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Tecniche avanzate di indagine biomedica

Appunti di Tecniche avanzate di indagine biomedica basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni del prof. Di Francesco dell’università degli Studi di Milano - Unimi, facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Tecniche avanzate di indagine biomedica docente Prof. D. Di Francesco

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ESTRATTO DOCUMENTO

Microscopia elettronica a trasmissione convenzionale

Cit b5 ha un’isoforma di reticolo e una mitocondrionale. N-t contiene attività catalitica ed è coinvolta nella biosintesi

del colesterolo, nella desaturazione degli acidi grassi e nella riduzione del cit p450.

Volendo studiare i meccanismi di trasporto di cit b5 era stata generata una proteina chimerica al cui N-t era stata fusa

una GRP. Sono state trasfettate in CV1 e COS7. Overesprimendo il costrutto all’interno delle varie linee cellulari, si

generavano dopo diverse ore, una serie di aggregati citoplasmatici ricchi di cit b5. Cosa sono questi aggregati? La

proteina aggrega quando è ancora solubile oppure successivamente, quando finisce nella membrana target? La

proteina aggrega quando è già associata all’involucro nucleare, gli aggregati sono costituiti da membrane del RE ed

erano in continuità con il RE e le proteine erano libere di diffondere tra le membrane e il reticolo.

Diagnosi ultrastrutturale di alcuni tipi di tumori ed altre applicazioni in medicina

Tumori neuroendocrini

I lipidi vengono completamente solubilizzati nei solventi organici e non si riesce neanche a fissarli

Il solo modo che si ha per preservare il tessuto e poterlo osservare avviene mediante perfusione.

Nella maggior parte dei casi i tessuti vengono fissati con

fissativi chimici. 26

High pressure freezing

Congelo tutte le componenti nello stesso momento e in teoria si dovrebbe garantire una fissazione immediata.

Tuttavia con il congelamento le molecole di acqua aumentano di volume che diventa artefattuale a livello biologico.

La taglia di questi artefatti di acqua cristallizzata è visibile a livello microscopico. Si è quindi generato il ghiaccio amorfo.

Alla fine degli anni ’80 si è visto che se il congelamento lo porto a pressioni (2050bar) diverse e abbasso le temperature

di congelamento, si crea il ghiaccio amorfo o ghiaccio vetroso. Questi sono dei nano cristalli di ghiaccio che sono più

piccolo di 10-15nm che non sono più in grado di essere visualizzati con il microscopio. L’acqua non ghiaccia ma

pietrifica.

Criopreservazione del campione

La criopresevazione è garantita solo per campioni molto piccoli. L’acqua nel campione viene sostituita per

sublimazione in un campione già fissato precedentemente.

27

Il SEM

Microscopio elettronico a scansione. Si possono fare ricostruzioni tridimensionali. Vi saranno elettroni secondari

perché non potrò usare sempre composti metallici. 28

26/10/2017

Elettroforesi capillare

Sviluppo della tecnica

 1937: AWK Tiselius, elettroforesi di proteine in soluzione

 1967: Prima descrizione CE

- Hjerten S. Chromatogr Rev 1967;9:122.

 1981: Sviluppo della tecnica nella forma attuale

- Jorgenson JM et al. Anal Chem 1981;53:1298.

 1989: Diffusione dei primi strumenti commerciali

 2000: Introduzione nei laboratori di analisi cliniche

- Proteine del plasma

- CDT

- Emoglobine

È conosciuta con tanti nomi e acronimi:

 Elettroforesi capillare (CE)

 Elettroforesi capillare zonale (CZE)

 Elettroforesi capillare in soluzione libera (FSCE)

 Elettroforesi capillare ad elevata risoluzione (HPCE)

L’elettroforesi viene condotta in fase libera, direttamente nel tampone elettroforetico. Il report è diverso da quello

tradizionale, si vedono infatti dei picchi.

 L’elettroforesi è condotta in tubi capillari riempiti con tamponi

 Non viene utilizzato nessun tipo di supporto

 Elevata risoluzione

 Completa automazione e analisi dati simile a HPLC

Il capillare è posizionato con le due estremità

all’interno del tampone, vi sono due elettrodi, dove

l’anodo è posizionato all’interno della provetta che

contiene l’estremità del capillare che fa da

“ingresso”. Collegato ai due elettrodi vi è un

generatore di tensione. Il rilevatore è posizionato

verso il lato catodico del capillare, ossia nella

finestra del capillare. Il rilevato è collegato ad un

computer in modo da permettere l’analisi dei dati.

 Riempire il capillare con il tampone di corsa

 La provetta viene sostituita con la provetta

che contiene il campione e una quota di

campione viene inserita all’interno del

capillare

 Si selezione la provetta contente il

campione 29

 Si applica una ddp  Generazione di un campo elettrico all’interno del capillare

 Le sostanze si separano e arrivano al rilevator e in tempi diversi e si

ottiene il cromatogramma.

Elettroferogramma

 Asse X: tempo

 Asse Y: assorbanza

I picchi possono venire integrati in modo da avere una valutazione

quantitativa dei diversi composti.

Caratteristiche di un sistema CE

Capillare:

 Costituito da silice fusa (SiO2, chimicamente inerte, trasparente).

 Diametro inferiore a 0.5 mm

 Diametro interno estremamente piccolo (25 - 75 m), che evita il rimescolamento del campione.

μ

 Parete interna non trattata o rivestita (coated capillary).

 Parete esterna rivestita con polimmide (resistenza meccanica, in modo da poterlo maneggiare). Solo una

piccola parte del capillare non è rivestito che rappresenta la “finestra” che garantisce il riconoscimento da

parte del detector

 Lunghezza compresa tra 20 – 100 cm.

 Lunghezza totale: dall’inlet all’outlet

 Lunghezza effettiva (alla finestra): dall’inlet al detector

 • Volume di campione

 Vengono iniettati pochi nL (1 - 20 nL)

 • Voltaggio

 Vengono applicati alti voltaggi (10 - 30 KV) ed alti campi elettrici (100 – 1000 V/cm)

 • Detector

 Fotometrico:

singola lunghezza d’onda UV/visibile

 diode array

 Fluorimetrico

 Conduttimetrico

 Spettometro di massa

Modalità di iniezione del campione

Idrodinamica Un’estremità del capillare viene

immersa del contenitore del

campione e l’altra in quello dl

tampone. Si applica una

differenza di pressione tra le due

estremità del capillare:

pressione positiva sul

contenitore del campione (1) o

vuoto sul contenitore del tampone (2). Mediante questo sistema si procede anche al lavaggio del capillare

30

Un piccolo volume di campione viene introdotto nel capillare.

Elettrocinetica

Si applica per pochi secondi un voltaggio agli elettrodi. Gli analiti del campione migrano

in virtù della loro mobilità entrando nel capillare.

Per gravità

Il contenitore del campione e quello del tampone vengono posizionati ad altezze

diverse. Un piccolo volume di campione entra nel capillare per effetto sifone.

Vi possono essere anche capillari con un tubo refrigerante, in modo da mantenere la temperatura costante. Il capillare

inoltre, presenta una guarnizione in modo da garantire un sistema in tenuta. Tutto il sistema è fisso, fatta eccezione

per lo scomparto dei diversi reagenti.

La corsa inizia con un lavaggio in modo da condizionare il tampone con il capillare.

I sistemi di elettroforesi capillare usati nei laboratori analisi presenta fino ad 8 capillari in parallelo in modo da ridurre

i tempi.

Principi delle separazioni in CE

 Elettroforesi: Migrazione differenziale di

molecole cariche in soluzione quando sono

sottoposte ad un campo elettrico.

Nell’elettroforesi capillare i composti per essere rilevati

devono passare davanti al detector e si muovono

all’interno del capillare grazie alla mobilità

elettroosmotica.

 Elettroosmosi: Movimento di liquido lungo una

superficie carica che viene sottoposta ad un

campo elettrico. I gruppi silanoli (SiOH) della

parete del capillare sono dissociati a pH>2.5

cariche negative (SiO-) sono presenti

o sulla parete interna del capillare

accumulo di cationi del tampone

o lungo la parete a formare un doppio

strato di cariche (potenziale ζ )

Quando viene applicato il voltaggio, i cationi del

doppio strato migrano verso il catodo trascinando

con se gli ioni del tampone e le sostanze presenti in

esso. Questo movimento di soluzione verso il catodo

è chiamato flusso elettroosmotico. 31 L’esistenza del EOF comporta che tutte le specie a

prescindere dalla loro carica migrino verso il catodo.

Una molecola sempre carica positiviamente con

densità di carica minore, la sua mobilità

elettroforetica sarà minore e la velocità sarà

inferirore alla molecola ++. La molecola non carica

si muove solo per l’effetto del flusso endoosmotico

e arriverà più in ritardo rispetto delle molecole +

e++. Le molecole negative hannola mobilità

elettroforetica che le traspporta verso l’anodo e

quindi le forze che le porta al catodo saà inferiore e

arriveranno con un certo ritardo al detector.

