Tecniche avanzate di indagine biomedica

05/10/2017

3 domande sugli argomenti esposti (esame orale)

Canali ionici

Permettono la comunicazione delle cellule. I canali ionici sono presenti in tutte le cellule.

Kandel (premio Nobel 2000) scoprì la memoria cellulare sulla base di un sistema composto da canali ionici di potassio.

Studiando aplysia californica (mollusco erbivoro) si notò che la sua sensibilità aumentava a stimoli successivi

soprasoglia. Ciò è dovuto ad un circuito nei quali sono presenti dei canali ionici che sono controllati da cAMP. Fu la

prima descrizione sulla memoria cellulare.

Peter Agre ha scoperto il canale dell’acqua “acquaporine”. Mackinnon fu il primo a cristallizzare i canali di un batterio,

in modo da determinare le sue caratteristiche.

Ritmo circadiano: permette a tutti gli animali di adeguare la loro attiva/non-attività alla fase diurna o notturna. Il

nucleo soprachiasmatico è un nucleo dell’ipotalamo che sta alla base di molti processi ciclici nell’organismo, come

sonno, veglia, emozioni. Questo nucleo riceve informazioni dalla retina e insieme ad altre informazioni gestisce vari

tipi di regolazione nel corpo. La ghiandola pianeale ha un’attività circadiana, ossia la sua frequenza di scarica nei

neuroni si modifica durante il giorno. I canali ionici sono tra i mediatori di queste funzioni.

Per diminuire l’angina pectoris si cerca di rallentare il cuore.

Approccio allo studio e caratterizzazione dei canali ionici e loro funzioni. I canali ionici sono proteine transmembrana

costituite tipicamente da una subunità Alfa formato il poro di permeazione e da una o più subunità Beta con funzioni

regolatorie, che consentono il passaggio degli ioni attraverso la membrana secondo potenziale elettrochimico, essi

possiedono altre proprietà fondamentali:

permeabilità costituiscono una via a bassa energia che consente alla specie Ioniche idratate di passare la

 membrana impermeabile agli ioni

selettività consente di discriminare tra diversi ioni in funzione di dimissione e carica. si distinguono in

 altamente specifici ad esempio i canali per il sodio consentono solo il passaggio per il sodio e meno specifici

ad esempio i canali cationici che consentono il passaggio di sodio potassio e calcio

meeting processo attraverso cui un canale passo da una configurazione all'altra si distinguono in stato aperto

 gli ioni possono passare. Stato chiuso gli ioni non possono passare ma il canale può passare allo stato aperto.

Stato inattivato gli ioni non possono passare il canale non può passare allo Stato aperto.

Le diverse tipologie di canale Ionico sono regolate da differenti tipologie di stimolo differenza di potenziale attraverso

la membrana, neurotrasmettitori o altre proteine regolatrici ad esempio acetilcolina acido glutammico, stimoli

meccanici ad esempio stiramento.I canali ionici nella storia: l'esistenza di molti canali ionici è stata dedotta da flussi

rilevabili di corrente elettrica dentro e fuori la cellula conduttanze

1963 Andrew Hodgkin, A. Huxley svilupparono la tecnica del voltage clamp in cui descrissero le basi Ioniche

 del potenziale d'azione ottenendo il Premio Nobel per la medicina per la fisiologia che condivisero con John

Eccles poiché è compreso il meccanismo Ionico dell'impulso nervoso

1991 Erwin Neher e Bert Sakman ottennero il Premio Nobel per la medicina e furono in grado di registrare la

 corrente che fluisce tra un singolo canale Ionico Grazie allo sviluppo della tecnica del patch clamp sfrutta un

dispositivo di registrazione altamente sensibile, consente di isolare elettricamente un frammento piccolissimo

della membrana, presumibilmente recante un singolo canale, mediante la punta di una micro elettrodo di

vetro cavo. 1

2003 PeterAgree e Roderick Mackinnon ottennero il Premio Nobel per la chimica poi ci furono i primi a

 visualizzare un canale Ionico

Mentre alcuni canali ionici sono permanentemente aperti altri lo diventano sono in risposta a particolari stimoli,

Questa seconda categoria di canali maggiormente responsabile dalla risposta cellulare a molti stimoli esterni interni,

poiché il flusso Ionico che ne risulta scatena il meccanismo biochimico che produce la risposta tipica della cellula.

Modificazioni biochimiche dei canali ionici nella porzione citosolica esempio fosforilazione alterano la funzionalità

degli stessi. Questi canali funzionanti se accoppiati ad uno stimolo, possono essere canali voltaggio dipendenti e canali

a liganti.

