Riassunto esame Microbiologia agraria, docente Tredici

Appunti di microbiologia agraria

Introduzione

Microbiologia: Scienza che studia i microrganismi. Microrganismo: Piccolo organismo che non è visibile ad occhio nudo, la grandezza dei microrganismi si aggira in media tra 1 µm e 1 nm. Rientrano nella categoria:

• Batteri
• Archea
• Funghi
• Microalghe
• Protozoi

I primi due rientrano nei Procarioti, i restanti negli Eucarioti. I virus sono trattati nella microbiologia anche se non sono organismi!

Una breve storia della microbiologia

• 1673-1723, Antoni van Leeuwenhoek descrive i microrganismi vivi che aveva visto sulla patina dei denti, nell’acqua della pioggia e in infusioni di grani di pepe.
• L’ipotesi che i microrganismi viventi derivino dalla materia inorganica è detta “generazione spontanea”. Secondo questa ipotesi una “forza vitale” forma la vita. L’ipotesi alternativa, che ha come principio che i microrganismi viventi derivino da una vita pre-esistente, si chiama “biogenesi”.
• 1668 Esperimento di Francesco Redi sull'abiogenesi. Un pezzetto di carne è inserito in un barattolo in vetro; nel barattolo aperto si ha comparsa di larve e mosche, mentre nel barattolo chiuso non si formano né mosche né larve. Redi prese otto barattoli, in ognuno dei quali introdusse pezzi di diversi animali: un serpente, dei pesci, delle anguille ed un pezzo di carne di bue, e li divise in due gruppi di quattro: senza tappo (gruppo di controllo, in cui venivano riprodotte le condizioni presenti nei luoghi dove "la generazione spontanea" era più evidente, quali macellerie, etc.) con tappo ('gruppo sperimentale'). Nei barattoli del gruppo di controllo si osservarono delle mosche, che venivano a diretto contatto con la carne e, dopo poco tempo, si sviluppavano diverse larve. Nei barattoli tappati non furono ritrovate né larve, né mosche. Da questi risultati Redi dedusse che le mosche potevano essere generate solo da altre mosche: nel barattolo aperto, infatti, le mosche erano entrate e avevano deposto le loro uova sulla carne; nel barattolo chiuso, invece, le mosche, impossibilitate ad entrare, non erano riuscite a depositare le loro uova sulla carne. Questi risultati non erano ancora conclusivi, poiché Redi, per eliminare qualsiasi dubbio sulla possibilità che la mancata circolazione d'aria, nei recipienti chiusi, potesse aver in qualche modo interferito con lo sviluppo delle larve, eseguì un altro esperimento nel quale i barattoli del gruppo sperimentale furono chiusi con della garza, che permetteva la circolazione dell'aria, impedendo l'ingresso delle mosche. Anche in questo caso non si svilupparono larve, confermando i precedenti risultati sperimentali.
• 1745-1750, John Turberville Needham, un ecclesiastico e naturalista inglese, partendo dall'osservazione che i microrganismi crescevano rigogliosamente in varie zuppe, ottenute dall'infusione di carne o vegetali, quando queste erano esposte all'aria, concluse che all'interno di tutta la materia, inclusi l'aria e l'ossigeno, era presente una "forza vitale" responsabile della generazione spontanea. Per avvalorare questa tesi, egli bollì per pochi minuti alcune delle sue zuppe, al fine di eliminare eventuali microbi contaminanti, e le versò in beute "pulite", chiuse con tappi di sughero; anche in questo caso, tuttavia, osservò la crescita dei microrganismi.
• 1765 Lazzaro Spallanzani un abate e biologo italiano, non convinto delle conclusioni di Needham, condusse degli esperimenti simili con diverse variazioni, applicando un metodo più rigoroso: innanzitutto, egli sottopose ad ebollizione di un'ora le zuppe, poi sigillò le beute di vetro che contenevano il brodo fondendo le aperture. Il brodo ottenuto era sterile e non si rilevò la crescita di microrganismi nemmeno dopo diversi giorni. In un gruppo di controllo, bollì il brodo solo per alcuni minuti e osservò che in queste beute crescevano microrganismi. In un terzo gruppo bollì il brodo per un'ora, ma chiuse le beute con tappi di sughero (che erano larghi abbastanza per il passaggio dell'aria) ed anche in questo osservò lo sviluppo di microrganismi. Spallanzani concluse che, mentre un'ora di bollitura sterilizzava la zuppa, pochi minuti non erano sufficienti per uccidere tutte le forme viventi inizialmente presenti ed inoltre che i microrganismi potevano essere anche trasportati dall'aria, come era avvenuto nelle beute del terzo gruppo.
• 1861: Louis Pasteur dimostrò che i microrganismi sono presenti nell’aria. La fiasca con il collo a S di Pasteur tenne i microbi fuori lasciando entrare l’aria.
• 1857-1914 Pasteur dimostrò che i batteri, che rovinavano il vino, potevano essere uccisi da un calore, non sufficientemente caldo da far evaporare l’alcool nel vino. Questa applicazione del calore elevato per un breve periodo è chiamata: Pasteurizzazione.
• John Tyndall scopre che ci sono forme di vita resistenti al calore grazie a Ferdinando Coni, questi microrganismi sono batteri detti "sporigeni". Inventa un metodo chiamato "Tyndalizzazione": l'infuso contenente i batteri viene portato ad ebollizione, poi raffreddato e poi riportato ad ebollizione; anche i batteri sporigeni muoiono.

