Appunti di Biologia molecolare

Trascrizione

La trascrizione trasforma l'informazione contenuta nella sequenza di basi del DNA in una sequenza nucleotidica di RNA. È molto simile alla duplicazione a causa del suo funzionamento, ma abbiamo delle importanti differenze:

1. La nuova catena è costituita da ribonucleotidi.
2. È sintetizzata dalla RNA polimerasi e questa non necessita di un primer per iniziare la trascrizione.
3. È molto meno fedele della replicazione, questo perché non ha attività di proof-reading.
4. Copia solo alcune parti del genoma ma più volte.

L'enzima che è deputato alla sintesi dell'RNA è l'RNA POLIMERASI. Questo enzima dopo essersi legata al DNA lo apre, creando una bolla di trascrizione, che fornisce all'enzima il filamento stampo da cui è diretta la sintesi dell'RNA.

Le cellule procariotiche hanno un tipo di RNA polimerasi relativamente semplice che trascrive tutti i geni sia gli RRNA, che i...

tRNA e gli mRNA

Le cellule eucariotiche hanno 3 tipi di RNA Pol (1 % 3)

Ci occuperemo principalmente della RNA Pol II, in quanto questa si occupa della trascrizione della maggior parte dei geni mentre la I e la III si occupano della trascrizione di geni che codificano per RNA (VEDI DOPO)

• La RNA Pol I, localizzata nel nucleolo, trascrive il gene per il precursore degli RNA ribosomiali (40% dei trascritti totali)
• La RNA Pol II è responsabile della trascrizione della maggior parte dei geni, inclusi quelli codificanti proteine, e alcuni piccoli RNA nucleari (U1, U2, U4, U5)
• La RNA Pol III trascrive i geni per i tRNA, alcuni piccoli RNA nucleari (es. U6) e l'RNA ribosomiale 5S

Struttura: (detta a chela di granchio)

Il core enzimatico è composto dalle subunità 2α, β, β' e ω (+ σ)

Le subunità β formano le pinze della chela (β serve per il legame dei nucleotidi mentre β' serve per il legamento del filamento stampo)

al 3’); a differenza della duplicazione solo uno dei filamenti funge da stampo ed è la scelta del promotore a stabilire quale filamento viene trascritto

A sua volta l’inizio richiede 3 passaggi:

1. Legame polimerasi-promotore

Questo porta alla formazione del complesso chiuso.

2. Transizione

Il complesso chiuso subisce un cambiamento conformazionale in complesso aperto, in cui le catene si separano per circa 14 ntd attorno al punto di inizio.

L’apertura libera il filamento stampo, la polimerasi si posiziona ed entrano i primi 2 nucleotidi, questi vengono allineati al sito attivo ed uniti, a questo punto l’enzima comincia a muoversi lungo il filamento aprendo l’elica e richiudendola dopo il suo passaggio.

3. L’evasione porta alla formazione del complesso ternario stabile

Questa è la transizione verso la fase

di allungamento

Allungamento: Dopo aver sintetizzato un piccolo RNA inizia l'allungamento, questo necessita un cambio di conformazione che porta la polimerasi ad ancorarsi ancora di più al DNA. Durante l'allungamento l'enzima svolge e riavvolge il DNA, intanto trascrive e funge da correttore di bozze.

Terminazione: Dopo aver trascritto il gene la polimerasi si ferma e rilascia l'RNA, la terminazione è indotta da sequenze specifiche.

TRASCRIZIONE nei PROCARIOTI

L'enzima responsabile è l'RNA polimerasi batterica. Questa è in grado di iniziare la trascrizione in qualsiasi punto del filamento. È costituito da più subunità, è infatti definito RNA Polimerasi Oloenzima. Il core catalitico è costituito da β e β'. La subunità α è richiesta per l'assemblaggio del core dell'enzima, per il riconoscimento del promotore e per l'interazione con gli effettori.

subunità ω contribuisce alla stabilità del complessoproteico

La subunità σ fa aumentare l’affinità dell’enzima per il DNA, questo è un fattore d’inizio che converte il core nella forma che è in grado di iniziare solo dai promotori

In E. coli la σ predominante è la σ70

Questo si lega a due sequenze conservate, centrate rispettivamente a (circa) -10 e -35 nucleotidi dal punto di inizio detto +1, questo, (+1) è di solito (>90% delle volte) una purina

