Tecniche avanzate di indagine biomedica

○ ELETTROFORESI CAPILLARE E RP-HPLC

○ cromatografia per affinità

● Caratterizzazione e identificazione: spettrometria di massa. È una tecnica analitica (quello che viene inserito

nello spettrometro di massa viene perso) basata sulla formazione di ioni in fase gassosa ed una loro eventuale

successiva frammentazione (avviene a livello della sorgente. EOgni sorgente è specifica per uno spettro di

ionizzazione). Bisogna procedere con la separazione del cluster sulla sorgente in base al rapporto

massa/carica, che avviene a livello dell’analizzatore (ce ne sono diversi a seconda di cosa stiamo analizzando).

Ci sarà un sistema in grado di convertire l’informazione grazie al rilevatore che genera segnali elettrici

proporzionali al numero di ioni. Il sistema di elaborazione registra i segnali elettrici e li converte in uno spettro

di massa. Dalla spettrometria ottengo dei frammenti tali che mi permettono di risalire alla proteina che voglio

analizzare. 39

Determinazione del peso molecolare delle proteine

MALDI-ROF è una tecnica che sfrutta l’energia di un raggio laser per vaporizzare e ionizzare macromolecole. Le

proteine sono efficacemente ionizzabili con questo sistema. Il laser colpisce una matrice che è in grado di ionizzarsi

molto velocemente e di cedere/acquisire protoni alla molecola di interesse. Con questa tecnica non ho bisogno di una

separazione cromatografica, in quanto il campione viene caricato su una piastra (che può contenere fino a 96

campioni) che viene introdotta nel MALDI e si procede con l’azione del raggio laser in modo da generare il cluster di

ioni, che vengono accelerati in un tubo di volo. Durante il tempo di volo, si creano diversi pacchetti di ioni con pesi

molecolari distinti. Più lo ione è piccolo più questo si muove velocemente. Al detector si ha quindi una notevole

distinzione tra le carie molecole in base al peso molecolare. La precisione è tale che si può ottenere nonostante non

sia stata effettuata una grande purificazione iniziale.

TOF è un analizzatore disegnato per macromolecole macromolecole, come le proteine, e può arrivare ad analizzare

molecole con PM fino a 1000kD.

Nel grafico si mette in relazione l’intensità del segnale, ossia quantità di ioni che si sono formati, con il peso molecolare.

Mediante questa tecnica possiamo ottenere anche le varie interazioni delle proteine con altre proteine, lipidi o DNA.

Incubando il probe con la proteina, si può osservare che si hanno ancora i due segnali separati della proteina e del

probe, ma si ha la presenza di un terzo segnale che è dato dalla somma dei pesi molecolari della proteina e del probe

separati. Ecco che proteina e probe interagiscono tra loro.

ELECTROSPRAY in questo caso si ha alle spalle una separazione cromatografica mediante colonna HPLC. Normalmente

i sistemi tamponi usati per HPLC sono incompatibili con la ionizzazione e quindi devono essere separati, ma per molto

tempo tale processo non è stato molto fattibile. Ad oggi si usano spray, dove il liquido che esce dall’HPLC ha un’alta

pressione, viene forzato ad entrare in un capillare col diametro di un micron e in questo modo si forma la spray. La

fase mobile diventa molto facile da separare in quanto evapora. L’ago da dove fuoriesce lo spray è carico e durante lo

“spruzzo” permette anche di ionizzare le molecole della fase mobile.

Mediante l’analizzatore, la separazione degli ioni avveniva mediate campo elettrico o campo magnetico. Per molecole

molto grandi, come le proteine, si dovevano generare campi elettrici molto grandi, ma ciò non era possibile. Avendo

molecole che sono in grado di acquisire tanti protoni, il rapporto m/z diminuisce, in questo modo si fa “vedere”

all’analizzatore un valore più basso e quindi si possono analizzare molecole molto più grandi. Si è dovuto usare un

sistema ad alta energia in modo da generare una serie di specie dove z è diverso da 1. Ecco che si è sviluppata

l’electroSpray Ionization ESI. Si ottengono una serie di segnali che non sono frammenti, ma che rappresentano la stessa

proteina con un diverso numero di protoni. Mediante algoritmi si può procedere con il calcolo del numero di protoni

associato a ciascun segnale, la carica e il rapporto massa/carica in modo da ottenere il peso molecolare della proteina.

Identificazione di proteine ovvero quando il peso molecolare non basta

Nel caso in cui la proteina non sia presente nella banca dati perché mutata, cambio approccio e uso il peptides mass

fingerprint. Sfrutta il fatto che a seguito di una digestione enzimatica di una proteina, i peptidi che si formano sono

sempre gli stessi a seconda della proteasi che si usa. In questo caso si può procedere con l’elettroforesi, si taglia l’area

corrispondente alla proteina e la si fa digerire con l’enzima scelto. Si procede con l’estrazione dei peptidi e mediante

spettrometri di massa si ottiene un elenco dipesi molecolari che sono riferibili ai peptidi che si ottengono dalla

digestione. Mediante le banche dati posso quindi risalire alla proteina.

Tra le proteasi più utilizzate troviamo: chemotripsina, elastasi, tripsina e carbossipeptidasi.

