Tecniche di fecondazione in vitro

Lezione 1

Prima di studiare le tecniche della fecondazione in vitro dobbiamo ricapitolare

i meccanismi che sono alla base della formazione dei gameti la loro

interazione e lo sviluppo dell’embrione.

riproduzione

La è una delle caratteristiche fondamentali che definiscono

gli organismi viventi dai non viventi. In termini evolutivi la misura del

successo evolutivo di un organismo è la quantità dei suoi geni che è

ancora presente nelle generazioni successive.

Il punto cruciale dell’esistenza di un individuo è dunque la riproduzione,

ovvero la trasmissione delle informazioni genetiche da una generazione a

quella successiva.

Ci sono 2 tipi di riproduzioni: sessuata e asessuata.

La riproduzione asessuale consiste nella la produzione di una prole la cui

totalità dei geni proviene da un solo genitore. La sua base cellulare è la

mitosi. La progenie è geneticamente identica al genitore e composta da

individui geneticamente identici, ovvero è un clone. Raramente possono

verificarsi differenze genetiche in seguito a mutazione. Così un organismo

pluricellulare come l’idra si riproduce per gemmazione, altri organismi,

come i policheti, per scissione.

La maggior parte degli animali produce però discendenti per riproduzione

sessuale. La riproduzione sessuale è la produzione di prole tramite

fusione di due gameti (uova e spermatozoo) a formare uno zigote

diploide; implica quindi due genitori, ognuno dei quali trasmette metà dei

suoi geni alla propria prole. La progenie ha una combinazione unica di

geni ereditati da entrambi i genitori. Il risultato è una maggiore variabilità

genetica: la progenie varia geneticamente dai propri fratelli e dai genitori.

Questa variazione genetica durante la riproduzione sessuale è dovuta alla

meiosi, tramite i processi di ricombinazione genica (crossing-over) e

assortimento indipendente degli omologhi, e alla fusione casuale dei

gameti. Quindi questa riproduzione crea nuovi genotipi e introduce

variabilità. Questa variazione genetica durante la riproduzione sessuale è

dovuta alla meiosi, tramite i processi di ricombinazione genica (crossing-

over) e assortimento indipendente degli omologhi, e alla fusione casuale dei

gameti. Quindi questa riproduzione crea nuovi genotipi e introduce

variabilità.

La differenza principale tra riproduzione asessuata e sessuata, e che

quella asessuata è più efficiente in termini di trasmissione dei caratteri

ereditari perché li trasmettiamo al 100% uguali; mentre quella sessuata

invece è inefficiente sotto questo punto di vista perché trasferiamo solo il

Tecniche di fecondazione in vitro: Lo scopo di queste lezioni sono la formazione dei

gameti in vitro e in vivo, ed degli impianti embrionali. Tecniche usate per superare problemi

dell’infertilità. 50% dei miei caratteri ereditari, e non sono neanche esatte (crossing

/

over).

Allora perché si è affermata la riproduzione sessuata?

Perché dall’interazione dei 2 genomi, quello paterno e materno, si ha la

possibilità di offrire una variabilità più elevata a livello dell ‘ambiente e quindi

avere maggiori possibiliti ai sopravvivenza quando le condizioni ambientali

sono sfavorevoli.

Gli organismi possono adottare diverse strategie per l’accoppiamento.

Strategie alternative nell’accoppiamento per riproduzione sessuata:

Esse sono diverse come: la sneaker, stupratori, suicidi, transessuali,

inversione permanente e inversione occasionale.

Esistono degli individui in cui la riproduzione è l’ultimo atto della loro vita,

perché richiede un elevata energia, e quindi concide con la morte, un

esempio sono i salmoni. La riproduzione è un obbiettivo primario per

moltissimi animali, e ci sono strategie differenti per effettuarla.

Il successo riproduttivo è la capacità che ha un individuo di riprodursi. Ad

è la femmina che sceglie il maschio

esempio in alcuni pesci, e non solo,

che gli darà sicuramente una prole sana (non sempre sceglie la femmina).

Ci sono poi maschi che arrivati a maturazione sessuale verranno

“scartati” dalle femmine perché non idonei nel dar loro una prole forte e

sana, quindi questi (detti sneaker o schiavo) aiuteranno il maschio

dominante a fare il nido e in cambio il maschio dominante gli fa fecondare

una piccola parte delle uova. Oppure ci sono pesci che investono le loro

energie solo nella riproduzione e non nell’accrescimento, quindi

raggiungono la maturità sessuale precocemente, e mentre il maschio

dominante e lo sneaker sono occupati a fare il nido insieme alla femmina,

durante l’ovulazione di quest’ultima, spruzza gli spermatozoi e se ne va.