I canali voltaggio dipendenti si aprono in risposta ai cambiamenti del potenziale di membrana in aria loro circostanti

questo avviene solo quando il potenziale successo raggiunge certo valore soglia. Parte della proteina costituenti il

canale implicata nella ricezione dei cambiamenti di voltaggio, inducendo un cambio conformazionale. I più studiati dei

canali voltaggio dipendenti sono provenienti dalle membrane delle cellule elettricamente eccitabili come i neuroni e

fibre muscolari, dove sono essenziali nella Genesi e propagazione dell'impulso elettrico e nella regolazione del rilascio

di neurotrasmettitore dai terminali del neurone si lamentano principalmente:

canali del sodio voltaggio dipendenti che sono altamente conservati e durante l'evoluzione conducono

 correnti entranti che si attivano in depolarizzazione, e presentano una subunità alfa formata da una singola

catena polipeptidica organizzato in quattro Domini ognuno formata da 6 segmenti transmembrana omologhi

connessi da linker intracellulari che si ripiegano a formare un canale centrale, subunità Beta ad azione

regolatoria (sono due nel canale cardiaco e la loro assenza disfunzione causa una forma di sindrome di QT

lungo che può portare a morte improvvisa). Si attivano gli attivano molto velocemente pochi millisecondi e

loro stato aperto, chiuso, inattivato, è una funzione probabilistica del potenziale di membrana e si si inattivano

in depolarizzazione e si riattivano iperpolarizzazione. Un ottimo modello di canale di sodio voltaggio

dipendente è riscontrabile negli organi elettrici dell' anguilla elettrica electropolis uno dei soggetti prediletti

dai neurophysiology.

canali del calcio voltaggio dipendenti sono tutti attivati in depolarizzazione presentano una subunità Alfa

 formata da una singola catena polipeptidica organizzato in quattro Domini ognuno formata da 6 segmenti

transmembrana, omologhi connessi da linker intracellulari che si ripiegano a formare un poro da centrale.

Possono avere diverse subunità accessorie che modulano le proprietà della subunità Alfa 1. Sono diversi per

Resistenza ai farmaci entità della depolarizzazione necessaria per aprirli, rapidità con cui si inattivano secondi

ho decine di millisecondi.

canali pacemaker si attivano in iperpolarizzazione, sono modulati sia dal voltaggio che dalla concentrazione

 intracellulare del secondo Messaggero cAMP da cui il nome della duplice modalità hyperpolarization-activated

cyclic nucleotide Gate channels. Permette il passaggio di IF Funny current, non è dunque selettivo per un

particolare ioni, ma conduce sia sodio che potassio con un rapporto di permeabilità pari a 3. Fanno parte della

sottofamiglia dei canali di potassio voltaggio dipendenti in quanto non presentano la struttura tipica, cioè che

li distingue è la presenza di un segmento C terminale del dominio di legame del nucleotide ciclico CNBD, che

consente il legame, per cAMP. I canali pacemaker sono inibiti selettivamente da procoralan (ivabradina)

principio attivo derivato dal verapamil utilizzato nella angina stabile nello scompenso cardiaco, con

conseguente riduzione della frequenza cardiaca.

I canali a ligando invece si aprono rispondendo al legame come una molecola livello del sito ad alta affinità per la

stessa. L'interazione con la molecola induce un cambio conformazionale della proteina e il canale si apre. Come i canali

voltaggio dipendenti, i canali ligando si comportano in modo stocastico, cioè probabilistico. Tre i più diffusi si

remmentano: 2

canali ionici aperti dell'acetilcolina: l'acetilcolina lega fisiologicamente I recettori colinergici, e si sono divisi

 in: recettori nicotinici attivati anche dalla nicotina ed inibiti dal curaro, un veleno. Recettori muscarinici

attivati anche dalla muscarina e inibiti dall'atropina.

canali ionici aperti dall'acido glutammico: si rammentano due tipi di recettori canali non attivato dal NMDA

 un canale permeabile al sodio e al potassio. è un canale attivato dalla nmda, un canale permeabile al sodio e

al potassio, ma anche al calcio. Non necessita della glicina per essere aperto sempre presente in condizioni

fisiologiche ea potenziale di riposo è bloccato dal magnesio intracellulare che viene rimosso a seguito della

depolarizzazione

canali ionici aperti da l'acido gamma aminobutirrico GABA: si rammentano due tipi di recettori il GABA A è

 un recettore canale permeabile al cloro e GABA B agisce tramite messaggeri intracellulari.

