Riassunto esame Biologia e Genetica, Prof. Mancone-Tripodi, libri consigliati Karp e Russel

III.

Replicazione semidiscontinua: In E. coli una proteina, la DNAa inizia la replicazione legandosi

prima alle sequenze 9mer, facilita la separazione della doppia elica e crea la bolla di replicazione.

Entrambi i filamenti di DNA sono sintetizzati in direzione 5’⇾3’. Durante la reazione di

il gruppo OH all’estremità 3’ del primer effettua l’attacco nucleofilo sul 5’ α-fosfato

polimerizzazione,

del nucleoside che deve essere inserito.

Ambedue le pol si muovono in direzione 3’⇾5’, di conseguenza uno dei filamenti cresce in direzione

della forcella (sintetizzato processivamente) e l’altro in direzione opposta; quest’ultimo filamento

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cresce in maniera discontinua: prima che la sintesi di un frammento inizi la forcella di replicazione

deve esporre un tratto di stampo sufficiente.

Il filamento sintetizzato processivamente è detto filamento guida, quello discontinuo filamento in

ritardo, perchè deve aspettare che i filamenti parentali si separino esponendo porzioni aggiuntive

di stampo.

Il filamento in ritardo è sintetizzato a frammenti (frammenti di Okazaki) che vengono rapidamente

legati a pezzi più lunghi a creare un filamento continuo dalla DNA ligasi.

L’avvio della duplicazione si deve ad una RNA pol chiamata primasi che costruisce un primer RNA

temporaneo (anche la sintesi del filamento guida è iniziato da una primasi). I filamenti di RNA

sintetizzati all’estermità 5’ servono come primer per la sintesi di DNA per la DNA pol, vengono poi

rimossi e gli intervalli vengono poi saldati da parte della DNA ligasi.

Lo srotolamento e la separazione del duplex avviene grazie ad una elicasi che srotola il duplex di

DNA e le proteine che legano il DNA a singolo filamento (SSB), grazie all’idrolisi di ATP che gli

permette di rompere i legami H.

E. coli presenta 12 differenti elicasi, tra cui l’elicasi DnaB: costituita da 6 subunità assemblate a

formare una proteina a forma di anello che circonda un filamento di DNA. Inizialmente viene

posizionata in ORI con l’aiuto della proteina DnaC e si muove in direzione 3’⇾5’ lungo il filamento in

ritardo srotolando l’elica. Lo srotolamento è supportato dall’attacco delle proteine SSB (Single-

Stranded DNA Binding Protein: sono proteine la cui chimica è complementare, indipendentemente

dalla sequenza, alla singola elica di DNA. Tale proteine, che vengono riposte man mano che la DNA

polimerasi scorre, permettono alla forcella di rimanere aperta.) che legano selettivamente il DNA

mantenendolo in uno stato disteso e impendendogli di riavvolgersi.

Nei batteri la primasi e l’elicasi si associano temporaneamente formando il primosoma, l’elicasi si

muove lungo il filamento in ritardo senza essere mai rilasciata dallo stampo fino a quando è presenta

la forcella. La primasi nel frattempo lega la elicasi ad intervalli regolari e sintetizza brevi primer di

RNA che portano alla sintesi dei frammenti di Okazaki.

La sintesi viene effettuata dalla pol III che si sposta da un frammento all’altro legandosi al 3’ OH

dell’RNA primer ed inizia ad incorporare nucleotidi.

Le due polimerasi lavorano come se fossero parte dello stesso complesso, e possono replicare

entrambi i filamenti ripiegando il DNA del filamento in ritardo ad ansa facendo in modo che esso

assuma lo stesso orientamento del filamento guida. Quando la pol che forma il filamento in ritardo

raggiunge l’estremità 5’ del frammento di Okazaki sintetizzato precedentemente lo stampo viene

abbandonato e la pol inizia a lavorare sull’estremità 3’ del primer

successivo.

● Struttura e funzione delle DNA pol: la DNA pol III è

parte di un grande complesso chiamato oloenzima DNA

polimerasi III (replisoma): una delle subunità non catalitiche è

la pinza β e ha il compito di mantenere la pol associata al DNA

stampo. Infatti le DNA pol devono essere contemporaneamente

in grado di rimanere associate allo stampo per lunghi tratti, ma

devono essere in grado di spostarsi. Queste proprietà sono

assicurate da una coppia di subunità β che formano una

struttura a ciambella attraverso cui passa il DNA. La funzione

della subunità è tener costantemente agganciata la DNA Pol al

DNA, poiché la Pol non ha una grande affinità con esso e

tenderebbe dunque a distaccarsene.

La pol sul filamento guida resta legata ad una pinza beta, mentre

sul filamento in ritardo, quando termina la sintesi di un

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frammento di Okazaki la subunità viene rilasciata e la pol si lega ad una nuova

al punto di giunzione RNA primer-stampo di DNA.

(γ) che contiene due subunità τ che fissano la pol

L’assemblaggio richiede un caricatore di pinza

centrale al complesso e legano l’elicasi: il caricatore, quando è legato ATP, si lega ad una giunzione

primer-stampo arrestando la pinza beta in una conformazione aperta, una volta che il DNA è passato

l’ATP viene idrolizzato portando alla chiusura della pinza che è pronta a legare la pol III.

Complesso γ: è costituito da subunità γ, Δ, Δ’, ξ (xi) e ᴪ

Il (psi). Ha la funzione di caricare la pinza

recluta la subunità β, sul

a morsa sul DNA: filamento tardivo, svolge una attività costante in quanto

è richiesta una continua attività di reclutamento del core enzimatico e della sua morsa scorrevole.