Queste tecniche sono effettuate dagli organismi che hanno un fitness

riproduttivo basso e cercano altri modi per riprodursi.

Un altro esempio è quello dello scarafaggio, dove il maschio porta in

dono alla femmina. Anche in questo caso il maschio che non ha

possibilità di accoppiarsi con una femmina, inizia ad emettere fermioni

per attirare un maschio dominante, in questo modo gli ruba il dono che

avrebbe donato alla femmina e lo dona a sua volta ad un’altra femmina.

Cenni sulla La formazione degli spermatozoi avviene attraverso un processo detto

spermatogenesi e Spermatogenesi, che avviene all’interno del testicolo, mentre quella delle

ovogenesi, e sulla cellule uova è detta Ovogenesi ecc.

fusione di essi. La differenza principale tra ovogenesi e spermatogenesi è che la seconda

T

E

E

dura per tutta la vita mentre la prima no. Perché gli spermatozoi non

perdono la loro capacità di staminalità mentre gli ovociti la perdono allo

stadio di ovogoni.

La produzione di ovociti finisce con la menopausa (cioè non ci sono più

ovociti da ovulare). Alla nascita si ha già un numero limitato di follicoli

primordiali, che va a diminuire ancora di più fino alla pubertà.

Dalla pubertà fino alla menopausa vengono oculati solamente 400 ovociti.

Infertilità incapacità di ottenere una gravidanza per difetti anatomici

(mancanza dell’utero, una tuba occlusa, aspermia, lentezza spermatozoi

ecc.). Le cause dell’infertilitià sono aumentate agli giorni d’oggi. Infatti

l’infertilità al giorno d’oggi è molto comune a causa di stress, condizioni

ambientali, malformazioni anatomiche ecc.

Storia dell’embriologia: Ippocrate studia il problema della sterilità e

La sterilità e basandosi anche sulle esperienze degli egiziani, formula numerosi rimedi

infertilità sono un che vanno dai consigli dati agli uomini per concepire più efficientemente

cosa che riguarda alla diagnosi della sterilità . Per Ippocrate la sterilità poteva essere

l’epoca moderna o originata da diverse cause: 1) mal posizionamento della cervice 2)

c’è sempre stato? ammorbidendo della cavità dell’utero di origine congenita o acquisito 3)

ostruzione del canale cervicale dovuto all’amenorrea 4) aumentato flusso

mestruale 5)) prolasso uterino. I trattamenti erano numerosi: “Quando la

cervice è chiusa strettamente il foro interno deve essere aperto usando

un miscuglio speciale composto di nitrato rosso, di comino, di resina ed

di miele’ (Ippocrate, Le Malattie delle donne 94).

I greci non si limitavano all’uso di medicamenti ma avevano sviluppato

anche delle tecniche specifiche. Una di queste consisteva nel dilatare la

cervice per inserire una sonda cava all’interno dell’utero in cui venivano

versate delle sostanze emollienti (Ippocrate, Le Malattie delle donne 35).

Anton van LEEUWENHOEK (1632 - 1723), ricco mercante olandese di

tessuti, per valutare meglio la sua merce sembra avesse inventato un

sistema di lenti ottiche, prototipo del nostro microscopio. Van

Leeuwenhoek costruì centinaia di microscopi, formati da una sola lente

sferica, montata tra due piccole piastre di ottone. Il materiale da

osservare era sistemato sulla punta di uno spillo, all'altezza della lente; lo

spillo veniva fissato alla piastra superiore e regolato da due viti che

consentivano di variare la distanza del campione dall'obiettivo.

L'osservatore teneva lo strumento molto vicino all'occhio e guardava

attraverso la lente. Per ottenere ingrandimenti sempre maggiori, egli

costruì lenti di dimensioni via via più piccole, fino a 1-2 mm di diametro,

Riproduzione

Strategie di accoppiamento alternative nella riproduzione sessuata

capaci di ingrandire l'immagine di quasi 300 volte.

Grazie a questo strumento van Leeuwenhoek studiò e descrisse un'infinità

di oggetti: dalla trama minuscola dei tessuti ai semi e agli embrioni

vegetali, dall'anatomia di piccoli invertebrati ai globuli rossi e agli

spermatozoi. E' per questo che può essere considerato il padre della

microbiologia e l'iniziatore dell'istologia animale.