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Tecnica del Patch-clamp per lo studio di canali

ionici

È una tecnica molto utile per studiare l’attività dei canali ionici. Si utilizza per studiarne le proprietà e il loro significato

funzionale.

I canali ionici svolgono varie funzioni in tutti i tipi cellulari, assumendo particolare importanza nel tessuto nervoso e

muscolare dove sono deputati alla regolazione dell’eccitabilità cellulare. Ciò serve alla comprensione di numerosi

fenomeni fisiologici (o patologici) e allo sviluppo di nuove terapie (farmaci in grado di attivare o bloccare i canali ionici).

In generale nelle cellule, la memebrana plasmatica separa due compartimenti: componente intracellulare e

componente extracellulare che presentano diverse concentrazioni ioniche.

confrontando le varie tabelle, si nota che il

sodio è uno ione molto più concentrato

all’esterno che all’interno. Il rapporto tra la

concentrazione esterna e interna è mantenuto

nei vari animali.

La membrana plasmatica è permeabile solo ad

alcuni ioni, grazie ai canali ionici e dal momento

che ognuno di essi porta con sé una carica

elettrica, il risultato finale indotto da questa

diversa permeabilità è la creazione di una d.d.p. ai lati della memebrana che prende il nome di potenziale di riposo (-

60/-90 mV).

V =V -V V =0

m in out out

Es. Canale selettivo per il potassio. Quando il canale è aperto il potassio, che è maggiormente concentrato all’interno,

è sottoposto a due forze:

1. Gradiente di concentrazione che lo spingerebbe verso l’esterno

2. Potenziale di memebrana che invece lo tenderebbe a trattenere all’interno

Ogni volta che il canale si apre, lo ione che permea dipende da 2 forze:

1. Gradiente di concentrazione

2. Gradiente elettrico

Se il gradiente elettrico vince sulla differenza di concentrazione, lo ione entra e viceversa. È il bilanciamento di queste

due forza che determina l’entrata o l’uscita dello ione. Questo processo viene definito dall’eq. Di Nerst:

[]

= ln ( )

[]

In base a questa eq si può vedere il potenziale di equilibrio

o di inversione. Al potenziale di riposo la corrente è zero, se

si va verso potenziali più positivi (nel caso del potassio) sarà

uscente, nel caso in cui siano più negative (sempre nel

potassio) sarà entrante. 4

Per definire il potenziale di riposo, da un punto di vista teorico:

equazione di Goldman Hodgkin Katz (GHK)

Il potenziale di riposo è una conseguenza di una

permanente differenza di contrazione ionica ai due capi della memebrana. Questa è prodotta da:

 Una membrana selettivamente permeabile

 + +

Un trasporto attivo degli ioni Na /K

Proprietà elettriche passive della memebrana

La memebrana plasmatica può essere ricondotta ad un circuito elettrico equivalente che comprende una resistenza

R ed una capacità C , disposte in parallelo. Il condensatore è dato dalla memebrana plasmatica. La resistenza è quella

m M

offerta al flusso ionico attraverso i canali. La capacità dipende dal potere dielettrico della fase lipidica.

Legge di Ohm

Corrente ionica

È definita come Gi

 E=potenziale a cui io sto osservando la corrente

 Ei=potenziale di inversione

La conduttanza del singolo canale aperto si misura in singolo

canale e si determina la conduttanza. Lo scopo ne vari esperimenti è quello di determinare la corrente Ii.

Tecnica del voltage-clamp

Questa tecnica consiste nel bloccare il potenziale di memebrana ad un valore costane nel tempo e nel registrare le

correnti ioniche transmembrana generate a tale potenziale di memebrana. È necessario bloccare il voltaggio perché

la corrente e anche l’apertura/chiusura di molti canali dipende dal voltaggio.

La corrente attraverso il canale dipende da

1. Permeabilità del canale: conduttanza (es voltaggio-dipendenza)

2. Driving force – dovuta al potenziale elettrico attraverso la membrana e al gradiente di concentrazione degli

ioni.

Es. studiare una corrente di sodio di un canale voltaggio dipendente che si attiva in depolarizzazione. Nel momento in

cui un canale di sodio si apre, entrano degli ioni positivi all’interno

della cellula e quindi la cellula si depolarizza. La depolarizzazione fa

aprire altri canali ionici, si forma quindi un loop.