Caratteristiche generali dei microrganismi

• Tutti i microrganismi sono stati scoperti recentemente;
• Hanno una attività metabolica estremamente veloce grazie al loro rapporto superficie/volume (espellono e assumono velocemente i prodotti);
• Hanno un'elevata flessibilità: producono un enzima alla volta;
• Sono estremamente diffusi;
• Hanno resilienza molto elevata;
• Nonostante vi sia una grande eterogeneità di gruppi biologici, vengono utilizzate tecniche di studio molto simili tra loro.

Importanza dei microrganismi e della microbiologia

• Studio dei microrganismi dannosi: patogeni e parassiti che si sviluppano danneggiando altri organismi;
• Microrganismi benefici o "buoni". Possono essere specifici o generali. Esempi di specifici: i simbionti (rizomi delle leguminose) o nell'industria alimentare (lieviti). Esempi di generali: microalghe negli oceani (responsabili insieme alle piante della fotosintesi) e i funghi nelle terre (demoliscono la sostanza organica).

Richiami di chimica per la microbiologia

Energia: capacità di compiere un lavoro, l’unità di misura è il Joule. Energia libera: energia utile implicata nelle reazioni chimiche, l’energia che viene persa viene chiamata entropia. Di solito viene indicata con G (energia libera di Gibbs). ΔG: Variazione di energia libera, è uguale a ΔH-TΔS, il valore calcolato a condizioni standard (25°C, 1 atm, reagenti e prodotti in concentrazione molare) viene indicato con ΔG⁰. In microbiologia, a condizioni standard (pH 7) si utilizza il ΔG^0'.

Le reazioni possono essere:

• Esoergoniche: o spontanee rilasciano energia, ΔG < 0;
• Endoergoniche: o non spontanee richiedono energia, ΔG > 0.

Molte reazioni spontanee però nella pratica non avvengono in tempi accessibili, ad esempio: ΔG = -3000 KJ/mole, quindi la reazione è spontanea, ma cellulosa + O₂ non avviene perché ci vuole un input iniziale, cioè l’energia di attivazione. Queste molecole hanno una stabilità che va rotta, il ΔG^0' dà indicazioni riguardo alla direzione che prende una determinata reazione ma non dice nulla sulla velocità con cui questa avviene. I catalizzatori abbassano l’energia di attivazione, in natura i catalizzatori sono gli enzimi; grazie a loro le reazioni cellulari sono più veloci di 10⁸-10²⁰ volte. Gli enzimi:

• Entrano ed escono dalla reazione senza variazioni;
• Possono catalizzare anche la reazione inversa;
• Hanno un gruppo prostetico metallico;
• Coenzimi: molecole che si associano agli enzimi e li aiutano nella reazione.

La fonte di energia è l’ATP. Reazioni RedOx: reazioni nelle quali vengono scambiati gli elettroni, a volte sono associati a protoni (scambio di idrogeni).

• Sostanza che perde l’elettrone: è la sostanza riducente (o donatore) ed è colui che si ossida;
• Sostanza che acquista l’elettrone: è la sostanza ossidante (o accettore) ed è colui che si riduce.

