Tecniche indagine

Microscopio a contrasto di fase : sfrutta al massimo le piccole differenze

 nell’indice di rifrazione dei vari elementi cellulari, rendendoli visibili e

consentendo l’osservazione di cellule viventi non colorate. Le onde luminose,

durante il loro passaggio attraverso i nuclei delle cellule, il citoplasma o l'acqua,

vengono leggermente sfasate, perchè questi mezzi hanno indici di rifrazione

leggermente diversi. Quanto maggiore è l'indice di rifrazione di un mezzo, tanto

minore è la velocità della luce nel mezzo stesso. Come conseguenza, un'onda

luminosa passata attraverso un nucleo di una cellula è in ritardo rispetto alle

onde luminose che sono passate solamente attraverso l'acqua. L'importo di

questo "ritardo" viene definito differenza di fase. Prima di entrare nel preparato

le onde luminose sono ancora "in fase", ma non più dopo essere passate

attraverso i diversi materiali.

Microscopio a luce polarizzata: utilizza la luce polarizzata che vibra in un solo

 piano e si può quindi distinguere un oggetti isotropo ( se trasmette la luce con

la stessa velocità in tutte le direzioni) da uno birifrangente.

Microscopio interferenziale di Nomarski: utilizza luce polarizzata che tramite un

 prima viene scissa in due raggi divergenti.

Immunoistochimica: tecnica in grado di individuare specifiche molecole

 basandosi sulla specificità della reazione antigene/anticorpo. Gli anticorpi

specifici vengono coniugati con una sostanza fluorescente o con una proteina, la

ferritina, o marcati con particelle oro. Le sezioni di tessuto sono poi esposte

all’anticorpo in modo che questo si leghi solo nei siti del tessuto in cui è

presente l’antigene il metodo indiretto consiste invece nel far reagire l’anticorpo

con un altro anticorpo non marcato e successivamente, una volta formato il

complesso antigene-anticorpo si fa reagire con un altro anticorpo ma questa

volta marcato. L’anticorpo secondario viene quindi identificato per mezzo

dell’enzima per ossidasi, questo enzima può essere coniugato con l’anticorpo

secondario e successivamente rivelato per mezzo di una reazione istochimica

usando come substrato la diaminobenzidina e acqua ossigenata. La rivelazione

avviene dopo la precipitazione del colorante.

Microscopio a fluorescenza: utilizza luce ultravioletta e la sorgente luminosa è

 una lampada a vapori di mercurio che emette queste radiazioni UV. La

fluorescenza è quindi la proprietà di alcune sostanze di assorbire radiazioni UV

ed emettere radiazioni visibili. Poiché parte dell’energia assorbita viene ceduta

sotto forma di calore dagli elettroni instabili che tendono a ritornare al loro

punto di partenza, la luce emessa avrà un’energia minore di quella eccitante e

di conseguenza una maggiore lunghezza d’onda per questo rientra nel campo

del visibile. La fluorescenza può essere naturale se prodotta da sostanze

presenti nel tessuto ( ad esempio la vitamina A, la riboflavina, le porfirine e le

clorofilla) o secondaria se indotta da colorazione( l’arancio di acridina con cui il

DNA si presenta verde/giallo e l’RNA rosso/arancione). Un tempo la lampada a

vapori era essa sotto il condensatore per cui la luce attraversava il preparato

eccitandolo, la luce UV veniva fermata prima di arrivare agli oculari, questo

sistema veniva chiamato ipofluorescenza. Attualmente si usa la tecnica

dell’epifluorescenza nel quale il preparato viene eccitato dall’alto.

Nell’imunofluorescenza noi facciamo reagire un anticorpo con un antigene il

 complesso che si crea è costituito da un anticorpo primario non marcato.

Successivamente l’anticorpo secondario ( questa volta marcato e che quindi

sarà quello visibile al microscopio) si lega al complesso precedentemente

creato. Se vogliamo distinguere due organelli diversi come ad esempio un

mitocondrio e un nucleo sarà necessario usare due anticorpi primari che

provengono da diversi animali (ad esempio uno di topo e uno di coniglio). In

questo modo l’anticorpo primario si lega al suo antigene e quello secondario

che non è più in grado di riconoscere l’antigene e quindi di distinguere i due

diversi organelli si lega al giusto anticorpo perché distingue i due animali diversi

da cui essi provengono. E quindi si crea un anticorpo secondario ad esempio

generato dalla capra ed è anticoniglio in questo modo siamo sicuri si leghi

all’anticorpo primario del coniglio.

Ibridazione in situ: per la localizzazione degli acidi nucleici si usa questa tecnica

 che si basa sullla complementarietà tra le sequenza ed è svolto all’interno dei

tessuti in modo conservativo. Si parte dalla ricerca sul computer di una

sequenza che si possa legare a quella complementare a quella del mRNA che ci

serve. Anche in questo caso è possibile usare poi la fluorescenza.