Vengono inserite due pipette di vetro con la punta tagliata (vi è

continuità tra la soluzione all’interno dell’elettrodo e il citoplasma):

elettrodo della corrente ed elettrodo del voltaggio. L’elettrodo del

voltaggio porta il segnale ad un amplificatore differenziale, che può

essere collegato ad un computer. Sapendo che per misura, per

esempio la corrente di sodio, devo depolarizzare la cellula. Tramite il

pc si può generare una corrente che viene inietta all’intero della

cellula per aumentare il voltaggio. L’amplificatore confronta il potenziale della cellula con quella imposta

dall’operatore e fa uscire una corrente che viene iniettata all’interno della cellula in modo da aumentare il potenziale.

Si ha l’apertura dei canali di sodio permettendo l’entrata di altri ioni positivi nella cellula, andando ad aumentare il

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potenziale di membrana. Dall’amplificatore esce una corrente uguale e contraria a quella che si è generata

dall’apertura dei canali di sodio, ed è quella che si va a misurare

(slide Ic è la corrente capacitiva. La corrente che si vede è data dalla corrente di sodio entrante e potassio uscente.

Limiti di voltage clamp

 Utilizzo di 2 pipette di vetro perché le cellule sono molto piccole fatta eccezione per cellule relativamente

grandi.

 Tecnica invasiva

 Grande rumore di fondo

Patch clamp

Utilizza una sola pipetta di vetro che misura sia la corrente

che il voltaggio. Questa tecnica era stata sviluppata per

studiare l’attività di un singolo canale e registrare le

correnti ioniche che si formano solo in piccolo lembo di

memebrana plasmatica. Se la punta della pipetta aderisce

bene alla memebrana plasmatica si crea un sigillo ad alta

resistenza e si possono misuri canali ionici che si trovano

solo in quel lembo di membrana.

Questa tecnica non permette di misurare solo le correnti in

quella regione di memebrana, ma anche in tutta la cellula. Viene utilizzata per studiare le correnti nei canali ionici ma

anche i cambiamenti di voltaggio nella cellula. Vengono usati un solo amplificatore operazionale, una singola pipetta

e un solo elettrodo con messa a terra. Questo metodo permette di isolare elettricamente una piccola area (patch) di

membrana dalla soluzione esterna e di misurare la corrente attraverso il canale/i localizzati nel patch. Ciò si ottiene

premendo una pipetta di vetro, che è stata riempita con una soluzione elettrolitica adatta, contro la superficie di una

cella e applicando un'aspirazione leggera. A seconda di cosa il ricercatore stia cercando di misurare, il diametro della

pipetta è variabile, ma è comunque nell’ordine dei micrometri.

Sono stati sviluppati diversi tipi di configurazioni sperimentali:

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 Cell-attached mediante un micromanipolatore, si appoggia la pipetta

sopra la cellula. Generando una pressione negativa, parte della cellula

prende contatto con la pipetta e si forma il sigillo e si può quindi

procedere alla misura dell’attività del canale/canali. Questa tecnica è

molto difficile in quanto il noise elettrico può essere maggiore della

corrente che si vuole misurare. Si può valutare la conduttanza del

singolo canale o i meccanismi di apertura o chiusura. Si possono

determinare cambiamenti a seguito di mutazione oppure come

agiscono determinati farmaci.

(slide corrente con cell

attached) si vedono dei

gradini nel single

Chanel. Utilizzando il

macro-patch si ha la

perdita del grafico a

forma squadrata. (slide

grafico macro patch)

 che

Inside-out una volta

la pipetta aderisce alla memebrana, si solleva la membrana e si

procede con lo studio di quel pezzettino di membrana. Questa tecnica permette di accedere alla parte

intracellulare dei canali. (slide grafico macro patch) cAMP regola la corrente If, in quanto un aumento di Camp

porta ad un aumento di corrente If. Isolando un pezzetto di membrana, vi erano solo i canali If e mettendo

all’esterno cAMP e si è visto che in presenza di cAMP l’ampiezza della corrente aumentava.

 Whole-cell: configurazione più utilizzata. Si passa sempre da cell-attached e si cerca di creare una pressione

negativa maggiore in modo da rompere il pezzettino di memebrana e i lembi della memebrana si legano alla

pipetta e ciò permette all’elettrodo di essere in continuità con il citoplasma della cellula. Ciò permette di

determinare le correnti di tutti i canali della cellula, ma anche cambiamenti nel voltaggio. Questa

configurazione permette di calcolare quanto tempo la cellula impiega ad aprire il canale/chiudersi. È difficile

discriminare la corrente di