Non tutte le sostanze hanno la stessa tendenza a donare o accettare elettroni, ad esempio H₂ è un tipico riducente, mentre l’O₂ e il fluoro sono tipici ossidanti. Questa tendenza si misura tramite un potenziale di ossido-riduzione: si indica con E⁰, se misurato a pH=7 si indica con E^0'. Dell’idrogeno E⁰=0V, E_H2=-0,42, E_O2=+0,82. ΔG^0' = -nFΔE^0' dove n è il numero di elettroni coinvolti, F è la costante di Faraday e ΔE^0' è la differenza tra i potenziali di ossido-riduzione delle molecole coinvolte.

Coppia red-ox: è la coppia formata dalla stessa molecola ossidata e ridotta, è stato stabilito che la forma ossidata sta sempre a sinistra:

Crescita dei microrganismi

La crescita dei microrganismi avviene quando si ha un aumento o di numero di cellule o di massa cellulare di uno o più microrganismi (Il concetto di crescita è diverso dal concetto di vita). Per essere definita crescita devono crescere tutti i costituenti della cellula.

Modi di crescita:

• Scissione binaria (tipica dei batteri)
• Gemmazione (tipica dei lieviti)
• Frammentazione (presente in alcuni cianobatteri)
• Crescita apicale (tipica dei funghi)

Colonia: Popolazione microbica di cellule tutte uguali. Coltura microbica: Colonia sparpagliata. Inoculo: quando viene presa una parte della popolazione e viene messa in un altro posto in condizioni differenti.

Scissione binaria batterica

Scissione Binaria dei batteri: il tempo di generazione varia da pochi minuti a mesi. L’intervallo di tempo necessario al batterio per riprodursi è detto tempo di generazione (o tempo di duplicazione) e varia tra i differenti microrganismi e a seconda delle condizioni di crescita. Si consideri una determinata specie di batterio che si divide, per esempio, ogni 20 minuti. Partendo al tempo 0 avremo un numero di cellule o batteri ben definito che chiameremo popolazione al tempo 0 o popolazione iniziale, dopo 20 minuti di tempo si formerà la prima generazione e la nuova popolazione al tempo 1 conterrà il doppio delle cellule o batteri iniziali rispetto alla popolazione al tempo 0. Dopo ulteriori 20 minuti (quindi dopo 40 minuti dal tempo 0) si formerà la seconda generazione e quindi il numero di cellule o batteri, presenti a questo tempo, che chiameremo popolazione al tempo 2 sarà il doppio rispetto alla popolazione precedente (popolazione al tempo 1) ed il quadruplo rispetto alla popolazione al tempo 0. Durante la fase di crescita esponenziale del nostro esempio, quindi, ogni venti minuti, la popolazione batterica raddoppia di numero.

(Notare bene che nella fase di crescita esponenziale, pochissime cellule andranno incontro alla morte e quindi il numero di cellule che muoiono è trascurabile rispetto a quelle vive che si dividono e raddoppiano in numero al trascorrere di ogni intervallo di tempo di generazione.)

Per cui il numero di microrganismi di una popolazione in fase di crescita esponenziale sarà dato sempre da 2ⁿ, dove n è il numero di generazioni. In genere si conoscono il numero di cellule al tempo t (N_t). Da N₀ e il numero iniziale di cellule o numero di cellule al tempo 0 (N₀) si può conoscere il numero di generazioni (n).

Infatti:

Ponendo in logaritmo di base 10 si ottiene:

da cui:

La velocità di crescita (R) è data dal rapporto del numero di generazioni (n) e il tempo di incubazione (t):

Il tempo necessario al raddoppio della popolazione o tempo di generazione (G) sarà:

Se durante il periodo di crescita di una coltura eseguiamo a vari intervalli di tempo in condizioni ottimali una conta totale o vitale, possiamo costruire un grafico della popolazione microbica in funzione del tempo ottenendo delle curve caratteristiche.

1. Fase di latenza: Fase di adattamento alle condizioni di crescita (temperatura, terreno di coltura), N° di cellule costante nel tempo, durata variabile.
2. Fase esponenziale: fase di duplicazione cellulare in cui la velocità di crescita è costante e dipendente dalle condizioni di crescita, N° di cellule in aumento nel tempo e tutte le cellule impiegano lo stesso tempo per duplicarsi, tempo di generazione variabile e dipendente dalla specie batterica e/o dalle condizioni di crescita.
3. Fase stazionaria: Interruzione della crescita, N° di cellule costante nel tempo, equilibrio tra divisione cellulare e morte (crescita criptica) accumulo di metaboliti tossici, scarsità di nutrienti.
4. Fase di morte: diminuzione del numero di cellule vive nel tempo, andamento in molti casi logaritmico (ogni ora muore una percentuale costante di cellule) accumulo di metaboliti tossici, scarsità di nutrienti.