I fattori che

infleuzano l’EOF:

 pH del tampone Determina la ionizzazione dei silanoli della parete del

capillare. A pH alto, il EOF maggiore in quanto i silanoli della silice sono

completamente dissociati ed attraggono un maggior numero di cariche

positive (potenziale ζ alto).

 Forza ionica del tampone EOF diminuisce all’aumentare della

concentrazione del tampone

 Campo elettrico EOF aumenta all’aumentare del campo elettrico

 Temperatura L’aumento della temperatura riduce la viscosità del tampone e determina un aumento del EOF

32 i tempi di migrazione dei due composti deve

essere diversa il più possibile in modo che la

risoluzione sia maggiore-> selettività

efficiente. Anche la larghezza alla base dei

picchi deve essere piccola affinché si abbia

una buona risoluzione -> separazione

efficiente

Migliorare la Selettività

• Ottimizzazione del pH

• Scelta del tampone:

 Elevata concentrazione (tipicamente 50-200 mM)

 Elevato potere tampone (buon controllo pH)

 Bassa conducibilità

 Basso assorbimento UV

 Basso assorbimento alle pareti del capillare

 Aggiunta additivi

 - sali inorganici: cloruri, solfati

 - urea

 - solventi organici (acetonitrile)

 - surfattanti: SDS, brij, Triton X100, sodio colato

 - ammine 33

Sviluppo di calore

Effetto Joule

Più alto è il voltaggio applicato, più alta è la

corrente che attraversa il capillare e maggiore è

la quantità di calore che si genera.

Lo sviluppo del calore viene limitato:

- mediante la termostatazione del capillare

(20-25°C).

- dal ridotto diametro del capillare (l’elevato

rapporto superficie/volume aumenta la

dissipazione del calore).

- utilizzando capillari lunghi (aumenta l’area

disponibile per la dissipazione del calore).

Flusso all’interno del capillare Nel caso dell’ EOF, la velocità del

liquido all’interno del capillare è

uniforme lungo tutto il

diametro del capillare e il fronte

del flusso è piatto. Poiché il

campione si muove all’interno

del capillare con la stessa

modalità, questo comporta un

compattamento della banda del

campione, una sua minore

→ maggiore efficienza.

dispersione e una migliore efficienza di separazione. Minore dispersione dei soluti

Nel caso di HPLC si ha una certa dispersione del campione in quanto il picco è molto largo. Nell’elettroforesi capillare

si hanno picchi più ristretti e quindi garantisce un’alta efficienza.

Tempo di migrazione

La diminuzione della lunghezza del capillare determina la

diminuzione del tempo di migrazione e quindi della

durata dell’analisi.

L’utilizzo di alti voltaggi diminuisce il tempo di

separazione

Vantaggi/limitazioni uso CE

 Elevata efficienza di separazione

(la dinamica del flusso all’interno del capillare minimizza l’ampiezza dei picchi)

 Piccoli volumi di campione

(sufficienti poche decine nL)

 Non richiede pretrattamenti del campione

(adatta per l’analisi in matrici complesse)

 Tecnica automatizzata e quantitativa

(rispetto a EF su gel)

 Elettroferogrammi facilmente valutabili 34

(rispetto a EF su gel, grazie all’utilizzo di rivelatori che li rendono simili ai cromatogrammi)

 Basso consumo reagenti e capillari

(bassi costi rispetto a HPLC)

 Uso di mezzi acquosi

(ridotti costi ed impatto ambientale)

 Riproducibilità inferiore a tecniche HPLC

(variazione EOF e volume campione iniettato)

 Non è una tecnica preparativa 35

27/10/2017

New generation sequencing

Le Tecniche di sequenziamento massivo possono spaziare dalla ricerca oncologica, allo sviluppo di nuovi farmaci per

individuare nuovi target, oltre alla possibilità di essere impiegate nell’agrogenomica. Di recente, vengono usati per la

genetica riproduttiva, per le tecniche in fecondazione in vitro e diagnosi prenatale non invasiva, in modo da indagare

l’eventuale presenza di aneuploidie all’interno di soggetti in gravidanza in modo da evitare tecniche di indagine

invasive.

Una delle più grosse scoperte del ‘900 è stata la scoperta del DNA, che è stato seguito dal sequenziamento Sanger e

dalla PCR. Ora questi processi vengono usati in tutti i laboratori di ricerca e di analisi. Dal 2000 sono stati sviluppati

nuovi sequenziatori, come Solxa e 454 life science che ad oggi non sono più utilizzati. Negli anni sono usciti strumenti

sempre più evoluti per il sequenziamento massivo degli acidi nucleici, e hanno permesso di ridurre i costi del

sequenziamento e di aumentare la loro l’efficienza. Ad oggi un genoma può essere sequenziato per circa mille euro,

permettendo il loro utilizzo anche in ambito diagnostico.

La NGS è un sistema massivo che utilizza come campione acidi nucleici che vengono frammentati, processati e

vengono aggiunti degli adattatori (sequenze oligoneuclotidiche) che permettono di analizzare sui diversi tipi di

sequenziatori. NGS produce un’enorme quantità di dati, permettendo di individuare delle varianti e mutazioni anche

a frequenza bassa.

Ad oggi esistono diversi tipi di sequenziatori in relazione alla condizione economica e all’uso che se ne andrà a fare:

Sequenziatori che permettono di indagare un intero esoma o trascrittoma, solitamente usato dalla ricerca

 oncologica. Garantisce anche l’intera copertura del genoma umano.

Sequenziatori usati per la genomica di popolazioni.

Si hanno diversi tipi di applicazioni, che non interessano solo la genetica umana, ma anche la genetica animale e la

microbiologia. Negli ultimi anni ci si è concentrati prevalentemente sul sequenziamento dell’RNA.

Sistema BaseSpase: ambiente computazionale che funziona su cloud per aiutare i ricercatori, biologi e genetisti per

interpretare correttamente i dati ottenuti dai vari strumenti.

1) Preparazione delle librerie: modificazione degli acidi nucleici in modo che possano essere

sequenziati sui sequenziatori. Partendo da DNA, si aggiungo degli oligonucleotidi che permettono di

ibridare il DNA ad una matrice. Gli oligonucleotidi vengono aggiunti all’estremità dei frammenti di

DNA, definiti p5 e p7, e portano all’ibridazione dei frammenti ss sulla superficie di un dispositivo

introdotto all’interno del sequenziatore. Procedendo verso l’interno del frammento, si hanno degli

indici che sono associati a ciascun campione, che sono sequenze di 8-10pb che consentono di

individuare i diversi campioni che si stanno analizzando. All’interno del frammento si trovano anche

Rd1 e Rd2 SP che sono regioni dove si andranno a legare i primer che daranno luogo al

sequenziamento. Terminata la struttura della libreria bisogna quantificarla e denaturarla affinché

diventi ss e si possa ibridare con la matrice. L’ibridazione avviene mediante calore o mediante

denaturazione chimica.

2) Generazione dei cluster: generazione del templato di sequenziamento

3) Sequenziamento

4) Analisi del dato: divisa in analisi primaria (divisione del dato grezzo) e analisi secondaria (effettuata

dal software e da bioinformatici)

Esistono altre tecniche per la preparazione di librerie, che richiedono quantità di DNA meno abbondanti e possono

essere utilizzate per il sequenziamento di microorganismi. Si utilizzano enzimi, trasposasi, che rompono il DNA ds e

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aggiungono delle sequenze adattatrici, che serviranno successivamente per aggiunger, tramite PCR, le sequenze

oligonucleotidiche, in modo che il frammento di DNA possa essere denaturato e sequenziato.

Un’altra tecnica, molto usata nei laboratori di oncologia, che serve ad isolare un determinato set di geni, mediante

l’utilizzo di software, prevede di disegnare delle sonde che targettino i geni rispetto ai target molecolari sul genoma.

Una volta disegnate le sonde, vengono ordinate e mescolate al DNA che si vuole studiare, e tramite un processo di

denaturazione, il DNA ds si denatura e abbassando ulteriormente la temperatura, le sonde si ibridano in

corrispondenza dei target per cui sono state disegnate e permettono di copiare il bersaglio sul DNA che vogliamo

studiare. La copia viene effettuata mediante una polimerasi. Al termine della reazione viene introdotta una ligasi che

permette di legare il filamento neosintetizzato alla sonda che stà down streem della regione di interesse. tramite

PCR si procede con l’amplificazione del frammento e il prodotto sarà ds con tutte le sequenze che permetteranno di

sequenziarlo e differenziarlo dagli altri campioni.

