Tecniche indagine

Tecniche d’indagine

L’analisi morfologica prende in esame l’organizzazione strutturale delle cellule attraverso microscopi ottici (impiego della luce) ed elettronici (impiego degli elettroni).

Microscopia ottica

Si basa sull’interazione tra un raggio luminoso ed il campione in esame. Può essere usato per le cellule vive, quindi possiamo esplorare i processi come la divisione cellulare e il movimento delle cellule. Il potere di risoluzione, ovvero la capacità di distinguere come separati due punti molto vicini tra di loro, è di 0.2 micrometri (è quindi possibile vedere un batterio ma non un virus).

Tipologie di microscopi ottici

• Microscopio a contrasto di fase: sfrutta al massimo le piccole differenze nell’indice di rifrazione dei vari elementi cellulari, rendendoli visibili e consentendo l’osservazione di cellule viventi non colorate. Le onde luminose, durante il loro passaggio attraverso i nuclei delle cellule, il citoplasma o l'acqua, vengono leggermente sfasate, perché questi mezzi hanno indici di rifrazione leggermente diversi. Quanto maggiore è l'indice di rifrazione di un mezzo, tanto minore è la velocità della luce nel mezzo stesso. Come conseguenza, un'onda luminosa passata attraverso un nucleo di una cellula è in ritardo rispetto alle onde luminose che sono passate solamente attraverso l'acqua. L'importo di questo "ritardo" viene definito differenza di fase. Prima di entrare nel preparato le onde luminose sono ancora "in fase", ma non più dopo essere passate attraverso i diversi materiali.
• Microscopio a luce polarizzata: utilizza la luce polarizzata che vibra in un solo piano e si può quindi distinguere un oggetto isotropo (se trasmette la luce con la stessa velocità in tutte le direzioni) da uno birifrangente.
• Microscopio interferenziale di Nomarski: utilizza luce polarizzata che tramite un prisma viene scissa in due raggi divergenti.
• Immunoistochimica: tecnica in grado di individuare specifiche molecole basandosi sulla specificità della reazione antigene/anticorpo. Gli anticorpi specifici vengono coniugati con una sostanza fluorescente o con una proteina, la ferritina, o marcati con particelle d'oro. Le sezioni di tessuto sono poi esposte all’anticorpo in modo che questo si leghi solo nei siti del tessuto in cui è presente l’antigene. Il metodo indiretto consiste invece nel far reagire l’anticorpo con un altro anticorpo non marcato e successivamente, una volta formato il complesso antigene-anticorpo, si fa reagire con un altro anticorpo ma questa volta marcato. L’anticorpo secondario viene quindi identificato per mezzo dell’enzima perossidasi, questo enzima può essere coniugato con l’anticorpo secondario e successivamente rivelato per mezzo di una reazione istochimica usando come substrato la diaminobenzidina e acqua ossigenata. La rivelazione avviene dopo la precipitazione del colorante.
• Microscopio a fluorescenza: utilizza luce ultravioletta e la sorgente luminosa è una lampada a vapori di mercurio che emette queste radiazioni UV. La fluorescenza è quindi la proprietà di alcune sostanze di assorbire radiazioni UV ed emettere radiazioni visibili. Poiché parte dell’energia assorbita viene ceduta sotto forma di calore dagli elettroni instabili che tendono a ritornare al loro punto di partenza, la luce emessa avrà un’energia minore di quella eccitante e di conseguenza una maggiore lunghezza d’onda per questo rientra nel campo del visibile. La fluorescenza può essere naturale se prodotta da sostanze presenti nel tessuto (ad esempio la vitamina A, la riboflavina, le porfirine e la clorofilla) o secondaria se indotta da colorazione (l’arancio di acridina con cui il DNA si presenta verde/giallo e l’RNA rosso/arancione). Un tempo la lampada a vapori era posta sotto il condensatore per cui la luce attraversava il preparato eccitandolo, la luce UV veniva fermata prima di arrivare agli osservatori.