Tecniche di laboratorio in spermatologia

Corso di laurea magistrale in biotecnologie mediche e farmaceutiche

Tecniche di laboratorio in spermatologia

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Sommario

• Il processo di fecondazione e i meccanismi di riconoscimento tra gameti ..................................... 3
• Il processo di capacitazione negli spermatozoi ............................................................................. 3
• Fattori che influenzano la capacitazione in vitro ......................................................................... 5
• Rilascio di colesterolo da parte delle membrane ...................................................................... 6
• Incremento di calcio durante la capacitazione.......................................................................... 7
• Gradiente di bicarbonato ............................................................................................................ 8
• Fosforilazione tirosinica.............................................................................................................. 9
• ROS............................................................................................................................................. 10
• Processo maturativo epididimale dello spermatozoo ..................................................................... 11
• Fattori esterni/interni coinvolti nella regolazione della motilità spermatica .......................... 12
• Osmolarità ................................................................................................................................. 12
• Motilità epididimale e regolazione ormonale .......................................................................... 12
• Meccanismi alla base della motilità negli spermatozoi ................................................................. 19
• La coda dello spermatozoo............................................................................................................ 20
• Energia .......................................................................................................................................... 21
• Difetti genetici e motilità spermatica.......................................................................................... 21
• Fattori che regolano la motilità ................................................................................................... 22
• ROS............................................................................................................................................. 22
• Osmolalità .................................................................................................................................. 22
• Calcio .......................................................................................................................................... 23
• Adenilato ciclasi/cAMP/PKA .................................................................................................... 23
• Chinasi e fosfatasi ..................................................................................................................... 24
• La reazione acrosomiale ................................................................................................................... 28
• Come avviene la fusione tra le membrane? Cosa la stimola? ................................................... 29
• Molecole che inducono la reazione acrosomiale in vitro ............................................................ 30
• Principali vie di segnalazione ...................................................................................................... 31
• Calcio .......................................................................................................................................... 31
• Fosforilazione tirosinica............................................................................................................ 33
• Dove avviene realmente la reazione acrosomiale? Qual è lo stimolo vero? ............................. 33
• Citofluorimetria in spermatologia .................................................................................................. 36
• Separazione e isolamento degli spermatozoi .................................................................................. 60
• Caratteristiche morfologiche ........................................................................................................ 63
• Birifrangenza degli spermatozoi .................................................................................................. 64
• Immunomagnetic cell sorting ...................................................................................................... 66
• Isolamento mediante coating con acido ialuronico..................................................................... 67
• Lana di vetro (Glass wool) ............................................................................................................ 68
• Metodo elettroforetico ................................................................................................................... 69
• Z selection ...................................................................................................................................... 70
• Tecniche per il sessaggio .............................................................................................................. 70
• Frammentazione del DNA negli spermatozoi ................................................................................ 72
• SCSA .......................................................................................................................................... 73
• TUNEL ....................................................................................................................................... 73
• COMET ...................................................................................................................................... 74
• SCD............................................................................................................................................. 74
• Il problema della standardizzazione ........................................................................................... 74
• TUNEL P/I..................................................................................................................................... 75
• Effetto della selezione sui livelli di sDF ...................................................................................... 77
• Origine frammentazione DNA spermatico ................................................................................. 78
• Valutazione del potere fertilizzante degli spermatozoi ................................................................. 83

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Tecniche di laboratorio in spermatologia

Il processo di fecondazione e i meccanismi di riconoscimento tra gameti

Il processo di capacitazione negli spermatozoi

Gli spermatozoi sono composti da una testa, che contiene nucleo e acrosoma, la quale attraverso il connecting piece si lega al flagello, composto da tre parti: il midpiece, nel quale si trovano i mitocondri che svolgono il ruolo di fornitori di energia per il movimento della coda (ma non sono gli unici), il principal piece, dove i mitocondri non sono più presenti e sono sostituiti da un foglietto fibroso e l’end piece che contiene soltanto l’assonema e non ha più il foglietto fibroso (la sua funzione non è del tutto chiara, qualcuno lo considera come una sorta di timone).

Gli spermatozoi cominciano a sviluppare la motilità nell’epididimo, prima dell’eiaculazione (4) hanno un tipo di motilità detto progressiva e durante il transito nelle vie genitali femminili, avvengono tutta una serie di modificazioni di queste cellule che sono fondamentali per il processo di fertilizzazione: il principale è il processo di capacitazione, che avviene fisiologicamente nel tratto genitale femminile grazie all’interazione con le cellule del tratto genitale femminile (utero e principalmente tube), grazie a tutta una serie di molecole (ATP, ROS, PAF) e a specifiche condizioni di temperatura (37-38 °C), tempo (1 a 24 ore) e pH.

