Tecniche microscopiche e molecolari in anatomia patologica

ESTRAZIONE DA FASE SOLIDA

L'estrazione da fase solida segue i seguenti passaggi: lisi cellulare, assorbimento NA, lavaggio ed eluizione.

MATRICI DI SILICE: viene sfruttata l'alta affinità del backbone di NA caricato negativamente con le particelle di silice cariche positivamente, la membrana è appositamente caricata per intrappolare l'NA, viene usato etanolo per rimuovere l'acqua e una volta avvenuto l'ancoraggio dell'NA alla matrice solida si effettuano dei lavaggi per rimuovere via tutto il resto, possono anche essere utilizzate delle biglie magnetiche, oppure si sfrutta il legame degli oligo dT per RNAm su una superfice ampia come ad esempio, le biglie stesse.

METODO ESTRAZIONE CHELEX: utilizza una resina chelex composta da copolimeri di stirene e divinil benzene con ioni iminodiacetati accoppiati ossia agenti chelanti, in ambiente alcalino acquoso vi è affinità maggiore di chelex per cationi di metalli pesanti Ca2+, MN2+, NA2+ che

intrappolano ioni magnesio necessari allenucleasi. Il campione viene fatto bollire con 5% H2O e CHELEX. L’alcalinità e ilbollore interrompono le membrane, distruggono le proteine e denaturano il DNA. Sicentrifuga e si separa il pellet dal resto con la resina e nel surnatante si ha il DNA.Vi sono poi estrattori automatici su fase solida a base di silice.

QUANTIFICAZIONE E ANALISISPETTROSCOPIA: sfrutta l’assorbanza di DNA/RNA e altri composti, gli NAhanno un’assorbanza con un picco a 260nm, mentre le proteine e altri contaminantiassorbono a 280nm, valutando quindi il rapporto di assorbanza 260/280 nm si ha unvalore che esprime il DNA puro non degradato di almeno 1,8 mentre è di almeno2/2,2 per RNA. Il saggio ha tuttavia una bassa sensibilità necessita infatti di almeno 2microgrammi su microlitri di DNA.

COLORANTI INTERCALANTI E FLUORESCENTISi legano selettivamente all’NA specifico in modo debole, il fluorimetro da unaquantità di segnale

Vengono rilevati in tempo reale, con una rapida analisi e interpretazione dati. Si crea una curva del tempo rispetto alle dimensioni del frammento + elettroferogramma con tempo di migrazione e intensità della fluorescenza. L'integrità viene espressa attraverso l'integrity number RIN determinato dalla curva dell'elettroferogramma, la sua scala valori va da 1 a 10 dove 10 è il più intatto e 1 il più degradato.

L'RNA va conservato a -80 gradi con soluzione acquosa o a -20 gradi come precipitato di etanolo. Si utilizzano aliquote più piccole per evitare troppi cicli di congelamento/disgelo.

AMPLIFICAZIONE (PCR)

PCR (Polimerasi Chain Reaction): è una tecnica che consente di andare ad amplificare e valutare la presenza di sequenze geniche target. Si basa sulla replicazione del DNA in laboratorio mediante l'utilizzo di DNA polimerasi particolari specifiche in base alle esigenze, primers, DNA stampo, controllo della temperatura, deossinucleotidi trifosfato.

ioni Mg2+ e tamponi.

La reazione di PCR porta ad amplificare il DNA in maniera specifica per determinate sequenze o in modo aspecifico, la presenza del prodotto amplificato implicherà la presenza di quella sequenza genica ricercata nel campione, è sufficiente una fonte di 0,1/1ng di DNA per avere fino a 5/50ng di DNA in vitro, la quantità di amplificato prodotto seguirà nel tempo una fase esponenziale seguita poi da una fase di plateau dovuta all'esaurimento dei reagenti.