Leeuwenhoek e Hamm (1677) Osservarono per la prima volta gli

spermatozoi e formularono la teoria preformista Leeuwenhoek nel 1677

scoprì nel

seme umano “numerosi animaluncoli” e comunicò le sue osservazioni con

una timorosa lettera del novembre dello stesso anno ai nobili membri della

Società Reale di Medicina di Londra, i quali però accettarono con

entusiasmo la sua scoperta, invitandolo a continuare i suoi studi in altre

specie animali.

Leeuwenhoek osserva gli spermatozoi, li classifica e ne distingue di due

sessi, pensa che si accoppino nella stagione degli amori e che quelli

femmina diventino gravidi e partoriscano altri animaluncoli. La sua

scoperta degli spermatozoi (animalicula) diede sprone ad una schiera

autorevole di studiosi (animalculisti)che si opponevano all'altra teoria

preformista dell'ovismo.

Nel 1890 Walter Heape trasferisce con successo embrioni tra due

differenti specie di coniglio ( per la prima IVF animale bisognerà aspettare

il 1959 Chang)

Nel 1890 Robert Dickinson inizia esperimenti con sperma di donatore ,

anche in questo caso il suo lavoro viene fatto in segreto per evitare

l’opposizione della chiesa.

Nel 1897 il S.Uffizio risponde con un 'Non licet!' sulla moralità della

fecondazione artificiale. In clandestinità si fa di tutto e la procreazione

assistita viene praticata nella specie umana saltuariamente per lungo

tempo.

Nel 1927 si erano registrati 88 casi e dopo il 1930 l'uso se ne diffuse

rapidamente, particolarmente nei paesi anglosassoni

Nel 1930 studi sulla maturazione in vitro degli ovociti da parte di Pincus e

colleghi Vengono scoperti e studiati i principali ormoni della fertilità, vale a

dire le gonadotrophine non choriali follicolostimolanti (FSH) e

luteostimolanti (LH), la follicolina (ESTROGENI) e la luteina

(PROGESTERONE). Viene scoperta nell’urina anche la gonadotropfhina

chorionica (HCG) e vengono ideati i primi test biologici per la

determinazione del test di gravidanza, prima sui conigli e poi sulle rane. Si

inizia inoltre la terapia ormonale, estratti di giandole endocrine di animali

(maiali o cavalli).

1945 Prima pubblicazione sul British Medical Journal (BMJ), relativa ad

un’inseminazione artificiale con seme di donatore.

!951 Austin e Chang scoprono il ruolo essenziale della capacitazione

degli spermatozoi e la fecondazione in vitro si avvale delle tecniche di

“capacitazione in vitro” .

1959 Chang dimostra che ovociti fecondati in vitro si sviluppano

normalmente 1955 Vengono pubblicati i risultati relativi a quattro

gravidanze ottenute

utilizzando seme crioconservato.

1960s IVG GOLDEN AGE Grosso incremento delle conoscenze relative

alla stimolazione ovarica , sulla maturazione degli ovociti, fecondazione ,

sviluppo degli embrioni in vitro e delle tecniche di laparoscopia.

1969 Si ottiene la prima fecondazione in vitro umana.

1977 Prima gravidanza da IVF ( ectopica).

1978 Nascita di Louise Brown

Un Embriologo prima aveva le seguenti competenze:

• Conoscenze e sistemi di coltura che derivavano da modelli animali

• molti provenivano dalla ricerca di base

• Embriologia sperimentale

• Biologia cellulare

• Veterinaria

• Colture cellulari e microscopia

Competenze di un Embriologo clinico oggi sono:

• Fisiopatologia dell’infertilità maschile e femminile

• Analisi e valutazione dei gameti

• Colture cellulari

• Micromanipolazione

• Criopreservazione

• Genetica

• Biologia Molecolare

• Proteomica

• Microbiologia e Virologia

• Endocrinologia

• Gestione e organizzazione del laboratorio di riproduzione

• Norme e decreti che regolano l’attivita della PMA

Lezione 2

Le Tecniche di Riproduzione Assistita (TRA) comprendono una serie di

metodiche atte a superare eventuali condizioni presenti nella coppia che

ostacolano completamente o parzialmente la possibilità di concepire

naturalmente. La condizione di infertilità, definita come incapacità di

concepire dopo due anni di rapporti intenzionalmente fecondi in età

riproduttiva, interessa circa il 12-15% delle coppie. E' quindi un problema di

dimensioni sociali che oltre alla valenza sanitaria ne possiede altre di ordine

psicologico, familiare, personale e relazionale. In Italia si stima che oltre

45.000 nuove coppie ogni anno siano destinate ad incontrare difficoltà

riproduttive durante la loro vita coniugale. Queste coppie, nel loro insieme,

rappresentano la cosiddetta popolazione infertile.

