Appunti biologia molecolare - Tecnica Souther blotting - trasferimento a secco - Ibridazione su filtro

Tecnica Souther blotting (trasferimento a secco)

La tecnica di Southern blotting consente di trasferire frammenti di DNA da un gel a un filtro, che può essere poi utilizzato per le tecniche di ibridazione. Quando effettuiamo una separazione su gel di agarosio per elettroforesi, il gel è molto fragile e i frammenti rischiano di andare persi. Questa tecnica permette di trasferire i frammenti nella stessa identica posizione di come si sono separati su un filtro di nylon, che è più resistente e riutilizzabile.

Una volta terminata la separazione elettroforetica e la colorazione con etidio bromuro, il gel viene trattato (immerso) in una soluzione di HCL 0,25 M per 7-8 minuti e poi in una soluzione di NaOH 0,4 N per 30 minuti.

Il trattamento con HCL crea nei frammenti dei siti apurinici, dove c’è una base purinica che viene tagliata via dall’acido forte (si rompe il legame N-glicosidico tra base e zucchero). Il trattamento con NaOH rompe i legami fosfodiesterei a livello dei siti organici e denatura il DNA, separando parzialmente i due filamenti. Questi trattamenti non comportano lo spostamento dei frammenti nelle maglie del gel, dove rimangono intrappolate, ma facilitano il trasferimento su filtro, soprattutto dei filamenti più grandi.

Sistemi di trasferimento

Si assembla poi il sistema di trasferimento. Ci sono due sistemi per effettuarlo:

Sistema idratato

• Si utilizza una vaschetta con all’interno un tampone ad elevata forza ionica, al cui interno si pone un supporto rivestito con carta da filtro Wattman (molto spessa) i cui lembi pescano nel tampone. Quindi, alla fine, tutta la carta è imbevuta del tampone.
• Sul supporto viene posto il gel e su questo viene posto il filtro (delle stesse dimensioni del gel) facendo in modo che vi sia perfetta aderenza e non si formino bolle d’aria.
• Sul filtro si poggiano 4-5 fogli di carta da filtro asciutta e una pila di tovagliolini asciutti. Si aggiunge poi un pesetto di 1 kg e si lascia pressato per circa 12 ore a temperatura ambiente (durante le quali i frammenti presenti nelle maglie del gel vengono attratti verso l’alto dalla parte asciutta passando quindi nel filtro).
• Dopo 12 ore, si disassembla e il filtro viene lavato con tampone per eliminare eventuali tracce di agarosio e poi cotto a 80° per circa 2 ore (oppure irradiato con raggi UV per alcuni minuti). Questo passaggio permette di fissare in modo permanente i frammenti su filtro che risulta immagine speculare del gel. Si usa quando la quantità di DNA non è moltissima e si ottiene un filtro.

Sistema a secco

Il sistema a secco si usa per grandi quantità di campione e permette di ottenere 2 filtri speculari di gel. Si allestisce direttamente sul bancone posando una pila di tovagliolini asciutti, poi...