Ci sono dei programmi che mediante la sequenza della proteina possiamo ottenere i pesi molecolari dei vari peptidi

che si formano a seguito della digestione. Andando a confrontare i valori con il tracciamo cromatografico si vede che

non siamo in grado di stabilire dove i vari peptidi che si vedono a che livelli siano nella proteina. Procedendo con una

digestione enzimatica successiva, posso mettere a confronto i vari peptidi ottenuti dalle due digestioni e in questo

modo ricostruire la sequenza del peptide.

Identificazione delle proteine: il sequenziamento

TANDEM MASS SPECTROMETRY spettrometro di massa con due sistemi che lavorano in tandem: Ogni specie

molecolare della miscela può essere isolata nella prima regione sulla base del suo rapporto massa/carica (ione genitore

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o precursore). Una volta isolato, ogni ione selezionato entra in camera di collisione dove viene frammentato,

generando gli ioni figlia o prodotto. Gli ioni prodotto, rappresentativi dello ione precursore (la molecola di interesse),

vengono focalizzati in un secondo spettrometro di massa dove vengono isolati, ordinati e quantificati. La frattura

interviene a livello del legame peptidico. In base al peso dell’aa che perdo riesco a determinare chi sta al C-t.

Procedendo in sequenza di sapendo che ogni frammento che si genera differisce da quello prima per un aa, posso

risalire alla sequenza.

Nel caso in cui si abbia una fosforilazione a livello di un aa si otterrà il peso dell’aa + 80 (peso del fosfato) allora a quel

livello ci sarà un sito di fosforilazione.

Identificazione delle proteine

Come si può arrivare all’identità CERTA di una proteina?

1- Determino sperimentalmente TUTTE le informazioni riguardanti la/le proteina/e: approccio integrale

2- Determino sperimentalmente PARTE delle informazioni riguardanti la(le) proteina(e) e da queste cerco di ricavare

le informazioni mancanti: approccio per approssimazione

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16/11/2017

Misure di Ca2+ imaging con Fluo-2 in cellule del

pacemaker cardiaco

Nodo del seno e nodo atrioventricolare hanno frequenze intrinseche molto simile anche l’origine embrionale di queste

cellule è molto simile.

Le fibre del Purkinje hanno una frequenza intrinseca più lenta rispetto a quelle del NSA, ma hanno origine embrionale

diversa. Sono dei miociti ventricolari che alla fine dello sviluppo, prima della nascita, riprendono un’attività automatica.

La forma del potenziale d’azione di queste cellule è molto simile a quella dei centri non automatici.

Il potenziale d’azione cardiaco

(ventricolare) presenta la fase di salita, la

fase di plateau e la fase 3 di

ripolarizzazione (nella fibra di Purkinje

ha una fase 2 più lunga). Il potenziale

d’azione è data da una variazione di

apertura dei canali ioni, dove vi è

un’enorme variabilità dei canali di

potassio (fino ad una decina di famiglie

diverse). La fase zero di salita è dovuta ai

canali del sodio voltaggio dipendenti. La

fase 2 è data dall’attivazione delle

correnti di calcio di tipo L, che viene

generata dai canali di calcio di tipo L che

si distinguono da tutti gli altri per la loro

sensibilità alle diidropiridine

antagoniste. Esistono anche

diidropiridine agoniste che attivano il canale e prolungano anche il tempo di apertura del canale.

Quando il calcio entra nella cellula viene prontamente tamponato dalla calmodulina, che è il legante più prossimale

per il calcio. Ciò indica che all’interno della cellula abbiamo due tipologia di calcio: calcio libero e calcio legato ai

tamponi. Quando si procede con lo studio di calcio a

livello intracellulare, si procede con l’utilizzo di

traccianti, che sono dei tamponi, che però sono legati a

dei fluorocromi in modo da poter osservare il

comportamento del tampone e di dedurre la dinamica

del calcio nel tempo.

Cellule ventricolare: il calcio è necessario per la

contrazione cardiaca. La concentrazione di calcio

all’interno della cellula deve essere finemente

controllata in quanto può innescare diversi tipi di morte

cellulare. Il calcio viene quindi immagazzinato a livello

del RS, dei mitocondri che usa calcio per generare ATP

e infine il sistema dei miofilamenti. Ad ogni momento,

l’influsso di calcio nella cellula deve essere uguale al suo

efflusso. (Ciò è garantito dai canali di calcio di tipo L per l’influsso), mentre per l’efflusso il calcio viene pompato dalla

pompa SERCA, l’uniporto di calcio a livello mitocondriale, scambiatore sodio-calcio a livello della membrana che

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funziona in relazione allo scambio di ioni sodio, che determina una lenta corrente depolarizzante. L’efflusso di calcio

deve garantire livelli di calcio liberi bassi a livello citosolico. Può succedere che lo scambiatore sodio calcio funzioni in

maniera opposto, durante la fase di salita nella fibra di Purkinje.

I meccanismi di influsso: dal lato extracellulare sono i canali di tipo L, dal lato intracellulare vi sono: i recettori

dell’inositolo 3-p e il recettore della rianodina. I recettori per l’inositolo 3-p permettono l‘influsso di calcio e sono

localizzati a livello del RE, mentre il calcio che esce dal RyR contribuisce alla contrazione cardiaca, ma questo rilascio

di calcio viene liberato in funzione del calcio citosolico e luminale.

Spazio diadico: spazio tra il canale L e RyR.

Si conoscono mutazioni patologiche per il recettore RyR2 (cardiaco) si hanno sensibilità al calcio spostate causando

aritmie cardiache ventricolari gravi. il RS è disposto in modo caotico. È costituito da cisterne e alcune zone

sono in prossimi