Microscopio confocale: si usa un laser per scannerizzare l’oggetto, con questa

 tecnica si ha una risoluzione molto più alta rispetto al convenzionale

microscopio ottico. Focalizza un solo piano per volta e dall’unione delle

immagini produce immagini in 3D ci permette di visualizzare specifiche proteine

e strutture all’interno delle cellule e vederle muovere. Questo microscopio

consente la visione di cellule e tessuti in vivo. Le tecniche utilizzate sono quella

del FRAP che misura la mobilità molecolare ( si avvale del fotosbiancamento

delle molecole fluorescenti di una definita zona tramite un’intensa

illuminazione) e quelle del FRET che invece studia le interazioni

molecolari(trasferimento di energia da una prima molecola fluorescente ad

un’altra che si trova fisicamente vicina al fluoro cromo eccitato. In altre parole la

tecnica FRET, che può essere usata solo per piccole distanze, permette di

studiare l’interazione tra proteine partendo dalla loro struttura. La FRAP si basa

sullo spegnimento locale della fluorescenza; se io spengo con un laser

un gruppo di proteine ed in seguito noto che la fluorescenza in quel punto è

tornata l’unica spiegazione possibile è che proteine prima fuori dalla zona

spenta si sono spostate.

Le fasi del processo di osservazione di cellule e tessuti uccisi sono:

Fissazione: serve a preservare la struttura protoplasmatica e si basa su un

 trattamento chimico che uccide rapidamente la cellula attraverso fissativi

chimici che coagulano le proteine come ad esempio l’alcol etilico, l’acido

acetico, soluzioni di bicloruro di mercurio ed altri che non le coagulano come

l’acido osmico e la formalina. Altri sono invece i fissativi fisici che si basano sul

congelamento o riscaldamento.

Inclusione e sezionamento: tagliare il tessuto di sezioni di 10 micrometri con

 l’uso del microtomo. Per effettuare sezioni così sottili si cerca di dare maggiore

consistenza con sostanze come la paraffina, la celloidina o resine plastiche.

Volendo effettuare sezioni senza fissazione è possibile congelare il tessuto.

Colorazioni istologiche: la più usata è l’ematossilina- esosina con la quale i

 nuclei si colorano di blu scuro e il resto come ad esempio il citoplasma di rosa.

Un’altra tecnica è quella della colorazione tricomica secondo Azan che usa

l’arangio G per il citoplasma e il blu di anilina o di metile per le fibre di

collagene.

Microscopia elettronica: il campione in esame viene colpito da un fascio di elettroni

e non è in grado di esaminare il materiale vivente. La risoluzione è 2000 volte meglio

rispetto a quella del microscopio ottico (0.1 nm) .

Microscopio ad alto voltaggio: gli elettroni accelerati vengono utilizzati per

 ottenere un’immagine ingrandita attraversando la sezione di tessuto. Immagine

in 2 dimensioni.

Microscopio a scansione:la superficie precedentemente fissata viene rivestita da

 uno strato di metalli pesanti come l’oro. Ciò consente l’identificazione degli

elementi del campione. Ha una risoluzione minore ma l’immagine è visibile in

3D.

Allestimento dei campioni:

Fissazone: si utilizza principalmente il tetrossido di osmio e la glutaraldeide

 Disidratazione: in concentrazioni crescenti di alcol etilico o acetone

 Inclusione e sezionamento: per ottenere sezioni molto sottili si usano mezzi di

 inclusione tra cui i monomeri acrilici o resine epossidiche

Colorazione o contrasto: si utilizzano sali di atomi pesanti come l’acetato di

 uranile ed il citrato di piombo

Le caratteristiche molecolari possono essere valutate tramite specifici metodi d’analisi

biochimica-molecolari quali la Citochimica : utilizza tecniche per localizzare sostanze

all’interno della cellula per poi risalire alla composizione chimica e l’ Istochimica:

stesso tipo di analisi che prefigge di localizzare sostanze chimiche non solo nelle

cellule ma anche nei componenti extracellulari.

I metodi di colorazione utilizzati sono specifici:

l’identificazione dei lipidi avviene mediante alcuni coloranti liposolubili. Infatti i

 lipidi si sciolgono totalmente nei solventi. I coloranti più usati sono Sudan nero

B, Sudan III, solfato di blu Nilo.

Per evidenziare i polisaccaridi si usa la reazione PAS ( acido periodico - Schiff).

 In questa reazione di usa il reattivo di Schiff dato da fucsina basica (rossa)

ridotta e decolorata con acido solforoso. Tramite una preventiva ossidazione

con acido periodico, i gruppi glicolici vengono trasformati in gruppi aldeidici che

interagendo con la fucsina la riossidano portandola alla intensa colorazione

rossa. La metacromasia è la proprietà chimico-fisica di alcuni coloranti basici di

colorare tessuti con una tinta diversa dalla propria. Esistono infine le lectine

ovvero proteine che riconoscono specifici zuccheri, così le lectine coniugate a

specifici marcatori (fluorocromi, perossidasie oro) consentono la loro

localizzazione con diversi tipi di microscopi fornendo anche informazioni sulla

loro composizione.

Con la clorazione istochimica è possibile osservare il prodotto della reazione

 substrano/enzima ma non l’enzima

Acidi nucleici: per la loro presenza di numerosi radicali fosforici presentano

 spiccata affinità per i coloranti basici (azzurro B, blu di toludina ecc). Si ricorre

spesso alla reazione di Feulgem che è simile a quella di PAS: le sezioni di

tessuto fissato sono prima sottoposte idrolisi acida blanda con HCl ciò

allontana l’RNA e le purine del legame glucosidico del DNA smascherando i

gruppi aldeidici che reagiscono con il reattivo di Schiff, così le zone contenenti

DNA appaiono colorate in rosso mentre il nucleo e il citoplasma restano incolori.

Colture primarie:

sistemi artificiali in cui cellule singole o frammenti tessutali continuano a sv