La capacitazione è un evento maturativo post eiaculatorio che serve allo spermatozoo per acquisire la capacità di fertilizzare l’oocita.

Tutto ciò che sappiamo su questi processi deriva da studi in vitro, perché studi in vivo non sono ovviamente possibili.

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Questo significa che al momento dell’eiaculazione, e subito dopo di essa, lo spermatozoo non è in grado di fecondare l’oocita, ma lo diventa dopo il transito nelle vie genitali femminili. In vitro lo si ottiene in mezzi capacitanti appropriati.

Durante la capacitazione si sviluppa la motilità iperattivata e avvengono modificazioni su testa e coda, che consentono tutto il processo di fecondazione dell’oocita.

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Fattori che influenzano la capacitazione in vitro

Si è tentato di ricostruire un processo che fosse il più vicino possibile a quello in vivo e sono stati sviluppati dei mezzi di coltura che avessero la composizione il più possibile simile a quella del fluido tubarico. Tolte le varie componenti una per volta per poi andare ad individuare quali di queste fossero fondamentali: sebbene tutti fossero importanti per sviluppare la capacitazione, albumina e bicarbonato si sono rivelati quelli fondamentali.

Lavoro che ha permesso lo sviluppo di un test per studiare la capacitazione, usato anche come test predittivo della capacità degli spermatozoi di capacitarsi in un determinato soggetto, molto utilizzato nei centri di fecondazione assistita.

Ci sono soggetti che necessitano di più tempo per capacitarsi rispetto ad altri. Nei soggetti subfertili la capacitazione è notevolmente ridotta, fino ad avere identificato una sorta di cut-off che permette di vedere in quali soggetti avverrà e in quali non avverrà una capacitazione sufficiente a portare ad una fecondazione dell’oocita.

Per lo studio in vitro della capacitazione è necessario prima di tutto selezionare la popolazione di spermatozoi mimando il primo processo che avviene all’interno del corpo femminile, passaggio degli spermatozoi attraverso il muco cervicale (primo ostacolo dopo la deposizione in vagina): solo gli spermatozoi mobili riusciranno a superare questo ostacolo e arrivare poi all’interno dell’utero.

Vediamo le tecniche che ci permettono di selezionare gli spermatozoi da un eiaculato. Questi spermatozoi mobili vengono poi incubati in vitro e si va a studiare le pathways che vengono attivate. Vediamo le modificazioni fisiologiche degli spermatozoi durante la capacitazione, non in ordine di tempo e di importanza.

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Rilascio di colesterolo da parte delle membrane

Se il colesterolo viene rilasciato, questo provocherà modifiche che renderanno la membrana più fluida. La fluidità è necessaria perché avvenga il processo di fecondazione dell’oocita.

Vediamo ridistribuzione lipidica e zone raft all’interno dello spermatozoo.

L’efflusso di colesterolo dalle membrane avviene grazie alla presenza esterna di un accettore, presente tra i costituenti fondamentali del mezzo, ovvero l’albumina. L’albumina fa da accettore alle molecole di colesterolo e la sua concentrazione è elevata nel tratto genitale femminile. L’aumento di fluidità serve, per esempio, a permettere l’esposizione sulla superficie di altre molecole, con l’aiuto di altri fenomeni che avvengono durante la capacitazione, come la fosforilazione.

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Uno dei signaling pathway che sembrano essere coinvolti in questo efflusso di colesterolo riguarda la fosforilazione in serina/treonina. Vediamo che se l’albumina viene tolta dal mezzo, la fosforilazione in serina/treonina non avviene. Stessa cosa anche la fosforilazione in tirosina, ma in questo caso è necessario che sia presente anche il bicarbonato. Questo ha fatto pensare che la fosforilazione serina/treonina rappresenti un marker di perdita di colesterolo da parte della membrana.

Incremento di calcio durante la capacitazione

Il calcio intracellulare può essere misurato tramite dei probes (Fura-2) la cui fluorescenza aumenta quanto si legano al calcio. Così è stato studiato cosa succede al calcio durante il processo di capacitazione: incremento spontaneo delle concentrazioni di calcio intracellulare e della responsività al progesterone (fa incrementare il calcio) durante incubazione in mezzo capacitante.

L’incremento della responsività al progesterone è relativo anche alla risposta acrosomiale, che non avviene nello spermatozoo capacitato, ma dopo. La risposta acrosomiale però non avviene se lo spermatozoo non è capacitato.