ɑ, ε e θ.

La Polimerasi Core: è composta da tre subunità:

La subunità α è l’enzima, che fa il legame fosfodiesterico.

La subunità ε ha attività di proof-reading: esonucleasica 3’ → 5’,

(correzione di bozze) un’attività

inversa dall’attività compiuta dalla DNA Polimerasi I. Un errore nella duplicazione porta ad un

cambiamento nella conformazione della doppia elica, ad una sua distorsione. La DNA Polimerasi se

ne accorge e dunque, con la sua attività esonucleasica, rimuove l’errore. C’è una frequenza di errore

permessa, senza la quale non potremmo avere eventi di mutazione.

Quando ha terminato la replicazione di una sequenza la Pol III deve fare spazio alla DNA Polimerasi

I che, con attività esonucleasica, rimuove il primer, seguita poi dalla ligasi che lega le estremità.

La pol I costituita da una singola subunità, è preposta alla riparazione del DNA e rimuove gli RNA

primer all’estremità 5’ di ogni frammento di Okazaki e li sostituisce con DNA.

DNA pol II: non ha una funzione ben chiara, sicuramente riempie interruzioni della catena indotti da

danni strutturali. E’ un enzima di recupero e se c’è uno stress in corso, dove è più facile sbagliare la

sintesi di DNA, questo enzima lavora, con modalità non sono ancora chiare.

Attività esonucleasiche delle DNA pol: (“ESO” significa che si parte dall’esterno: una esoproteasi

degrada le proteine dall’estremità C-terminale o N-terminale; una endoproteasi rimuove i legami

peptidici al centro. Una esoproteasi lo fa dall’esterno, una endonucleasi dall’interno.) Le DNA pol

sono in grado di degradare un polimero di DNA rimuovendo uno o più nucleotidi dall’estremità della

molecola. Esistono esonucleasi 3’⇾5’ e 5’⇾3’, la DNA pol I possiede entrambi queste caratteristiche

esonucleasiche oltre che quella di polimezzare nucleotidi, grazie a tre diversi domini: la esonucleasi

5’⇾3’ può degradare entrambi gli acidi nucleici, i frammenti di RNA lasciati all’estremità 5’ dei

frammenti di Okazaki vengono rimossi dalla DNA pol I che riempe l’intervallo formatosi (l’ultimo

nucleotide inserito viene legato all’estremità 5’ di DNA dalla ligasi).

Un errore nella replicazione del DNA produce una mutazione permanente, in E. coli ciò avviene ogni

-9 -6

10 basi, dato che E. coli contiene 4x10 bp il tasso di errore è di 1 ogni 100 cicli ripetitivi, questo

rappresenta il tasso di mutazione spontanea nel batterio.

Durante la polimerizzazione se il nucleotide entrante è riconosciuto come corretto si ha un

cambiamento conformazionale che porta la pol ad afferrare il nucleotide, se l’appaiamento è

scorretto il sito attivo non assume la conformazione richiesta e il nucleotide non viene incorporato;

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quando questo però non succede (1 volta ogni 10 o 10 nucleotidi incorporati) l’estremità del

filamento ha una maggiore tendenza a separarsi dallo stampo formando un estremità 3’ a singolo

filamento che entra nel sito esonucleasico. La pol quindi grazie all’attività esonucleasica 3’⇾5’ lo

rimuove. Questa attività di proof-reading rimuove 99 su 100 basi appaiate male, esiste inoltre un

metodo di riparazione post replicativa dell’appaiamento errato.

Le due molecole di Core sono tenute insieme dalla subunità dimerica Theta. Ciò che scorre

non è la polimerasi sul tardivo, ma è il tardivo che scorre nella polimerasi.

● A mano a mano che i tratti del filamento stampo sul tardivo vengono separati dalla

catena complementare, vengono ricoperti dalle SSB e formano un’ansa che è lo scorrimento

del filamento tardivo sul complesso. 75

● Quando il frammento di Okazaki è stato completato, la Polimerasi del segmento

tardivo si dissocia dal DNA, ma rimane attaccata la subunità theta. Per fare ciò il beta clam

deve togliersi. Quindi completato il frammento, il Core rimane attaccato alla subunità theta

per potersi associare ad una nuova morsa B, ricominciando la sintesi di un nuovo frammento.

Abbiamo quindi che:

● Su entrambi i filamenti lavora un singolo dimero di DNA Pol III (Core alpha e

theta+beta). Il coordinamento si realizza facendo piegare ad anello il DNA della catena lenta

e procedendo insieme nei due processi di polimerizzazione.

● DNA B elicasi e primasi formano un’unità funzionale nel complesso replicativo

chiamato Primosoma. L’elicasi dissocia la doppia elica e la primasi si associa

temporaneamente per la sintesi del Primer di RNA.

● Il complesso della Pol III catalizza l’aggiunta di una subunità beta, che funziona come

una pinza, al nuovo primer a RNA. Quindi la porzione superiore non si distacca mai dal

filamento guida, mentre l’altro fa un frammento di Okazaki poiché la core è attaccata alla

subunità beta e ha il suo anello a morsa che le consente di rimanere legata alla molecola di

DNA.

● Quando la sintesi del frammento di Okazaki è completata, la subunità alpha e theta

si distaccano dalla beta e dal frammento stesso e si associano ad una nuova subunità beta.

Quindi si