①

Quindi nel caso di una popolazione infertile può essere suddivisa in 3 casi:

- Sterilità, cioè l’impossibilità di concepire spontaneamente. La sterilità maschile è

legata all’assenza di spermatozoi nell’eiaculato o all’assenza dello stesso eiaculato;

mentre la sterilità femminile è legata a problemi anatomici come assenza di utero, di

tube, tube ostruite oppure a disordini ovulatori o endocrini.

- Subfertilità, in cui non c’è una impossibilità nel concepire ma è ridotta da un punto

di vista probabilistico perché invece di ovulare normalmente ovuliamo un mese sì e

due no e invece di avere un numero adeguato di spermatozoi ne abbiamo un

numero particolarmente ridotto.

- Infertilità idiopatica (o sterilità idiopatica), è senza causa apparente cioè non

sappiamo in realtà quale sia la reale causa. Coinvolge spesso il 20-25% dei casi di

sterilità che noi osserviamo.

Ovviamente l’inizio della ricerca di figli è valida per una coppia in età giovane,

mentre se consideriamo coppie diciamo di 40anni il lasso di tempo nel tentare di fare

un figlio sarà molto più breve.

Diagnosi sterilità: per il partner maschile abbiamo l’azoospermia (l’assenza di

spermatozoi nell’eiaculato), l’anaeiaculazione (non si ha emissione del liquido

seminario all’esterno) e l’eiaculazione retrograda (disturbo in cui l'eiaculato viene

immesso nella vescica anziché fuoriuscire dall'uretra peniena, si ha comunque

eiaculazione). Per il partner femminile riguardano disfunzioni anatomiche o ormonali.

:

(È una patologia)

Oggi è indicato che il valore minimo per essere considerato ancora normali è di circa 18 milioni di

spermatozoi per ml tenendo presente che nella metà del secolo scorso una condizione normale era una

condizione in cui l’uomo deve avere almeno 80 milioni di spermatozoi per ml.

Qual è la probabilità della gravidanza spontanea in coppie con infertilità idiopatica?

Tecniche di PMA (procreazione medicalmente assistita):

- STW - MESA - TESE, è una tecnica che permette il recupero degli spermatozoi

dall’epididimo (organo che permette la maturazione finale degli spermatozoi). Andrò

ad effettuare questa tecnica nel caso in cui mi trovassi di fronte un paziente che

non emette spermatozoi, e attraverso un indagine clinica, posso stabilire che

probabilmente non li emette perché i dotti escretori sono occlusi. Quindi questo

paziente produce spermatozoi ma se poi non ha la possibilità di riversarli

all’esterno, io posso andare a recuperare nell’epididimo o nel testicolo gli

spermatozoi.

- FIV o FIVET (fecondazione in vitro embriotransfer), cioè faccio la fecondazione in

vitro e poi trasferisco l’embirone nell’utero.

- ICSI (Iniezione Intracitoplasmatica dello Spermatozoo), con questa tecnica si

prende un singolo spermatozoo e attraverso l’utilizzo di micromanipolatori si

inserisce lo spermatozoo all’interno dell’ovocita. Chiaramente nel momento stesso

in cui gli spermatozoi e abbiamo recuperato dal testicolo, che vedremo essere

spermatozoi immobili, l’unica possibilità di poter fecondare e vendere questo

singolo spermatozoo e iniettarlo direttamente nell’ovocita.

N.B: se invece di avere un fattore maschile lieve moderato ho un fattore maschile

severo, non posso usare la tecnica FIV ma devo usare la ICSI perché in qesto caso

gli spermatozoi sono immobili o si muovono male, quindi nonostante siano presenti

nell’eiaculato abbiamo bisogno della tecnica ICSI per fecondare. Nel caso del

Fattore tubarico si utilizza invece la FIV perché l’ostacolo è rappresentato dalla

tube che sono occluse, quindi l’ovocita non potrà scendere e lo spermatozoo non

potrà salire, ma se prendo l’ovocita e dopo averlo fecondato lo riposiziono nell’utero

il problema è risolto. Nel caso dell’ infertilità idiopatica si possono fare entrambe, e

ciò dipende dal caso, anche se molto spesso si preferisce la ICSI; poi nel caso dell’

infertilità immunologica, cioè quando gli spermatozoi vengono riconosciuti e

attaccati dagli anticorpi della donna perché considerati c