Ci sono cellule che sono programmate per morire (in momenti di stress), Programmed Cell Death (PCD), per dare nutrienti alle altre. Ma prima o poi, essendo un ambiente limitato, i nutrienti finiscono.

Alcuni metodi di coltura

Fermentatore: Contenitore sterile dove si svolge una fermentazione, ovvero dove si coltivano i microrganismi. Siccome i microrganismi tendono a sedimentarsi sul fondo del fermentatore, all'interno è presente una ventola che omogeneizza il liquido di coltivazione (che è una soluzione contenente nutrienti); quando vengono inoculati nutrienti l'elica ruota e la coltura cresce.

Batch: è un tipo di coltura in cui vengono messi i microrganismi all'interno ma poi viene lasciata stare, nulla entra nulla esce (ad esclusione dell'aria).

Semicontinua/continua: altri metodi, flussi di ingresso e uscita permanenti o semipermanenti.

Fattori ambientali che influiscono sulla crescita

Fattori che influenzano la crescita delle cellule microbiche:

• Corredo genetico della cellula
• Micro e macro-nutrienti per costruire le strutture cellulari
• Energia
• Ambiente adeguato:
• Temperatura
• Ossigeno
• pH
• Disponibilità d'acqua

Temperatura

La temperatura influisce direttamente nella cellula microbica, tramite l'effetto sulla velocità di lavoro degli enzimi, questi infatti riescono a lavorare meglio se le temperature sono abbastanza alte ma sopra ad una certa temperatura l'enzima si destruttura. Mentre influisce indirettamente sullo stato dell'acqua, infatti la crescita avviene solo se l'acqua è liquido. Per cui a causa di questi effetti diretti e indiretti si possono trovare tre valori di temperature cardinali per ogni organismo: minima, massima ed ottimale.

Si possono distinguere i gruppi microbici in base alle temperature in cui crescono:

• Psicrofili: amanti del freddo, optimum sotto i 20°C. Si possono dividere in: obbligati (muoiono sopra i 20°C) e psicrotolleranti (mesofili che tollerano il freddo)
• Mesofili: optimum tra i 20°C e i 45°C
• Termofili: optimum tra 45°C e 80°C
• Ipertermofili: optimum sopra gli 80°C

Ognuno di questi gruppi ha una membrana cellulare diversa, composta cioè da diversi acidi grassi (es. gli psicrofili contengono molti acidi grassi insaturi).

Utilizzo della temperatura per conservare gli alimenti: gli alimenti si possono conservare più a lungo riducendo notevolmente la carica batterica, ad esempio variando la temperatura: bollendo o congelando. Ad esempio nel caso di marmellate o conserve si uccide il botulino portandole ad ebollizione, in quel caso bisogna fare attenzione perché il botulino è un batterio sporigeno di conseguenza le spore non vengono distrutte dalla bollitura. Il congelamento non uccide i batteri perché a -5/-10°C l'acqua non essendo pura non solidifica correttamente e si formano delle sacche di acqua liquida, quindi si utilizza il processo di surgelazione che porta gli alimenti a -25°C.

Ossigeno

Gli organismi si dividono in:

• Aerobi: hanno necessità di ossigeno per respirare, a loro volta suddivisi in:
• Obbligati: senza muoiono
• Microaerofili: aerobi in piccole percentuali (<2%)
• Anaerobi facoltativi (sono aerobi ma senza ossigeno si avvalgono di meccanismi facoltativi)
• Anaerobi, vivono anche senza ossigeno, si trovano in sedimenti marini, lacustri, apparati digerenti, sacche gengivali e terreni sommersi e sono a loro volta suddivisi in:
• Obbligati (muoiono con ossigeno, in alcuni casi bastano poche molecole)
• Aerotolleranti (non lo vogliono ma lo tollerano)

Negli anaerobi obbligati si formano radicali liberi (a causa del forte potere ossidante dell'ossigeno):

O₂ + e^- → O₂^-

O₂^- + e^- + 2H⁺ → H₂O₂

H₂O₂ + e^- + H⁺ → OH• (radicale ossidrile) + H₂O

Per quanto riguarda la conservazione degli alimenti, la conservazione sottovuoto (senza aria, di conseguenza senza ossigeno) è buona a fini chimici: la mancanza di ossigeno per...