Una volta denaturate le sequenze ds, si caricano al sequenziatore, che è composto da uno o più canali rivestiti al loro

interno da una matrice di acrilammide da cui escono oligonucleotidi che sono complementari agli adattatori P5 e P7

all’estremità del DNA. Permettono di ibridare un singolo frammentino della libreria e di amplificarlo sulla superficie

in modo da ottenere un’isola di frammenti tutti uguali e complementari tra di loro. Si ottiene così il templato che

viene usato per il sequenziamento (cluster). Il processo di generazione dei cluster avviene mediante bridge

amplification. Il frammento, sfruttando la complementarietà, si piega formando una struttura secondaria a ponte, da

cui deriva il nome di bridge amplification. Il filamento viene copiato e si genera un filamento uguale al filamento di

origine e questo processo si ripete per una 30ina di volte e si assiste alla costituzione dei cluster che sono tutti uguali

e complementari tra di loro, generati da un singolo filamento.

Il sequenziamento avviene sempre in direzione 5’-3’, il sequenziamentore, mediante un’endonucleasi, tagli i

filamenti reverse, lasciando sulla matrice solo i filamenti forward. In uno step successivo le estremità 3’ sono libere

in soluzione e vengono aggiunti i gruppi produttori in modo da impedire possibili interazioni alle estremità. Viene

aggiunto il primer di sequenziamento,

il sequenziamento vero avviene mediante un processo di sequencing by seqeuncing e sfrutta il fatto che le 4 basi

sono contraddistinte da un fluoroforo diverso che emette a diversa lunghezza d’onda che può essere letta dal

sistema ottico dello strumento ed è in grado di assegnare una e una sola base. Una volta che il primer di

sequenziamento è ibridato vengono introdotte polimerasi, buffer e dnTPs che sono caratterizzati da un fluoroforo

che emette ad una lunghezza d’onda caratteristica. Si assiste all’incorporazione dei nucleotidi e la superficie dei

cluster viene irradiata da fasci di luce e i fluorofori eccitandosi emettono una lunghezza d’onda caratteristica che

viene rilevata dallo strumento che identifica la base che è stata incorporata in quel ciclo. Mediante una mix

enzimatica, successivamente, il fluoroforo viene eliminato. La lunghezza della lettura dipende dal numero di cicli di

sequenziamento che impostiamo. In genere per la maggior parte dei casi si seqeunziano dalle 150 alle 250 pb (molto

inferiore al sequenziamento sanger, ma permette si sequenziare tante contemporaneamente e sommando tutte

queste lettre si riesce a coprire tutta l’estensione del target di interesse o dell’interro genoma). Su ogni base vi è

anche un gruppo protettore, che previene un’incorporazione di più di un nucleotide.

Target in pare dead: sequenziare il target sia da un’estremità e dall’altra. Ciò garantisce una maggiore facilità

nell’allineamento. Avendo letto entrambe le estremità, se una delle estremità cade all’interno delle zone altamente

ripetute e l’altra non cade dentro questa zona, sarà più facile per il software individuare la regione su genoma di

riferimento. Una volta che si sequenzia per un tot di basi il filamento target, si ottiene un filamento di 150-200 bp

che rappresenta il prodotto di sequenziamento che non serve. Il prodotto che viene ad appaiarsi al templato viene

scartato. Quando viene scartato il prodotto di sequenziamento, vengono ricostituiti i frammenti dei cluster che

vanno incontro ad un breve serie di cicli di amplificazione, in modo da ricopiare i filamenti forward e di ottenere i

filamenti reverse che erano stati eliminati all’inizio del seqeunziamento. Mediante una mix enzimatica, si procede

all’eliminazione dei frammenti forward lasciando solo i reverse. Il processo di incorporazione e lettere delle basi

prevedrà l’introduzione dei 4 nucleotidi con il proprio fluoroforo, inserimento dei nucleotidi uno alla volta,

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irradiazione, e rimozione del blocco produttore. In genere le letture sono da 150-200bp in modo che possano essere

sovrapposte e si possa stabilire la distanza tra i due filamenti e mappare con più precisione. Oltre a sequenziare

l’inserto, per poter riconoscere ciascun campione, è necessario riconoscere le sequenze univoche, che però

producono una grossa quantità di dati. Consentono di caricare fino ad un centinaio di campioni ad ogni

sequenziamento. Il sequenziamento di questi indici avviene prima che venga re-sintetizzato il filamento forward.

Vengono sequenziati entrambi gli indici nel caso di sequenze lunghe. Gli indici sono sequenze di 6-8bp che possono

presentarsi in diverse combinazioni che possono caratterizzare dei diversi frammenti all’interno della stessa corsa.

Quando i campioni vengono “mescolati” si otterrà un pool di frammenti che originerà dei diversi cluster. Per

risolvere tutti i frammenti, grazie alla lettura degli indici, sarà possibile classificare i vari frammenti in uno stesso file.

Una volta letti gli indici, gli algoritmi presenti nel sequenziatore saranno in grado di discriminare quali frammenti

derivano dal campione 1 o dal campione 2 ed ecc. ciò consente la capacità di processare più campioni alla volta.

Allineamento e mappatura: ultimo step. Prevede l’analisi del dato che viene fatta dal software dello strumento ma

anche dal software di analisi. Per la visualizzazione del dato grafico può essere effettuato mediante software anche

open source. I software di controllo controllano l’acquisizione dell’immagine. I file che vengono prodotti sono

analizzati da un software che è in grado di confrontarlo con il genoma di riferimento e valutare la presenza di

polimorfismi o varianti che sono correlate a patologie.

I nucleotidi presentano intensità diverse: la citosina è preponderante rispetto alle altre. I software mettono dei

fattori di protezione in modo da normalizzare le intensità delle varie basi. Ogni canale che legge ciascuna di esse può

avere delle coordinate a livello ottico che si discostano tra un canale e l’altro e vengono applicati dei fattori di

correzione in modo tale che i cluster non si sovrappongano.

I software utilizzano le diverse intensità per decidere quale base sarà incorporata.

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09/11/2017

Spettrometria di massa nello studio del proteoma

Perché analizzare le proteine? Solo il 2% delle patologie sono riscontrabili da mutazioni a livello dei geni. Questo perché

da un solo messaggero possiamo ottenere molte proteine differenti grazie allo splicing alternativo. Se ho un gene

alterato qual è la proteina alterata? Sappiamo che le proteine funzionano se hanno una determinata conformazione,

che si sviluppa durante la sintesi della proteina. Una proteina può essere espressa, ma a causa della sua conformazione

scorretta può alterare la sua funzionalità. Le modificazioni post-traduzionali che possono modificare le proteine sono

di diverso tipo

● Glicosilazione

● Fosforilazione

● Ubiquitinazione

● Cleavage come nel caso della cascata della coagulazione, dove le serina proteasi, fanno assumere a queste

proteine delle conformazioni corrette.

Il genoma è sempre lo stesso durante tutta la durata della vita dell’individuo, ma si ha una diversa espressione di esso

durante le varie fasi.

Proteoma

Proteine espresse da un tessuto/organo/individuo in un dato momento. La proteomica è lo studio di queste proteine.

Possiamo avere due approcci differenti di proteomica

1. Di espressione (classica): definisce tutte le proteine, dove devo usare una metodologia che mi permetta di

identificare tutto il materiale proteico. Normalmente si utilizza la elettroforesi bidimensionale (si usano sia la

separazione in base al punto isoelettrico sia in base al peso molecolare SDS-PAGE).

2. Funzionale: permette di focalizzare l’attenzione su una classe di proteine con uno studio di funzione (come e

quando viene espressa, le interazioni con altre proteine, sistemi di inibizione, ecc.)

Ci sono delle strategie definite per lo studio delle proteine, ma non sempre sono molto semplici da attuare, in quanto

si deve cercare di studiare una componente idrofilica in un ambiente idroflico.

1. Purificazione e isolamento -> 2D PAGE

2. Identificazione e caratterizzazione -> spettrometria di massa

3. Ricerca con database -> bioinformatica

Quando devo studiare a confronto un campione normale con un campione patologico si deve procedere con la

sovrapposizione dei vari campioni, in modo da poter determinare la presenza o l’assenza di determinate proteine

“macchie”.

Con proteomica funzionale, che mi permette di identificare le proteine, si deve procedere con diversi passaggi:

● Purificazione della proteina, solitamente non si procede con la purificazione completa in quanto si perde di

sensibilità. Attualmente questo procedimento è la parte più debole del sistema. Purificare una proteina da un

gel è molto difficile in quante la quantità sono molto basse; proteins chips, si può procedere con metodologie

di separazione multimediale

○ Cromatografia a Scambio ionico

○ RP-HPLC

○ ELETTROFORESI CAPILLARE E RP-HPLC

○ cromatografia per affinità

● Caratterizzazione e identificazione: spettrometria di massa. È una tecnica analitica (quello che viene inserito

nello spettrometro di massa viene perso) basata sulla formazione di ioni in fase gassosa ed una loro eventuale

successiva frammentazione (avviene a livello della sorgente. EOgni sorgente è specifica per uno spettro di

ionizzazione). Bisogna procedere con la separazione del cluster sulla sorgente in base al rapporto

massa/carica, che avviene a livello dell’analizzatore (ce ne sono diversi a seconda di cosa stiamo analizzando).

