Tecnica Insetto Sterile

La transgenesi

La transgenesi (Fig.2) è una tecnologia altamente efficiente e sicura che permette di sviluppare insetti sterili tramite la tecnica della microiniezione. Drosophila melanogaster è stato il primo insetto transgenico realizzato (Spradling e Rubing 1982).

L'approccio consente di sterilizzare i maschi senza interferire con la spermatogenesi e permette di mantenere i maschi transgenici competitivi in natura. Inoltre, non vengono utilizzate radiazioni come nella SIT convenzionale. Il gene di interesse viene clonato in un vettore e il costrutto viene poi iniettato negli embrioni. Gli adulti che si svilupperanno verranno analizzati e quelli idonei rilasciati in campo. Il sistema di trasformazione è di tipo binario, donatore-helper, e prevede l'utilizzo di due plasmidi incapaci di trasporsi singolarmente, in quanto difettivi per alcune caratteristiche. Il donatore

contiene dell'elemento le sequenze terminali ripetute invertite (ITR) P e tra di esse un marcatore fenotipico e il gene di interesse, senza la trasposasi. L'helper contiene i geni della trasposasi, mancante delle sequenze terminali. Il costrutto viene poi iniettato in cellule embrionali, gli adulti che si sviluppano da queste cellule daranno origine alla generazione trasgenica, che verrà sottoposta a screening. Il vettore di trasformazione che contiene il gene di interesse, viene iniettato nel polo posteriore dell'uovo, cellule polari che andranno a formare la linea germinale, all'inizio della fase del blastoderma, la tecnica è denominata microiniezione. Con lo sviluppo l'espressione della trasposasi del plasmide helper permetterà l'integrazione dell'elemento P con il gene d'interesse.

2.5 Sistemi gene-drive basati su CRISPR/Cas9 La trasmissione di caratteri negativi per la sterilità, per il controllo delle popolazioni di

Insetti dannosi, L'ultima nata delle tecnologie è possibile mediante la selezione di caratteri naturali ingegnerizzati. Per il gene targeting deriva da un sistema batterico di difesa da virus denominato CRISPR/Cas9 scoperto nel 2012. L'acronimo sta per (Fig. 3), Clustered Regularly Interspaced Short Palyndromic Repeats e fa riferimento a sequenze presenti nei genomi batterici che presentano ripetizioni palindromiche intervallate da sequenze di origine virale, dette protospacer. La difesa si realizza attraverso la trascrizione di RNA CRISPR (crRNA) che possiede una sequenza di origine virale e una ripetizione palindromica; quest'ultima dà origine a una struttura secondaria capace di interagire con un altro RNA, il trans-activating crRNA (tracrRNA), capace a sua volta di legare una nucleasi detta CRISPR-associata (Cas9). La porzione di origine virale del crRNA dirige Cas9 a tagliare il DNA virale. Questo sistema di difesa ricorda quello presente negli eucarioti.

basato sugli small interferingRNA (siRNAs), che guidano le proteine argonauta componenti catalitiche del RISC (RNA-inducedsilencing complex) a specifiche sequenze di RNA portando a silenziamento genico. Il gRNA ha duecomponenti: una sequenza di 20 nucleotidi complementare al target, all'interno di una sequenza dicirca 100 nucleotidi che forma la struttura secondaria necessaria per legare Cas9. La sequenza6target deve finire con 5'-NGG-3', il protospacer adjacent motif (PAM) per essere riconosciuta dalcomplesso Cas9-gRNA. Dopo il riconoscimento, Cas9 taglia il DNA tre nucleotidi a monte del PAM,nel filamento complementare e 3-8 nucleotidi a monte nel filamento non complementare. Lascelta del target, anche se 5'-NAG-3'necessità di avere il PAM pone qualche limitazione sullasembra funzionare. In ogni caso, in qualsiasi gene target è facile individuare una sequenza cheIl vantaggio di questa tecnica consiste nell'ereditabilità della

gene-drive soddisfi questi criteri. endonucleasi, ciò favorirebbe la diffusione delle mutazioni desiderate. (F Lorenzetti, E albertini, L-Frusciante, D Rosellini, L Russi, R Tuberosa, F Veronesi Miglioramento genetico delle piante-agrarie, 2018 Edagricole)

Figura 3. Endonucleasi CRISPR/Cas93.

Casi studio

3.1. Ceratitis capitata

La mosca mediterranea della frutta (Ceratitis capitata) (Fig.4), è uno dei più devastanti insetti esistenti sul pianeta, fa parte delle 250 specie di parassiti appartenenti alla famiglia dei Tephritidae.

Figura 4. Ceratitis capitata o mosca della frutta mediterranea dell'area sub-sahariana, Nativa del continente africano, precisamente si è diffusa nel bacino del Mediterraneo in centro e sud America, Hawaii e Australia, in meno di 200 anni. Nella seconda metà del il secolo scorso, è stato rilevato sporadicamente in diverse aree degli Stati Uniti come California, Florida e Texas (Fig.5).

