Appunti biologia molecolare - Tecnica Souther blotting - trasferimento a secco - Ibridazione su filtro

Tecnica Souther blotting (trasferimento a secco)

Tecnica che permette di trasferire frammenti di DNA da gel a filtro (che può

essere poi utilizzato per le tecniche di ibridazione). Quando effettuiamo una

separazione su gel di agarosio per elettroforesi, il gel è molto fragile, e i

frammenti rischiano di andare persi. Questa tecnica permette di trasferire i

frammenti nella stessa identica posizione di come si sono separati su di un

filtro di nylon. (più resistente e riutilizzabile).

Una volta terminata la separazione elettroforetica e la colorazione con etidio

bromuro, il gel viene trattato (immerso) in una soluzione di HCL 0,25 M per 7-8

min e poi in una soluzione di NaOH 0,4 N per 30 minuti.

Il trattamento con HCL crea nei frammenti dei siti apurinici, dove c’è una

pase purinica viene tagliata via dall’acido forte (si rompe il legame N-

glicosidico tra base e zucchero).

Il trattamento con NaOH rompe i legami fosfodiesterei a livello dei siti organici

e denatura il DNA (allontana parzialmente i due filamenti).

Questi trattamenti non comportano lo spostamento dei frammenti nelle maglie

del gel dove rimangono intrappolate, ma facilita il trasferimento su filtro

soprattutto dei filamenti più grandi.

Si assembla poi il sistema di trasferimento. Ci sono due sistemi per effettuarlo:

1. Sistema idratato: si utilizza una vaschetta con all’interno un tampone

ad elevata forza ionica, al cui interno si pone un supporto rivestito con

carta da filtro Wattman (molto spessa) i cui lembi pescano nel tampone.

Quindi alla fine tutta la carta è imbevuta del tampone.

Sul supporto viene posto il gel e su questo viene posto il filtro (delle

stesse dimensioni del gel) facendo in modo che vi sia perfetta aderenza

e non si formino bolle d’aria.

Sul filtro si poggiano 4-5 fogli di carta da filtro asciutta e una pila di

tovagliolini asciutti. Si aggiunge poi un pesetto di 1 kg e si lascia

pressato per circa 12h a temperatura ambiente (durante le quali i

frammenti presenti nelle maglie del gel vengono attirati verso l’alto dalla

perte asciutta passando quindi nel filtro).

Dopo 12h, si disassembla e il filtro viene lavato con tampone per

eliminare eventuali tracce di agarosio e poi cotto a 80° per ~2h (oppure

C

irradiato con raggi UV per alcuni minuti). Questo passaggio permette di

fissare in modo permanente i frammenti su filtro che risulta immagine

speculare del gel.

Si usa quando la quantità di DNA non è moltissima e si ottiene un filtro.

2. Sistema a secco: si usa per grandi quantità di campione e permette di

ottenere 2 filtri speculari di gel.

Si allestisce direttamente sul bancone posando una pila di tovagliolini

asciutti, poi carta da filtro delle stesse dimensioni del gel, dopo si mette

uno dei due filtri di nylon e su questo si poggia il gel. Al di sopra del gel

si posa il secondo filtro di nylon, poi 3-4 fogli di carta da filtro e un altro

blocco di tovagliolini. Infine si posa il pesetto di 1kg.

Essendo il gel fortemente idratato, i frammenti sono attirati dalle

componenti asciutte e si muovono per capillarità verso l’altro, e per la

forza di gravità verso il basso.