Ci sarà un sistema in grado di convertire l’informazione grazie al rilevatore che genera segnali elettrici

proporzionali al numero di ioni. Il sistema di elaborazione registra i segnali elettrici e li converte in uno spettro

di massa. Dalla spettrometria ottengo dei frammenti tali che mi permettono di risalire alla proteina che voglio

analizzare. 39

Determinazione del peso molecolare delle proteine

MALDI-ROF è una tecnica che sfrutta l’energia di un raggio laser per vaporizzare e ionizzare macromolecole. Le

proteine sono efficacemente ionizzabili con questo sistema. Il laser colpisce una matrice che è in grado di ionizzarsi

molto velocemente e di cedere/acquisire protoni alla molecola di interesse. Con questa tecnica non ho bisogno di una

separazione cromatografica, in quanto il campione viene caricato su una piastra (che può contenere fino a 96

campioni) che viene introdotta nel MALDI e si procede con l’azione del raggio laser in modo da generare il cluster di

ioni, che vengono accelerati in un tubo di volo. Durante il tempo di volo, si creano diversi pacchetti di ioni con pesi

molecolari distinti. Più lo ione è piccolo più questo si muove velocemente. Al detector si ha quindi una notevole

distinzione tra le carie molecole in base al peso molecolare. La precisione è tale che si può ottenere nonostante non

sia stata effettuata una grande purificazione iniziale.

TOF è un analizzatore disegnato per macromolecole macromolecole, come le proteine, e può arrivare ad analizzare

molecole con PM fino a 1000kD.

Nel grafico si mette in relazione l’intensità del segnale, ossia quantità di ioni che si sono formati, con il peso molecolare.

Mediante questa tecnica possiamo ottenere anche le varie interazioni delle proteine con altre proteine, lipidi o DNA.

Incubando il probe con la proteina, si può osservare che si hanno ancora i due segnali separati della proteina e del

probe, ma si ha la presenza di un terzo segnale che è dato dalla somma dei pesi molecolari della proteina e del probe

separati. Ecco che proteina e probe interagiscono tra loro.

ELECTROSPRAY in questo caso si ha alle spalle una separazione cromatografica mediante colonna HPLC. Normalmente

i sistemi tamponi usati per HPLC sono incompatibili con la ionizzazione e quindi devono essere separati, ma per molto

tempo tale processo non è stato molto fattibile. Ad oggi si usano spray, dove il liquido che esce dall’HPLC ha un’alta

pressione, viene forzato ad entrare in un capillare col diametro di un micron e in questo modo si forma la spray. La

fase mobile diventa molto facile da separare in quanto evapora. L’ago da dove fuoriesce lo spray è carico e durante lo

“spruzzo” permette anche di ionizzare le molecole della fase mobile.

Mediante l’analizzatore, la separazione degli ioni avveniva mediate campo elettrico o campo magnetico. Per molecole

molto grandi, come le proteine, si dovevano generare campi elettrici molto grandi, ma ciò non era possibile. Avendo

molecole che sono in grado di acquisire tanti protoni, il rapporto m/z diminuisce, in questo modo si fa “vedere”

all’analizzatore un valore più basso e quindi si possono analizzare molecole molto più grandi. Si è dovuto usare un

sistema ad alta energia in modo da generare una serie di specie dove z è diverso da 1. Ecco che si è sviluppata

l’electroSpray Ionization ESI. Si ottengono una serie di segnali che non sono frammenti, ma che rappresentano la stessa

proteina con un diverso numero di protoni. Mediante algoritmi si può procedere con il calcolo del numero di protoni

associato a ciascun segnale, la carica e il rapporto massa/carica in modo da ottenere il peso molecolare della proteina.

Identificazione di proteine ovvero quando il peso molecolare non basta

Nel caso in cui la proteina non sia presente nella banca dati perché mutata, cambio approccio e uso il peptides mass

fingerprint. Sfrutta il fatto che a seguito di una digestione enzimatica di una proteina, i peptidi che si formano sono

sempre gli stessi a seconda della proteasi che si usa. In questo caso si può procedere con l’elettroforesi, si taglia l’area

corrispondente alla proteina e la si fa digerire con l’enzima scelto. Si procede con l’estrazione dei peptidi e mediante

spettrometri di massa si ottiene un elenco dipesi molecolari che sono riferibili ai peptidi che si ottengono dalla

digestione. Mediante le banche dati posso quindi risalire alla proteina.

Tra le proteasi più utilizzate troviamo: chemotripsina, elastasi, tripsina e carbossipeptidasi.

Ci sono dei programmi che mediante la sequenza della proteina possiamo ottenere i pesi molecolari dei vari peptidi

che si formano a seguito della digestione. Andando a confrontare i valori con il tracciamo cromatografico si vede che

non siamo in grado di stabilire dove i vari peptidi che si vedono a che livelli siano nella proteina. Procedendo con una

digestione enzimatica successiva, posso mettere a confronto i vari peptidi ottenuti dalle due digestioni e in questo

modo ricostruire la sequenza del peptide.

Identificazione delle proteine: il sequenziamento

TANDEM MASS SPECTROMETRY spettrometro di massa con due sistemi che lavorano in tandem: Ogni specie

molecolare della miscela può essere isolata nella prima regione sulla base del suo rapporto massa/carica (ione genitore

40

o precursore). Una volta isolato, ogni ione selezionato entra in camera di collisione dove viene frammentato,

generando gli ioni figlia o prodotto. Gli ioni prodotto, rappresentativi dello ione precursore (la molecola di interesse),

vengono focalizzati in un secondo spettrometro di massa dove vengono isolati, ordinati e quantificati. La frattura

interviene a livello del legame peptidico. In base al peso dell’aa che perdo riesco a determinare chi sta al C-t.

Procedendo in sequenza di sapendo che ogni frammento che si genera differisce da quello prima per un aa, posso

risalire alla sequenza.

Nel caso in cui si abbia una fosforilazione a livello di un aa si otterrà il peso dell’aa + 80 (peso del fosfato) allora a quel

livello ci sarà un sito di fosforilazione.

Identificazione delle proteine

Come si può arrivare all’identità CERTA di una proteina?

1- Determino sperimentalmente TUTTE le informazioni riguardanti la/le proteina/e: approccio integrale

2- Determino sperimentalmente PARTE delle informazioni riguardanti la(le) proteina(e) e da queste cerco di ricavare

le informazioni mancanti: approccio per approssimazione

41

16/11/2017

Misure di Ca2+ imaging con Fluo-2 in cellule del

pacemaker cardiaco

Nodo del seno e nodo atrioventricolare hanno frequenze intrinseche molto simile anche l’origine embrionale di queste

cellule è molto simile.

Le fibre del Purkinje hanno una frequenza intrinseca più lenta rispetto a quelle del NSA, ma hanno origine embrionale

diversa. Sono dei miociti ventricolari che alla fine dello sviluppo, prima della nascita, riprendono un’attività automatica.

La forma del potenziale d’azione di queste cellule è molto simile a quella dei centri non automatici.

Il potenziale d’azione cardiaco

(ventricolare) presenta la fase di salita, la

fase di plateau e la fase 3 di

ripolarizzazione (nella fibra di Purkinje

ha una fase 2 più lunga). Il potenziale

d’azione è data da una variazione di

apertura dei canali ioni, dove vi è

un’enorme variabilità dei canali di

potassio (fino ad una decina di famiglie

diverse). La fase zero di salita è dovuta ai

canali del sodio voltaggio dipendenti. La

fase 2 è data dall’attivazione delle

correnti di calcio di tipo L, che viene

generata dai canali di calcio di tipo L che

si distinguono da tutti gli altri per la loro

sensibilità alle diidropiridine

antagoniste. Esistono anche

diidropiridine agoniste che attivano il canale e prolungano anche il tempo di apertura del canale.

Quando il calcio entra nella cellula viene prontamente tamponato dalla calmodulina, che è il legante più prossimale

per il calcio. Ciò indica che all’interno della cellula abbiamo due tipologia di calcio: calcio libero e calcio legato ai

tamponi. Quando si procede con lo studio di calcio a

livello intracellulare, si procede con l’utilizzo di

traccianti, che sono dei tamponi, che però sono legati a

dei fluorocromi in modo da poter osservare il

comportamento del tampone e di dedurre la dinamica

del calcio nel tempo.