La PCR consiste in una serie di cicli di replicazioni di DNA favorite dall'utilizzo di un termociclatore che porta gli enzimi ad una temperatura ottimale per le varie fasi della replicazione del DNA. Si utilizza una DNA polimerasi specifica come la Taq polimerasi derivante dal batterio Termus Aquaticus in grado di reggere variazioni di temperature repentine senza influenzare la resa. La quantità di DNA iniziale deve essere ottimale altrimenti si ha il rischio di ottenere

amplificazioni aspecifiche, i buffer utilizzati devono mantenere il pH tra 8 e 9,5 e spesso sono stabilizzati con TRIS-HCL. Nel tampone possono essere inclusi additivi chimici o co-solventi come dimetil solfato, albumina sierica bovina, BSA e glicerolo. Gli ioni Mg2+ usati devono essere saggiati correttamente una loro eccessiva presenza porta anche in questo caso ad amplificati aspecifici e una loro deficienza porta ad avere poco amplificato, stessa cosa accade quando andiamo a scegliere la quantità di deossinucleotidi trifosfato da utilizzare. Il legame dei primer al DNA stampo denaturato fornisce lo start della PCR, la DNA polimerasi allunga il primer fino alla completa replicazione del frammento di DNA. I primer sono piccoli oligonucleotidi complementari alla sequenza di DNA target che si vuole amplificare o verificare la presenza, sono costituiti da 15-30 pb progettati per legarsi in 3' e 5' sul filamento opposto, i siti di legame devono però essere unici.

omologia minimaper garantire specificità del prodotto. Bisogna considerare che i primer hanno delle temperature dette di annealing che corrispondono alla temperatura alla quale questi si legano al dna stampo dando origine alla replicazione, il design del primer deve inoltre considerare che non devono essere tra loro complementari altrimenti si ha il primer dimer che porta a scarsi prodotti di PCR. Si consiglia un contenuto in G e C del 40/60% e di evitare strutture troppo lunghe o che possano formare strutture secondarie. La probabilità di formazione di primer dimer è comunque alta se questi sono presenti in eccesso rispetto alla quantità di templato, inoltre anche la possibilità di errori di primazione sono possibili se vi sono delle elevate quantità di primers.

ANALISI PRODOTTI – GEL ELETTROFORESI

I prodotti PCR vengono mescolati con primer marcati e caricati in pozzetti nella parte superiore del gel di agarosio e immerso nel tampone colorando il

DNA con etidiobromuro che si intercala tra le basi di DNA, il quale potrà poi essere visualizzato sotto lampada a raggi UV. I prodotti migrano verso la carica positiva e vengono separati in base alle dimensioni del frammento, le molecole marker forniscono info riguardo alla dimensione dei frammenti testati.

GEL CAPILLARE

Questo sistema prevede un tag in 5' con un fluorocromo. Il sistema di rilevamento viene eccitato da un laser, la luce viene rilevata dopo stimolo laser. La luce emessa viene rilevata dallo strumento che proporzionale al prodotto PCR generato, proporzionalmente alla quantità di dna genomico nel campione originale, i protocolli prevedono controlli positivi e negativi con il gene house keeping che dimostra una buona qualità dell'amplificato. Il personale deve essere addestrato per evitare contaminazioni.

SONDE TARGET SPECIFIC - SONDE DI IDROLISI TAQMAN

Oligonucleotidi a singolo filamento omologo ad una sequenza interna di dna, sono due sonde marcati

viene misurato nello stesso campione. Tracciandol'intercetta data dal livello della curva standard e dal valore di cut off si risale allaconcentrazione iniziale di dna relativamente a quella del gene housekeeping.Viene fatto ciò per determinare il livello di inibizione di un gene rispetto a dei valorinormoespressivi. Il valore ottenuto è difatti relativo.

RETRO PCR

Le dna polimerasi utilizzate spesso non riconoscono l'uracile, tuttavia può essereusato l'RNA convertendolo in cDNA usando una retro-trascrittasi inversa checonsente il passaggio da RNA a cDNA, come MMLV-RT che ha un'attivitàesonucleasica 3'-5'che consente anche di evitare errori. I primers che vengonoutilizzati in questi casi possono essere di 3 tipologie, ossia primeresameri/oligonucleotidi casuali che amplificano tutti gli rna presenti in manieraindistinta utili per analisi quantitative; primer Oligo dt che appaiano la coda di polyAdell'rna anch'