizione nei tessuti, anche su sezioni istologiche. Il sistema ottico che è in grado di determinare la polarizzazione è composto da un polarizzatore, un sistema che è in grado di generare luce polarizzata e un analizzatore, attraverso l'incrocio del polarizzatore e dell'analizzatore si selezionano i raggi luminosi refratti dal materiale polarizzato escludendo il fondo, per evidenziare le sostanze birifrangenti.

LIMITE DELLA MICROSCOPIA CONVENZIONALE

Oltre al contrasto, uno dei limiti principali della microscopia convenzionale è la capacità di risoluzione di queste tecniche, cioè la capacità di riconoscere oggetti molto piccoli. Ci sono dei limiti fisici alla risoluzione dei sistemi ottici che sono dovuti alla diffrazione della luce, cioè il fatto che le onde luminose quando passano attraverso un sistema ottico vanno incontro a dei fenomeni di interferenza.

Un punto luminoso non viene visto perfettamente definito ma ha un'attenuazione periferica del contrasto e della luminosità (point spread function) che non consente di distinguere due oggetti molto piccoli vicini tra di loro, non riesce a separarli.

La capacità di rifrazione dei sistemi ottici; le variabili fisiche che più direttamente incidono sul potere di risoluzione sono la lunghezza d'onda, (per strutture subcellulari vanno usate lunghezze d'onda molto piccole, è direttamente proporzionale alla lunghezza d'onda) l'indice come dei raggi x, perché il potere di risoluzione L'equazione che definisce il potere di risoluzione di di rifrazione del mezzo e le proprietà del sistema ottico.

Un sistema ottico x, cioè la distanza più piccola attraverso cui 2 oggetti distinti possono essere risolti è l'equazione di Abbe che ci dice che è direttamente proporzionale alla lunghezza d'onda.

Cioè più bassa è la lunghezza d'onda maggiore sarà il potere di risoluzione perché più piccola sarà la distanza attraverso cui due oggetti possono essere risolti. (n, l'indice di rifrazione del mezzo). È inversamente proporzionale all'indice di rifrazione del mezzo e alla metà del seno di alfa, la metà dell'apertura angolare della lente (in realtà tutto il denominatore dell'equazione -2nsenalfa- viene detto apertura numerica della lente, che corrisponde alla metà del cono di luce catturata dalla lente, quindi può essere riscritta come lambda fratto 2 volte l'apertura numerica. Più ampio è il cono di luce maggiore sarà la risoluzione, la capacità di catturare la luce che deriva da un sistema luminoso, dipende dall'indice di rifrazione del mezzo, l'area ha un indice di rifrazione piuttosto basso, 1, questo vuol dire che i raggi

luminosi che derivano dal campione vengono per la maggior parte rientrano nel cono di luce, nell'apertura angolare. Altri mezzi come l'olio o delle resine, hanno deflessi, un indice di rifrazione maggiore quindi consentono di catturare una maggiore quantità di luce che deriva dal campione, quindi se si vuole esaminare con microscopia convenzionale un campione molto piccolo ad ingrandimenti elevati, bisogna usare delle lenti particolari ad immersione e si deve mettere sul vetrino un mezzo particolare, come un olio, che aumenta l'indice di rifrazione del tessuto. Si possono quindi manipolare i sistemi ottici con lenti con apertura angolare maggiore e usando dei mezzi che aumentano l'indice di rifrazione o aumentando la lunghezza d'onda.

Fra le tecniche ottiche più diffuse che consentono di migliorare il limite di diffrazione dei sistemi ottici convenzionali c'è la microscopia confocale.

MICROSCOPIA CONFOCALE

È un sistema ottico caratterizzato da una fonte luminosa laser che è in grado di fare fuoco su un'area molto ristretta del campione, limitando i problemi di diffrazione della luce, e restituisce l'immagine attraverso un filtro che consente che solo la luce che deriva dal piano focale arrivi al sistema ottico. Tutto ciò che devia e degrada la risoluzione dell'immagine viene eliminato. È quindi un sistema fisico che elimina la luce fuorifuoco ed evita che la luce fuori fuoco raggiunga il rivelatore, il sistema ottico. La microscopia confocale ha una fonte laser con specchio che devia la luce su un punto focale molto piccolo, la fonte luminosa è molto circoscritta. Il sistema di rilevazione ha un sistema di lenti che concentrano la fonte luminosa su un filtro con al suo interno un piccolo spazio, che esclude dal sistema di rivelazione tutti i raggi luminosi che derivano da piani fuori dal piano focale e questo consente di ottenere un'immagine con una

maggiore risoluzione. Il piano a ver focale è molto piccolo quindi l'immagine viene costruita punto dopo punto attraverso un sistema di scanning del campione con il laser e dei sistemi digitali. La capacità di concentrare la luce su un punto molto piccolo e di variare i piani focali consentono anche di ottenere una parziale capacità di sezionamento ottico del tessuto, cioè si possono ottenere sezioni a diversa profondità del campione e quindi poi ricostruire digitalmente una rappresentazione tridimensionale del campione. Però questo è un sistema che richiede delle fonti luminose molto potenti perché attraverso il sistema che filtra i raggi luminosi si riduce la luminosità del campione. È tuttavia possibile usando questi sistemi di microscopia confocale ottenere dei sistemi ottici in grado di realizzare imaging in vivo di luci fluorescenti o riflesse non troppo potenti, fino ad una profondità di 300-400 micron del tessuto.

Questi sistemi ottici se appropriatamente modificati, possono realizzare una sorta di istologia virtuale di cellule e tessuti vitali.

MICROSCOPIA CONFOCALE LASER (CLE)

È il principio utilizzato nella microscopia confocale laser, una tecnica di microscopia confocale associata a degli endoscopi, che consente la produzione di immagini simil istologiche ad alta risoluzione di un tessuto in vivo, cioè delle biopsie ottiche in tempo reale. Nei sistemi di endomicroscopia laser confocale sono incorporati dei luminol, che illuminano il tessuto con una fonte laser a bassa potenza sfruttando l'autofluorescenza o la fluorescenza indotta del tessuto, somministrando sostanze fluorescenti e sono dotati di un sistema di rivelazione confocale che esclude la luce che deriva dai piani focali al di sopra o al di sotto di quello che si vuole evidenziare e consente di realizzare un sezionamento ottico del tessuto. Si ottengono le immagini in scala di grigio che poi si possono colorare per via digitale.