Cellule ventricolare: il calcio è necessario per la

contrazione cardiaca. La concentrazione di calcio

all’interno della cellula deve essere finemente

controllata in quanto può innescare diversi tipi di morte

cellulare. Il calcio viene quindi immagazzinato a livello

del RS, dei mitocondri che usa calcio per generare ATP

e infine il sistema dei miofilamenti. Ad ogni momento,

l’influsso di calcio nella cellula deve essere uguale al suo

efflusso. (Ciò è garantito dai canali di calcio di tipo L per l’influsso), mentre per l’efflusso il calcio viene pompato dalla

pompa SERCA, l’uniporto di calcio a livello mitocondriale, scambiatore sodio-calcio a livello della membrana che

42

funziona in relazione allo scambio di ioni sodio, che determina una lenta corrente depolarizzante. L’efflusso di calcio

deve garantire livelli di calcio liberi bassi a livello citosolico. Può succedere che lo scambiatore sodio calcio funzioni in

maniera opposto, durante la fase di salita nella fibra di Purkinje.

I meccanismi di influsso: dal lato extracellulare sono i canali di tipo L, dal lato intracellulare vi sono: i recettori

dell’inositolo 3-p e il recettore della rianodina. I recettori per l’inositolo 3-p permettono l‘influsso di calcio e sono

localizzati a livello del RE, mentre il calcio che esce dal RyR contribuisce alla contrazione cardiaca, ma questo rilascio

di calcio viene liberato in funzione del calcio citosolico e luminale.

Spazio diadico: spazio tra il canale L e RyR.

Si conoscono mutazioni patologiche per il recettore RyR2 (cardiaco) si hanno sensibilità al calcio spostate causando

aritmie cardiache ventricolari gravi. il RS è disposto in modo caotico. È costituito da cisterne e alcune zone

sono in prossimità dei tubuli T, andando a costituire lo spazio diadico.

I flussi di calcio tra i diversi punti delle cisterne non sono liberi. Esistono

dei buffer che legano il calcio anche al loro interno, come la

calsequestrina, che risulta essere l’omologo della calmodulina. Topo

KO per calsequestrina non nascono.

La stechiometria dei canali è molto importante, ogni canale di calcio di

tipo L deve essere capace di attivare diversi recettori per i RyR. Il

complesso tra canale di calcio di tipo L e RyR viene definito come sito

di liberazione.

Indicatore intracellulari del calcio

Nelle cellule non eccitabili, il rilascio di calcio è molto lento (ordine dei minuti). Nel caso, invece, delle cellule cardiache

abbiamo bisogno di traccianti cromofori rapidi.

- Traccianti raziometrici: Fluo A2 può legarsi sia al calcio legato sia al calcio libero. La sua velocità di misura non

è abbastanza elevata per le cellule cardiache e per i neuroni, anche se ad oggi questo problema è stato

sorvolato.

- Traccianti non raziometrici: emettono in fluorescenza solo nella loro forma legata al calcio. In questo modo si

misura una variazione di fluorescenza e non una concentrazione del calcio. La variazione sarà comunque

proporzionale al cambiamento di concentrazione di calcio. Il più utilizzato è il Flup-4, ma anche Rhod-2 che ha

un’affinità elevata per le membrane mitocondriali. L’emissione di Rhos-2 è nel rosso e non si sovrappone con

i traccianti del potenziale di membrana che emettono nel verde.

Questi tracciati devono essere rapidi e non tossici, questo perché durante l’illuminazione con i laser portano ad un

aumento di ROS che portano alla morte della cellula. La scelta del tracciante varia anche in base alla lunghezza d’onda

(rosso o verde), il tipo di esperimento (nel caso in cui si voglia vedere più di un segnale alla volta).

43

Si hanno due modalità per visualizzare le immagini:

- 2D dove si ha un’immagine di fondo.

L’acquisizione delle immagini nel tempo dipende

dalla tipologia del laser e dalla risoluzione

spaziale. Tra un fotogramma e l’altro si vede un

punto accendersi indicando la localizzazione del

fotogramma. È un modo di acquisizione che

riduce la velocità di acquisizione e gli effetti

tossici sulla cellula.

- Line scanning: permette di capire più facilmente i siti che si illuminano più frequentemente e la scansione è

molto rapida. Mediante questa tecniche si possono osservare i transienti di calcio che corrispondono ad una

liberazione sincrona di calcio dai siti interni della cellula e alla generazione dei potenziali d’azione. Gli eventi

di calcio più limitati prendono il nome di sparks. Per molto tempo si è pensato che lo sparks fosse l’unità

dell’efficienza cardiaca.

Mediante l’utilizzo di una pipetta di patch- clamp con il fluo-3 questo si distribuisce nella cellula. Partendo da un

potenziale cellulare di -50mV la probabilità di apertura del ventricolo è molto prossima a zero. Si procede con una

piccola depolarizzazione. A -50 mV si ha una probabilità quasi nulla di apertura dei canali per il calcio, ma già a -40mV

si ha una maggiore probabilità di trovare qualche canale aperto, si hanno degli spark. Se la depolarizzazione è

sufficientemente forte si genera un transiente.

Bloccando la liberazione di calcio dal RS, bloccando la RyR è possibile rivedere delle spark che corrispondono

all’apertura dei canali di calcio.

Velocità sistema line scanning: distanza tra una linea e l’altra. Più fitte sono le linee più il sistema è rapido e si

possono analizzare fenomeni fini.

Sparklet a seguito di depolarizzazione della membrana si ha l’apertura dei canali di calcio di tipo L e dal grafico 3D è

possibile vedere che si ha la presenza di un segnale, sparklet, che potrebbe indicare una quantita di calcio

In certe condizioni si possono osservare altri fenomeni, tra questi l’onda di calcio. La liberazione di calcio comincia in

un punto e coinvolge una buona parte della cellula, ma in nessun momento si vede un’attivazione completa della

cellula, sembrerebbe una trasmissione ad “onda”. A livello bidimensionale, ad analisi di cellule di fibre del Purkinje,

quando inizia un’onda, si hanno siti di accensione successivi che coprono una superficie superiore rispetto allo spark.

Si ha quindi un segnale di calcio che si trasmette nella cellula ma a nessun momento si trova su tutta la cellula.

I miociti del purkinje assicurano la conduzione rapida e sincrona dell’impulso del miocardio. Sono cellule

estremamente aritmogine. una parte di questo fenomeno è spiegabile perché la fase del potenziale d’azione molto

lunga e lo scambiatore sodio-calcio rimane attivo per molto tempo che potrebbe generare contrazione.

L’onda di calcio in line scanning se si tira una riga si ha l’impressione di vedere delle grosse sparks ma potrebbero

sembrare dei grossi transienti curvi, questo perché l’attivazione non è sincrona.

Sulla formazione delle onde, degli spark e dei transienti sono state fatte delle ipotesi.

1. Modello più comune: è possibile attivare un RyR che viene attivato da un canale di tipo L, che mediante

conduzione saltatoria porta all’attivazione di altri RyR. Questo modello è applicabile alla cellula del

pacemaker

2. Spark model attivata, dove l conduzione non viene fatta tra un sito e l’altro in quanto il calcio libero non è

disponibile, ma si ha l’attivazione dei RyR a seguito dell’arrivo del potenziale d’azione che attiva i canali L che

a loro volta attivano i RyR. Questo modello non spiega il modello dell’onda

3. Modello dell’onda di calcio 44

Modello cellule acinate

Queste cellule presentano gli stessi principi della cellula cardiaca sull’influsso e l’eflusso di calcio, ma i meccanismi

non sono gli stessi. Il controllo dell’attività avviene mediante le correnti di calcio. L’iperpolarizzazione è mediata

dalla classe dei canali del potassio calcio-attivato.

Si hanno dei siti preferenziali di attivazione e liberazione di calcio. La liberazione di calcio, in questi casi, non è

accompagnato alla contrazione, ma alla secrezione.

Sistema di conduzione nelle cellule autoritmiche

Cellula del pacemaker isolata sulla quale viene fatta line scanning. Si vede che si hanno due tipi di liberazione di

calcio: una transiente e una assomiglia a degli spark oppure ad una serie di onde. Quando queste cellule vengono

permeabilizzate con saponina, il potenziale di membrana va a zero mV e i canali ioni sono in uno stato di quiescenza.

Aumentando la concentrazione di calcio si hanno degli spark grandi in funzione alla quantita di calcio.

La liberazione di calcio diastolico viene nascosta dalla rianodina e la cellula rallenta e in presenza di rianodina la

corrente di calcio si riduce. Nelle cellule del pacemaker il recettore della riadonina ha un’attività spontanea durante

la diastole e la osserviamo in fase con il transiente. Normalmente tra -40 e -60mV la corrente di calcio non c’è (fase

diastolica) ma si potrebbe avere un’attività spontanea del recettore della rianodina.

Nella cellula del pacemaker ci sono tre canali di calcio di tipo L

Canali non sensibili alle RyR canali di calcio di tipo T, si apre a potenziali di membrana negativi.

 Canale che media accoppiamento eccitazione-contrazione Cav1.2 (ventricolo e atrio) durante la fase di salita

 del potenziale d'azione. È maggiormente distribuito sulle membrane.

Canale di calcio sensibile a RyR Cav1.3 trovato nelle cellule cromaffini e nelle cellule delle isole di

 Langherans. È presente solo nelle cellule del pacemakers. Questo canale si attiva a livello della

depolarizzazione diastolica. È disposto a livello dei RyR.