Figura 5. Distribuzione di C.

capitata nel mondoIl successo delle infestazioni di C. capitata è dato dalla sua natura altamente polifaga, attacca più di 250 diversi tipi di frutta, verdure e noci e sulla capacità di adattare il suo ciclo vitale a diverse temperature e climi, riuscendo a svernare come larva in colture diverse. La SIT, su questo insetto, è stata utilizzata per indurre letalità embrionale e consentire la marcatura per il sessaggio dei soggetti rilasciati in campo. È stato utilizzato un promotore specifico per la spermatogenesi per la β2t. La trasformazione è stata effettuata mediante il sistema binario donatore-helper, sfrutta un transgene e un marker di selezione GFP, con un promotore artificiale stato evidenziato che. È o accoppiamenti effettuati da maschi omozigoti porterebbero al 100% di letalità embrionale. Il vantaggio di questo sistema risiede nell'elevata competitività dei maschi, dal momento che i loro organi riproduttivi.non vengono influenzati e gli accoppiamenti conducono ad un effettivo trasferimento di spermatozoi. Tuttavia, è molto importante che il promotore sia attivo solo all'inizio delle fasi di sviluppo. La fase letale può essere superata, durante lo sviluppo, sotto condizioni permissive negli impianti di allevamento, mentre dopo il rilascio in campo, tutto ciò non influenzerà i maschi ma solo la loro progenie. Il sistema impiega un gene proapoptotico iperattivo che causa letalità embrionale-specifica quando guidato da un transattivatore controllato dalla tetraciclina tTA. Per prima cosa è stato testato il trasferimento diretto con un sistema sviluppato in D. melanogaster ma sembra che il promotore utilizzato non sia attivo in C. capitata. Di conseguenza sono stati ricercati geni e promotori endogeni di C. capitata attivi durante la fase di blastoderma. È stata fatta una PCR con cDNA di diversi embrioni, in diverse fasi. Con la reverse PCR sono

Stati isolati geni epromotori ed è stato costruito un costrutto genico specifico per C.capitata. Il costrutto è stato iniettato in linea germinale e sono stati ottenuti embrioni transgenici, anche se l'ibridazione risultava piuttosto debole. Come accennato nei precedenti paragrafi, è stato anche sviluppato un metodo per la marcatura degli spermatozoi transgenici, basato sul gene della tubulina. Il gene della tubulina è stato isolato con una PCR da cDNA e una successiva reverse PCR. Il gene della tubulina è stato fuso con un marcatore fluorescente (tGFP), tutto il costrutto è stato inserito in un vettore piggyBace iniettato all'estremità posteriore degli embrioni, per causare la trasformazione germinale.

(MF Schetelig, F Scolari, A M. Handler, G Gasperi, E A Wimmer - New genetic tools for improving SIT in Ceratitis capitata: embryonic lethality and sperm marking, 2006 - Proceedings of the 7th International Symposium on Fruit)

Anastrepha suspensa (Fig.6), chiamata anche la mosca della frutta delle Antille, è un parente stretto della mosca della frutta messicana (A.ludens), le cui larve attaccano diversi tipi di frutta tropicali e subtropicali.

La manipolazione genetica del sesso è possibile, in quanto efficace sulla letalità embrionale dei soggetti femminili. È stato testato un sistema di sessaggio basato sul colore delle pupe, anche se la tecnica per l'allevamento delle larve è molto costosa e poco efficiente.

Il sistema di sessaggio embrionale transgenico TET-off (TESS) per Anastrepha suspensa, utilizza un costrutto genico con un promotore del gene embrionale α di A. suspensa, collegato ad un transattivatore Tet. Questo è stato utilizzato per guidare l'espressione di una variante fosfosamidata del promotore del gene della morte cellulare, Alhid, da Anastrepha ludens.

Il sistema utilizza lo splicing di un introne specifico per il sesso, collegato ad un effettore del gene apoptotico. La progenie derivata dai ceppi TESS9 eterozigoti era composta da un 80% di maschi, mentre quattro ceppi di TESS doppi omozigoti avevano il 100% di progenie esclusivamente maschile, con morte femminile in fase embriogenetica.

In un test su larga scala, oltre 30.000 uova di due ceppi hanno dato origine a una progenie al 100% esclusivamente maschile. L'approccio è altamente efficace ed economico, elimina la maggior parte, se non tutti, gli insetti femminili all'inizio dell'embriogenesi utilizzando un meccanismo apoptotico. Sono stati introdotti strati nell'introne per creare una femmina letale per A. suspensa, i geni sesso-specifici isolato dalla mosca mediterranea della frutta, è stato isolato e inserito il codone di inizio ATG del gene della morte cellulare di A. ludens (AlhidAla2). Questo è stato costruito all'interno del vettore letale.

Questa strategia uccide efficacemente tutte le femmine in cui l'introne è caduto durante l'elaborazione dell'RNA, ma non i maschi, che grazie agli esoni maschio-specifici, interrompono icodoni specifici di arresto. Al completamento della traduzione del gene apoptotico, le femminemuoiono mentre i maschi sopravvivono. (M F Schetelig, A M Handler - A transgenic embryonic–sexing system for Anastrepha suspensa, 2012 Elsevier) 3.3 Anopheles gambiae Anopheles gambiae (Fig. 7), famosa come vettore principale di trasmissione di numerose patologieparassitiche che colpiscono l'uomo, vettore principale del plasmodio della malaria, i vermiparassiti del genere Dirofilaria ed il virus della febbre chiamata O'nyong'nyong. Figura 7. Anopheles gambiae Su questa specie è stato testato il sistema CRISPR-Cas9 gene drive. Questa tecnologia richiede losviluppo di un endonucleasi gene drive che interferisca con la capacità delle zanzare di trasmetterela.

La malaria è stata inizialmente ispirata all'azione di una classe di elementi naturali.