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Gradiente di bicarbonato

Quindi entra calcio, esce colesterolo dalla membrana e l’ultimo aspetto importante riguarda il bicarbonato. Il bicarbonato è uno dei costituenti fondamentali insieme all’albumina. Gli spermatozoi sentono un gradiente di bicarbonato durante il loro viaggio alla ricerca dell’ovocita, incontrando concentrazioni crescenti di bicarbonato (fino all’ovidotto, dove avviene la fecondazione). Se KO per proteine responsive al bicarbonato, questi topi sono infertili, inoltre cellule endometriali da donne con mutazione CFTR non promuovono la capacitazione.

Il bicarbonato ha tante funzioni: in particolare, va a stimolare l’adenilato ciclasi all’interno dello spermatozoo. Questa adenilato ciclasi fa incrementare i livelli di cAMP, ma non è la classica AC delle cellule somatiche. Il bicarbonato ha un ruolo di incremento di pH intracellulare, attraverso canali che estromettono ioni H+. Il bicarbonato è il primo step a cui seguirà la stimolazione della PKA che porterà ad un incremento di fosforilazione tirosinica.

• 1) Il bicarbonato entra nella cellula.
• 2) Stimola l’adenilato ciclasi specifica per gli spermatozoi, è solubile.
• 3) La sAC porta alla produzione di cAMP. Non è legata alla membrana e non è stimolata dalle proteine G come quelle di membrana.

Caratteristiche della sAC: se ne conoscono 2 isoforme, una inattiva che ha bisogno di un clivaggio enzimatico per portare alla forma attiva.

Una delle ipotesi è che la ciclasi solubile è libera di girare all’interno del citoplasma e quindi è capace di produrre cAMP dove serve, quindi a favorire il processo dove è necessario.

La forskolina è uno stimolante delle tmAC: il bic, ma non la forskolina, stimola la sintesi di cAMP negli spermatozoi.

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Quando si aggiunge bicarbonato: stimolazione della fosforilazione tirosinica si in AKAP3 che in diverse proteine, con effetto dose e tempo dipendente.

Il bicarbonato, ma non l’albumina innescano la motilità iperattivata durante la capacitazione.

Inoltre, il bicarbonato ha un ruolo nelle modificazioni del pH perché questo incremento di cAMP ha anche effetto di aprire canali che determinano estrusione di ioni (pH alcalino durante il processo di capacitazione. Questi scambiatori hanno un ruolo importante nello sviluppo della motilità.

Fosforilazione tirosinica

Durante la capacitazione avviene un incremento di fosforilazione tirosinica delle proteine che è spontaneo una volta nel mezzo capacitante. Probabilmente ruolo nella fecondazione dell’oocita: quando gli spermatozoi si legano alla zona pellucida dell’ovocita durante il processo di capacitazione sono fosforilati, ma poi vengono defosforilati quando penetrano l’oolemma, quindi sembrerebbe che la fosforilazione in tirosina in qualche modo faciliti il riconoscimento spermatozoo-oocita.

Inoltre, la fosforilazione di alcune proteine ha un ruolo di smascheramento e nel riversamento all’esterno di molecole che serviranno per il riconoscimento delle molecole sull’ovocita che mediano il processo di fecondazione.

L’aumento di calcio e fosforilazione tirosinica avvengono in parallelo.

➔ Che relazione c’è tra i due? L’eliminazione del calcio dal mezzo capacitante mostra

➔ sorprendentemente un aumento della fosforilazione tirosinica e all’aumentare delle concentrazioni di Ca diminuisce la fosforilazione tirosinica.

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Quindi l’assenza di calcio sembrerebbe attivare le tirosino-chinasi: due cose che incrementano in contemporanea sembrano in qualche modo danneggiarsi l’un l’altra.

➔ Il calcio, quindi, è necessario perché avvenga la capacitazione, ma tiene a freno la fosforilazione tirosinica attraverso una parziale inibizione delle TK o attivando fosfatasi. Ruolo di freno per impedire che la capacitazione avvenga troppo presto?

Tante proteine sono fosforilate durante il processo di capacitazione: un esempio sono le MAPK, delle quali aumenta fosforilazione e attività.

ROS

Bassi livello di ROS favoriscono in processo. Alti livelli sono dannosi ed inibiscono del tutto la motilità. Bassi livelli di ROS sono importanti, perché sono implicati nella fuoriuscita di colesterolo, nell’attivazione della sAC e ruolo nella fosforilazione tirosinica in quanto sembrano di inibire l’attività delle fosfatasi.

I sistemi KO per vedere se si riusciva a bloccare la capacitazione nel topo non sono serviti a niente.

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Processo maturati