Misura del contenuto relativo di calcio nel RS

La caffeina a forti dosi facilita l’apertura dei RyR e si assiste alla liberazione il calcio. I RyR si bloccano allo stato

aperto e si blocca il circuito di rimpompaggio di calcio nel rs. Si ha pero una diminuzione della concentrazione di

calcio, data dallo scambiatore sodio calcio e indica la tau del grafico. L’area sottesa la curva è proporzionale alla

quantità di calcio presente nel reticolo sarcoplasmatico prima dell’inserimento della caffeina.

Tutti questi esperimenti possono essere fatti su tessuto del NS

Il recettore RyR è uno dei recettori che maggiormente subisce mutagenesi spontanea, cosa che è dannosa a livello

del ventricolo e può causare patologie. Se il recettore RyR perde calcio durante la diastole si ha la riduzione del

trazione. 45

17-11-2017

Tecniche di telemetria

L’ECG inizia con una linea isoelettrica in cui non si osservano variazioni di ddp.

Linea isoelettrica in cui non si osservano variazioni di differenza di potenziale

 Onda p è la somma tra la depolarizzazione degli atri e del NSA. La massa del nodo del seno è molto bassa,

 quasi trascurabile rispetto agli atri. Nell tecniche endocardiache è possibile visualizzare la depolarizzazione

del NS

Linea isoelettrica intervallo PR che corrisponde al tempo di conduzione per raggiungere i ventricoli.

 Complesso QRS è dato dalla somma della depolarizzazione sincrona dei ventricoli anche se vi è una piccola

 percentuale di depolarizzazione. Ha una durata rapida questo complesso e molto importante anche l’asse

deve essere a novanta gradi

Onda T durata della ripolarizzazione ventricolare. Non si sa esattamente in che punto ricominci la

 ripolarizzazione.

Da un ECG è possibile ricavare la frequenza cardiaca, che è l’intervallo R-R. L’intervallo tra due onde P successiva

rappresenta la frequenza intrinseca del nodo del seno. Nel caso in cui si abbia un blocco completo del NSA, si assiste

ad un blocco completo ventricolare. Quello che interessa è la velocità alla quale il sangue è pompato dal ventricolo.

Infatti, il pacemaker elettronico controlla la frequenza ventricolare.

Il NSA è una struttura molto robusta strutturalmente, ma all’aumentare dell’età porta problemi di generazione

dell’impulso.

Bradicardia sinusale: ritmo basso con intervalli lunghi e variabili. Si fa fatica a visualizzare l’onda P. quando il ritmo

dato dal NSA perde la sua forza si generano dei foci che emettono in fibrillazione atriale il cuore. Ne deriva che molto

di questi pazienti hanno dei periodi di bradicardia, dei periodi di fibrillazione atriale e in questi casi è necessario

proporre un pacemaker biologico.

La disfunzione sinusale non è una malattia molto frequente, in quanto è legata all’invecchiamento.

Come si ottengono le cellule pacemaker?

Come fanno i canali ionici a generare l’attività pacemaker?

A seguito di disfunzioni, come possiamo controllare le aritmie? è possibile ricostruire l’attività pacemaker?

Telemetria

Trasmettitore con due elettrodi che rappresenta la derivata prima dell’ECG. Il trasmettitore ha una batteria che

permette di seguire l’ECG per 30 giorni. È una tecnica poco invasiva per l'animale. Questa tecnica permette di ridurre

il numero di animali necessari.

Questi trasmettitori vengono inseriti a livello sottocutaneo e sono poco invasivi. Mediante una sutura a livello dei

muscoli pettorali e i vari fili passano e fanno contatto. oltre ai trasmettitori ci sono recettori che a loro volta sono

collegati a cavi eternet che si uniscono ad una interfaccia che permette l'acquisizione e l’analisi dei dati.

Correnti pacemaker

 Corrente if

 Correnti di calcio T 46

 Correnti ikr

 Correnti ikach

La cellula pacemaker ha un corredo di canali ionici diverso dalle cellule ventricolari contrattili.

L’attività pacemaker può essere visualizzata come l’attività dei recettori del calcio e dall’attività elettrica dei recettori

di membrana dei canali muscarinici.

Il KO di HCN4 è letale, in questo modo si devono usare dei modelli induttivi. Si sono create delle linee di topo che

esprimessero nel cuore un canale HCN4 dominante negativo, con una sequenza nel poro che non permettesse più il

passaggio della corrente, la cui espressione era attivata quando si levava l’autosensibilità (sistemi tet-off). I

promotori sono abbastanza lenti ad esprimersi e ci voglio tra le sei e le otto settimane per avere saturazione

dell’effetto.

- Pausa sinusale: non si ha un complesso QRS successivo, il topo andava in tachicardia ventricolare

- Fibrillazione atriale: mancanza di onde P

Quando si blocca farmacologicamente il SNA mediante atropina e propanololo, si assiste ad una riduzione della

variabilità e della scomparsa del blocco autonomico. I topi che mancano per IKACH dopo aver fatto attività fisica, per

recuperare la loro frequenza di basa, impiegano molto più tempo. IKACH sembrerebbe essere un freno dell’attività

cardiaca generale.

Quando si perde un meccanismo del pacemaker vi sono altri canali che fungo da azione compensatoria e questa

scoperta è stata ottenuta mediante la telemetria.

Elettrocardiogramma su anestesia

Tecnica complementare alla telemetria. È costituita da 4 elettrodi e il segnale passa senza rumore e si può usare

anche per stimolare. Con questo metodo si può misurare il tempo di conduzione tra un elettrodo e l’altro e può

essere collegato anche ad un elettrocardiogramma di superficie. Dall’elettrocardiogramma endogeno è possibile

visualizzare un’onda P più grande e bifase, dove il segnale aggiuntivo rappresenta la depolarizzazione del seno. Si

assiste anche ad una seconda fase che è quella che segue la trasmissione del segnale alle branche di destra e sinistra.

Canale di calcio 1.3: KO porta a bradicardia e disfunzioni con blocchi (senza QRS)

Generando topi KI modificando la sequenza per il legame alle diidriporidine del recettore 1.2 del CAV, si vede che la

frequenza ventricolare paragonato.

La perdita diretta di IKach si assiste ad una frequenza cardiaca e conduzione normale.

In presenza di pacemaler elettronico si assiste alla perdita di cellule del nodo atrioventricolare. Si assistono a due

operazioni irreversibile. L’idea sarebbe

In una cellula ventricolare è presente solo una cellula pacemeker mentre in una cellula sinodale sono presenti 3

47

23/11/2017

Tecniche di optogenetica per la rilevazione

dell’attività

Quali sono le aree cerebrali coinvolti nei comportamenti? Parliamo di strutture dell’ordine dei centimetri cubi, ma al

suo interno sono racchiusi milioni di neuroni che non tutti sono coinvolti in quel processo. Ma per conoscere il

comportamento dobbiamo scomporre ancora di più nelle dimensioni. Sapendo che il sistema nervoso è plastico, non

è detto che lo stesso comportamento coinvolga quella stessa struttura dopo un certo periodo.

 Individuare area coinvolta in un processo -> misura della risposta metabolica a seguito di uno stimolo.

Risonanza magnetica

 Studio dell’attività di rete -> studio dei potenziali d’azione e dei potenziali sinaptici

 Arrivare a livello della sinapsi misurando il rilascio sinaptico ed “entrare nelle vescicole”

Functional neuroimaging

 PET

 fMRI

 SPECT

 MEG 3

la risoluzione di questi strumenti permettono una risoluzione massima di un Voxel (1mm ).

Problemi

1. Poca risoluzione spaziale

2. Non si ha la risoluzione di un singolo potenziale d’azione o di una singola sinapsi. Si ha una risposta che

correla con lo stimolo, ma è data da una sommazione di risposte

3. Si ha una misura indiretta

4. Non si distingue tra sistemi eccitatori e sistemi inibitori

5. Scarso segnale-rumore

Con l’elettrofisiologia, invece, si analizza il singolo neurone, anche se vi è comunque un certo rumore di fondo che

però può essere filtrato. la misura è diretta ha un’altissima risoluzione temporale, posso vedere le correnti, l’attività

spontanea, possono andare sul neurone eccitatorio-inibitorio, ma con questo tipo di tecnica posso registrare un

neurone alla volta.

Mediante l’uso di un EEG si ha la misura dell’attività elettrica. Anche in questo caso si devono mediare più tracce per

poter eliminare il rumore. Si studiano i potenziali evocati, in modo tale da discriminare le risposte con il rumore.

Anche in questo caso si hanno problemi di segnali di attenuazione (dovuti dalla componente anatomica).

Si è cercato di sviluppare delle tecniche che fossero più complete.