Spesso è la base centrale della sequenza CAT, ma la conservazione della tripletta non è frequente

Le sequenze sono dette “sequenze (o elementi) a -35 e -10 (chiamato anche TATA box)”

La TATA box è spesso chiamata anche pribnow box; e può essere indicato nella forma T A T A A T ; La basi80 95 45 60 50 96

più importanti sembrano essere le più conservate la TA iniziale e la T finale

Queste sequenze sono

subunità α della RNA polimerasi. Si trova tipicamente nei promotori che sono molto espressi, quali quelli dei geni per gli rRNA. Mentre è possibile trovare promotori senza sequenza -35, questi però possiedono l'elemento -10 esteso

Il σ70 può essere suddiviso in 4 regioni, ognuna delle quali riconosce una sequenza del promotore. La regione 2 e 4 riconoscono gli elementi -10 e -35; all'interno delle regione 4 abbiamo 2 eliche che formano un dominio comune di legame al DNA chiamato elica-giro-elica (solco maggiore); lo stesso per la -10 che è riconosciuta da un'elica M.

L'interazione è più caratterizzata in quanto la -35 fornisce solo il legame mentre la -10 (TATA box) è essenziale per l'inizio della trascrizione in quanto qui inizia l'apertura della bolla.

L'elemento UP viene riconosciuto da un dominio carbossiterminale di α chiamato CTD, questo è unito a NTD da una connessione.

flessibileLEGAME POLIMERASI-RNAL’oloenzima si lega in modo non specifico all’RNA ed esegue una ricerca del promotore, quando lo trova si lega inmodo specifico

Il legame iniziale tra RNA polimerasi e promotore lascia il DNA nella doppia elica

Lo stadio successivo è un cambiamento di conformazione che comporta dei cambi strutturali e apre la doppia elica

Questa separazione è detta melting mentre la transizione è detta isomerizzazione, questa non richiede energia ma èspontanea

L’isomerizzazione porta a cambi strutturali tra cui la chiusura delle pinze e uno spostamento della regione n-terminale di σ (questo fa in modo che non blocchi più il DNA)

PARTICOLARITÁ della RNA polimerasi è che può iniziare la trascrizione senza bisogno di un primer, per fare questoperò il ribonucleotide deve essere portato all’interno del sito attivo e tenuto legato allo stampo mentre il ntdsuccessivo viene portato

all’interno nel giusto assetto affinchè avvenga la polimerizzazione

La trascrizione avviene per appaiamento delle basi all’interno della bolla di DNA non appaiato

Durante la trascrizione la bolla si mantiene all’interno dell’RNA polimerasi

l’enzima svolge il DNA, sintetizza l’RNA e riavvolge il DNA

La bolla si sposta insieme all’RNA, la polimerasi man mano che l’enzima si muove lungo il DNA e la catena dell’RNA siallunga

Inizio abortivo

Quando il ribonucleotide di inizio è entrato nel solco centrale inizia il periodo abortivo, in questa fase l’enzimasintetizza corte catene di RNA senza però dissociarsi

Quando la polimerasi riesce a sintetizzare un filamento più lungo di 10 basi si forma un complesso ternario (enzima-stampo-catena in crescita)

Questo è segno che l’enzima funziona e può iniziarel’allungamento

Appena la RNA polimerasi, oloenzima, ha superato lafase abortiva e inizia a

spostarsi lungo lo stampoallungando l RNA, si dissocia il fattore σ che raggiunge ilcore di una nuova polimerasi per iniziare la sintesi di unnuovo RNA (ciclo di σ)

Allungamento È il passaggio nella reazione di sintesi della macromolecola quando la catena nucleotidica si allunga per l’aggiunta disubunità

Dopo diversi tentativi, quando la RNA polimerasi riesce a sintetizzare un frammento più lungo di 10 nt, inizia la fasedi allungamento e si ha poi il distacco del fattore σ

Questa fase è più semplice degli eucarioti poiché non ci sono i nucleosomi

L’allungamento è catalizzato dal core enzimatico e procede alla max velocità di 40 basi/sec

L’allungamento si arresta in presenza del nucleotide scorretto

Terminazione È il passaggio che termina la sintesi della macromolecola bloccando l’addizione delle subunità, e generalmentecausando la dissoluzion