Calcium imaging: si basa sul rilascio di calcio a seguito della depolarizzazione di membrana. Funzionano

 molto bene su culture dissociate. Se si vuole procedere con esperimenti in vivo, non funzionano tanto bene,

perché questa tecnica non è specifica per i neuroni. Siamo autofluorescenti e quindi la visualizzazione della

fluorescenza mediante questa tecnica, risulta essere scomodo e difficile da visualizzare il segnale. Si ha un

rumore di acquisizione. Il processo di diffusione, inoltre è molto lento e il segnale è filtrato da tutto il tessuto

al di sopra. 48

Vesicular uptake of fluorescent dyes: sviluppo di molecole fluorescente anfipatiche. Inserendo questi

 coloranti sul preparato, queste sostanze rimangono incastrate sulle membrane. A seguito di endocitosi

vescicolare, queste sostanze vengono inglobate nella vescicola e poi rigettate all’esterno. Si ha quindi una

diminuzione della fluorescenza che può essere correlata all’attività del neurone. Funzionano molto bene in

cultura ma non in vivo.

Anticorpi diretti contro epitopi all’interno della vescicola. Si ha una misura cumulativa dell’attività sinaptica.

 Il problema di questa tecnica è che l’anticorpo diffonde poco quindi non può essere usato a livello 3D.

Successivamente, dopo la marcatura con l’anticorpo, si procede con l’inserimento di un altro anticorpo che

colpisce il totale delle sinapsi e in questo modo possiamo distinguere quali sinapsi erano attive a seguito del

determinato stimolo.

Tirf microscopio particolare che viene accoppiatoal fluorescent dyes in modo da poter eliminare il rumore e

 ottenere qualità di immagini migliori. Questo perché la luce incidente arriva con un certo angolo “critico”

che porta alla formazione del raggio evanescente che non va oltre i 50nm. In questo modo si mettono in

risoluzione i primi 50nm che permettono di studiare la cellula.

Quando vi è molta attività a livello neuronale si ha un aumento di calcio, che porta all’attivazione di fattori di

trascrizione come c-FOS e in questo modo si può marcare la proteina data da c-FOS e retrospettivamente si possono

vedere quali cellule erano coinvolte in quel processo.

Optofisiologia e optogenetica

L’optogenetica usa dei sensori dell’attività che sono geneticamente modificati, che fa da sensore (sente lo stimolo) o

da fotoattuatore (grazie alla luce è in grado di provocare lo stimolo).

Il primo ad essere stato sviluppato è stata la pHfluorina, è una proteina delle vescicole sinaptiche che presenta a

livello dell’N-t un dominio VAMP2 (specifica per le sinapsi) che lega una GFP modificata. La GFP quando va incontro a

neutralizzazione del pH aumenta la sua fluorescenza (le vescicole hanno un pH leggermente acido e quando si

fondono aumentano il pH e la proteina). ogni volta che c’è una fusione vescicolare c’è un aumento della fluorescenza

della proteina. Anche questa tecnica manca del rapporto segnale-rumore. P, risulta difficile usarla in vivo.

GECI, indicatori di calcio geneticamente modificati costruiti ad oc per misurare il calcio. Possono essere di due tipo

Basati su GFP modificati

 Basati su FRET:(ciano e yellow FP, se si trovano lontane). Hanno la proteina fluorescente legata ad un

 peptide sintetico (analogo sintetico della catena leggere della miosina m13) e attaccato all’m13 vi è un

sensore per il calcio. Vengono eccitate alla loro lunghezza di emissione, se invece sono vicine, stimolando

una si vede l’emissione della seconda. Ciò indica che queste proteine sono vicine e viene usato per

l’interazione tra molecole. In questo caso è solo il legame con il calcio che le attiva) ogni qual volta che c’è un

sensore di calcio, il peptide m13 causa un piegamento della proteina, chelandola, che nel caso di proteine

basati su FRET sale il fluoroforo mentre se si hanno solo GFP questa diventa più fluorescente

Cameleon prima ad essere prodotta

o GCaMP: prima realmente funzionante, basata su m13 e ha una sola proteina fluorescente GFP

o modificata in modo da visualizzare la sua fluorescenza quando il peptide m13 lega il calcio. ha

sensibilità alta e più veloce ad aumentare la fluorescenza quando lega il calcio

CaMPARI non si monitora più l’aumento di fluorescenza, perché la proteina in presenza di aumento

o di calcio fa fotoconversione, passa dal verde al rosso e non ritorna più verde.

49

Channel rodopsina: fotoattuatore. Sono canali ionici eccitatori, che sono sensibili a determinate lunghezze d’onda.

Reagiscono ad una singola lunghezza d’onda. Esistono anche channel rodopsine inibitorie e ciò permette di

accendere e spegnere il neurone.

C-fos può essere legato alle channel rodopsine. Channel rodopsina messa sotto il promotore di cFos inserito

nell’ippocampo di topo. A seguito di apprendimento di paura, sono stati in grado di guidare un comportamento con

l’accensione della luce in quei circuiti ed indurre paura anche in condizioni non “paurose”.

50

Sviluppo e utilizzo di fagi per applicazioni al

sistema nervoso

Batteriofagi

 Virus che infettano batteri

 Acido nucleico + proteine

 Classificazione: 1 ordine, 14 famiglie, 37 generi

Ciclo replicativo

 Ciclo litico (batteriofagi T)

• Sfrutta l’apparato di replicazione dell’ospite per la sintesi di

nuove particelle fagiche

• Lisa la cellula batterica ospite

 Ciclo lisogenico (fago )

λ

• Integrazione nel cromosoma batterico (profago)

• Non lisa la cellula batterica ospite (fago temperato)

I batteriofagi filamentosi

 Virus che infettano E.coli

 Fagi M13, f1 e fd

 Richiedono il pilo F di E.coli per l’infezione (fagi Ff)

 Non lisano l’ospite (fago lisogeno) e producono una grande quantità di particelle fagiche

 DNA circolare a singolo filamento (circa 6400 bp) contenuto in un capside di forma cilindrica

 Accettano frammenti di DNA estraneo

Genoma dei fagi filamentosi

 È stato completamente sequenziato (Beck and Zink et al. 1981)

 Geni II, V, X codificano per le proteine della replicazione del DNA virale

 Geni pVI, pVII, pIX, pVIII, pIII codificano per le proteine del capside

 Geni pI, pIV, pXI codificano per le proteine dell’assemblaggio

 Due regioni non codificanti: IR1 (tra i geni IV e II), IR2 (tra i geni VIII e III)

 pIII media il legame con il pilo F 51

Ciclo replicativo dei fagi filamentosi

 Il DNA infettante è a singolo filamento e

convenzionalmente definito (+)

 Replica nelle cellule batteriche

attraverso una forma replicativa

intermedia (parental replicative form,

RF) a doppio filamento

 La trascrizione dei geni virali comincia dai

siti promotori sul filamento (-) della RF,

procedendo unidirezionalmente fino ai

terminatori a valle dei geni VIII e IV  La replicazione del genoma virale comincia quando la proteina pII

introduce un taglio sul filamento (+) della RF nella IR1

 La DNA polimerasi cellulare sintetizza il nuovo filamento (+) secondo

la modalità di replicazione a “cerchio rotante”

 Il nuovo filamento è reso circolare da pII e convertito in una RF

 Quando sono state sintetizzate circa 100-200 copie del DNA fagico, la

proteina pV lega il DNA virale a singolo filamento impedendone la

conversione a RF

 Il processo di assemblaggio avviene in particolari zone della

membrana cellulare dove membrana esterna e interna sono strettamente

in contatto grazie all’interazione di proteine fagiche (pIV, pI, pXI)

 I filamenti di DNA ss interagiscono con la membrana cellulare

attraverso le proteine pVII e pIX

 In seguito al contatto con la membrana cellulare, le proteine pV sono

rimosse e sostituite dalle proteine di superficie fagiche pIII e pVIII

 L’assemblaggio fagico non avviene a livello intracellulare, ma durante la gemmazione

52

 La lunghezza delle particelle fagiche dipende dalla lunghezza del DNA

 Il fago assemblato viene rilasciato dalla cellula batterica che non viene lisata ma continua a crescere ad un

tasso replicativo inferiore

 Vengono prodotte migliaia di particelle fagiche per cellula, per generazione

Vettori di clonaggio derivanti da M13

 Costruiti sfruttando la possibilità di inserire geni nelle

regioni IR1 (tra i geni II e IV) e IR2 (tra i geni VIII e III)

 Costituiti dalla forma replicativa (RF) a dsDNLa RF è

modificata aggiungendo un multiple cloning site

(MCS) e la sequenza nucleotidica lacZ come marker di

selezione

Phage display

Tecnica molecolare basata sulla produzione di batteriofagi

ricombinanti che contengono geni codificanti proteine

eterologhe e che esprimono sulla loro superficie le proteine

stesse. È possibile esprimere peptidi naturali, peptidi sintetici,

domini proteici, proteine intere, frammenti di anticorpi. Tramite phage display una libreria di sequenze nucleotidiche

diverse può essere convertita in una libreria di peptidi o proteine. Dalla libreria fagica è possibile isolare il peptide o la

proteina con le caratteristiche desiderate. 53

Proteine per il display

 Per il corretto assemblaggio delle particelle fagiche, è importante soprattutto la porzione idrofobica delle

proteine strutturali fagiche

 Tutte le proteine strutturali fagiche possono essere utilizzate per il display

 Le più utilizzate sono le proteine pIII e pVIII

pIII display

 pIII è presente in circa 5 copie per particella fagica

 In un display ibrido 1-2 copie sono fuse alla molecola di interesse: utile per la

selezione di ligandi ad alta affinità (>106 kd)

 L’azione cooperativa dei legami può essere persa

 Idonea alla fusione di molecole grandi

pVIII display

 pVIII è presente in circa 3000 copie per particella fagica

 In un display ibrido circa 200 copie sono fuse alla molecola di interesse: utile per la selezione di molecole che

interagiscono a bassa affinità

 Permette di sfruttare l’azione cooperativa dei legami

 Esposizione di molecole di grandi dimensioni può causare ingombro sterico

Fagemide

Plasmide batterico contenente

 origine di replicazione fagica (f1)

 origine di replicazione batterica (ColE1)

 sito multiplo di clonaggio (MCS)

 marker di selezione (resistenza a un antibiotico)

 copia della IR1 di un fago filamentoso, completa di tutte le

sequenze richieste per l’inizio e la erminazione della sintesi

del DNA fagico e per l’assemblaggio delle particelle fagiche

Infezione con fago helper

 Replicazione e packaging del fagemide

 Il DNA fagemidico sarà preferenzialmente impacchettato nel fago neo-assemblato (mutazioni nella regione di

packaging dell’helper)

 Il nuovo fago può essere usato per infettare cellule batteriche

 NON replicherà, perché privo delle sequenze codificanti per le proteine fagiche necessarie

 Tornerà alla forma circolare double stranded (grazie agli enzimi batterici) e a questo punto resterà solo come

plasmide

Vantaggi dei fagemidi

 Più stabili dei vettori derivanti dai batteriofagi

 Piccole dimensioni: inserimento di lunghi frammenti di DNA estraneo (10 Kb)

 Amplificazione del DNA estraneo

 Alte rese di dsDNA 54

Biopanning

 Selezione della popolazione fagica in base all’affinità per il target

scelto

 Cicli di legame, lavaggio, eluizione e amplificazione dei fagi

selezionati

Applicazioni phage display

 Selezione di

Peptidi

• Domini proteici

• Ormoni

 Selezione di particolari funzioni enzimatiche

 Identificazione di domini proteici

Selezione di peptidi in grado di legare molecole di interesse

 Identificazione di un motivo necessario al legame con uno specifico target

 Identificazione di epitopi di anticorpi

 Selezione di agonisti e antagonisti di recettori

 Identificazione di ligandi e substrati di enzimi

Librerie anticorpali

 Utilizzo del repertorio anticorpale naïve o post-

immunizzazione di specie diverse (uomo, topo, coniglio,

primati)

 Si utilizza un fagemide come vettore di clonaggio

 È possibile esporre diversi frammenti anticorpali (Fab o scFv)

Vantaggi:

 9 11

Elevato numero di cloni analizzabili (10 -10 )

 Librerie anticorpali immuni o correlate a malattia per generare

anticorpi ad alta affinità e per lo studio della risposta

immunitaria umorale

 Librerie anticorpali naïve o sintetiche per generare anticorpi

contro diversi antigeni

Limiti:

 Produzione di librerie difficile e costosa

 Possibile appaiamento non naturale delle catene leggere e pesanti Possibili Ab autoreattivi

 Per alcuni anticorpi necessaria maturazione in vitro dell’affinità

 Necessità di convertire i frammenti anticorpali (scFv, Fab) selezionati in immunoglobuline intere

Nuove frontiere nell’utilizzo dei fagi

Agenti terapeutici nelle infezioni batteriche

• Scopo terapeutico: phage therapy

• Fagi litici

• Infezioni cutanee da stafilococco (1921) 55

• Primo trial clinico fase I (2008) – ulcere venose arti inferiori: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa

ed Escherichia coli

• Vantaggio per patogeni con multi-resistenze

P.aeruginosa

• Ferite infette

• Ceppi multi-resistenti agli antibiotici

• Isole di patogenicità (es. PAPI-1)

• Rischiosa la somministrazione e.v.

• Efficacia non a lungo termine

Dalla biologia alla biotecnologia dei fagi

• Nuove metodiche

Amplificazione fagica

o Prodotti alimentari

 Misurazione fago libero

Lisine derivate dai fagi

o Elevato grado di purezza

o Attività altamente specifica

 Rapida azione letale

 Tossicità assente

Fagi terapeutici ricombinanti

o Implementazione con tossine letali

Lisine derivate dai fagi

• Endolisina fagica Φ11

Clonata e overespressa in E.coli

o

• Staphylococcus aureus

Parete cellulare

o Cellula intera

o Biofilms

o

Fagi ricombinanti per bersagliare cellule tumorali

• Farmaci immunoconiugati (Ab + molecole citotossiche)

Ridotta tossicità sistemica

o

• Nanofarmaci

Liposomi, nanoparticelle, polimeri

o legati a farmaci

Mancanza di selettività (aumentata

o permeabilità dei vasi nel tumore)

• Fagi filamentosi coniugati a farmaci

antineoplastici

Selettività di targeting

o

Applicazioni nanotecnologiche

• Screening di librerie fagiche per isolare peptidi

che legano materiali inorganici (metalli,

semiconduttori, paramagnetici etc) 56

• Templati per l’assemblaggio di strutture in scala nanometrica

Pellicole tridimensionali

o

Batteriofagi

• Applicazione principale: phage display

• Nuove applicazioni:

• Agenti terapeutici nelle infezioni batteriche

• Lisine derivate dai fagi

• Fagi terapeutici ricombinanti (vs tumori, etc)

• Applicazioni nanotecnologiche

• Future applicazioni: sistema nervoso 57

Applicazioni al sistema nervoso

Domande di interesse generale per biologi, neurobiologi, farmacologi, medici, biotecnologi

• Come superare la membrana plasmatica ottenendo accesso all’ambiente intracellulare di tutte le cellule di un

organismo?

• Come introdurre intracellularmente molecole attive di elevato peso molecolare quali le proteine?

• Come evitare l’utilizzo di DNA o di altro materiale genetico?

• Come ottenere un targeting selettivo ad alcune tipologie cellulari?

• Come raggiungere elevate specificità ed efficienza in questi processi?

Metodi per l’indirizzamento selettivo di molecole

Alcune applicazioni

• Terapie anti-tumorali innovative

• Terapie enzimatiche per le patologie da accumulo

• Malattie metaboliche da mancanza di proteine attive quali gli enzimi

• Distruzione selettiva di popolazioni di cellule immunitarie o nervose (e.g. immunosoppressione, epilessia)

• Diagnostica e imaging cellulare (e.g. individuazione di metastasi)

SNC: la barriera ematoencefalica

Per oltrepassare la BEE si usano 3 tipi di approcci

• approccio invasivo (interruzione meccanica)

• approccio farmacologico (modifica chimica)

• approccio fisiologico (trasportatori fisiologici)

principali limiti

• mancanza di selettività

• rischi elevati

• difficile ingresso per molecole di alto M.W.

• efficacia non dimostrata

• non realizzabile l’ingresso intracellulare nei neuroni

un tipo di applicazione che sfrutta i fagi ha visto l’immunizzazione di modelli murini di Alzheimer in modo da indurre

l’introduzione di anticorpi conto il beta-amiloide.

sfruttando l’endocitosi (sinaptica e dendritica) le molecole possono essere veicolate anche a grande distanza dal sito

di uptake. Si sono ingegnerizzati dei fagi filamentosi in modo da usarli come vettori per farli arrivare al cervello. Questi

esponevano sulla superficie degli anticorpi contro il beta-amiloide e sono state somministrate per via nasale e si è visto

che risulta essere un approccio selettivo. Ma molti quesiti rimangono aperti.

1. Studio dell’endocitosi dei fagi nativi in cellule eucariotiche e neuroni

2. Ingegnerizzazione con inserimento di una sequenza di legame (Greenzip/Synbond)

3. Generazione di fagi ricombinanti M13-BOND per incrementarne l’uptake

Fagi: vettori per molecole terapeutiche? In questo lavoro sono state utilizzate tecniche come l’immunofluorescneza

con anticorpo anti pVIII localizzato sul capside del fago e microscopia elettronica.

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4.67 MB

AUTORE

yetapia

PUBBLICATO

6 mesi fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in biologia applicata alla ricerca biomedica
SSD:
Università: Milano - Unimi
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher yetapia di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Tecniche avanzate di indagine biomedica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Milano - Unimi o del prof Di Francesco Dario.

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