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Esame di Biologia e genetica docente Prof. C. Mancone

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piccolo procariote aerobio. Resistendo alla digestione all’interno del citoplasma, il piccolo procariote

aerobio si stabilì come endosimbionte permanente. Se la cellula ospite si riproduceva, così faceva

anche l’endosimbionte, cosicché si riprodusse rapidamente una colonia di queste cellule composite.

Nel corso di molte generazioni, gli endosimbionti persero molte delle caratteristiche che non erano

più necessarie per la sopravvivenza e i microbi che respiravano ossigeno, subirono l’evoluzione nei

precursori degli attuali mitocondri: una simile evoluzione la ebbero le cellule vegetali, in cui il batterio

divenne un cloroplasto. I mitocondri e i cloroplasti contengono infatti sistemi genetici completi. Una

cellula, i cui antenati si fossero formati attraverso la sequenza di eventi simbiotici, potrebbe aver fato

origine ad una linea di cellule che ha evoluto altre caratteristiche fondamentali delle cellule eucariote,

un sistema di membrane, un citoscheletro ed un tipo mitotico di divisione cellulare. Il fatto che una

cellula abbia ingerito un batterio, gli permise di dar luogo alla fosforilazione ossidativa per

massimizzare la produzione di ATP.

Le prove a favore della teoria endosimbiontica sono:

- Presenza di doppie membrane;

- Presenza di DNA circolare;

- Presenza di ribosomi delle dimensioni procatiotiche;

- Divisione;

- Presenza di introni.

DNA mitocondriale: è una reliquia della storia antica. Sembra essere l’eredità di un singolo batterio

aerobico che si è quindi stabilito nel citoplasma di una cellula primitiva, diventata poi un antenato di

tutte le cellule eucariote. La maggior parte dei geni di questo simbionte antenato è andate persa

oppure, nel corso dell’evoluzione, trasferita nel nucleo della cellula ospite, lasciando solo una

manciata di geni, che codifica alcune tra le proteine più idrofili che della membrana mitocondriale

interna.

Genoma mitocondriale: è un cromosoma circolare superavvolto a doppia elica, privo di istoni, e

quindi non organizzato in nucleosomi. Le dimensioni del cromosoma variano da organismo a

organismo, ma sono costanti all’interno delle specie. Il contenuto informativo del genoma

mitocondriale è molto piccolo se raffrontato a quello nucleare, mentre la quantità relativa di DNA è

piuttosto grande. Nell'uomo il DNA mitocondriale consta di 16569 paia di basi e 37 geni (che

codificano per 13polipeptidi, 22 tRNA e 2 rRNA):

- 2 geni per RNA ribosomali;

- 22 geni per tRNA;

- 13 geni per polipeptidi;

- 7 delle 42 subunità del compl. I;

- 1 delle 11 subunità del compl. III;

- 3 delle 13 subunità del compl. IV;

- 2 delle 8 subunità dell’ATP-sintetasi;

Coinvolti nella produzione di proteine necessarie alla respirazione cellulare. La densità genica, il

numero di geni codificanti per proteine nel DNA mitocondriale, è di 784,59. Ogni mitocondrio

nell'uomo porta circa dieci copie del genoma mitocondriale associate in regioni nucleodi multiple.

Comunque molte proteine presenti nei mitocondri sono codificate dal DNA nucleare: la maggior parte

delle proteine dei mitocondri infatti è codificata dal nucleo e deve essere importata dal citosol.

Trasmissione mitocondri: I mitocondri vengono trasmessi dalla madre alla progenie attraverso il

citoplasma dell’oocita. I mitocondri contenuti nello sperma dei mammiferi non entrano nella cellula

uovo, in quanto le modalità di penetrazione dello spermatozoo e la costituzione anatomica dello

stesso consentono l'ingresso della sola testa, pertanto i mitocondri che hanno sede nel corpo non

vengono inseriti; in alcuni casi alcuni mitocondri paterni possono penetrare tuttavia vengono distrutti

dalla cellula uovo subito dopo la fecondazione. Nel 1999 venne dimostrato che i mitocondri dello

sperma paterno (contenenti mtDNA) vengono marcati con ubiquitina, per poter essere poi selezionati

20

per la loro distruzione all'interno dell'embrione. Il motivo è essenzialmente dovuto al fatto che con il

tempo i mitocondri dello spermatozoo (che devono lavorare molto intensamente per garantire attività

come ad esempio la motilità cellulare) vanno incontro a degenerazione e a mutazioni: di

conseguenza gli spermatozoi non condividono i mitocondri con la cellula uovo ma solo il genoma.

Malattie mitocondriali:

Le malattie ereditarie che dipendono da mutazioni nel DNA mitocondriale vengono perciò ereditate

per via materna. Possono essere affetti

da queste patologie sia gli individui di

sesso maschile che quelli di sesso

femminile ma solo la madre

trasmetterà alla progenie la patologia.

Il DNA mitocondriale può essere

alterato da mutazioni che spesso

determinano effetti deleteri

sull’organello associati a un certo

numero di patologie. Il DNA

mitocondriale ha un tasso di mutazione

elevato:

• I radicali liberi dell’ossigeno

della catena respiratoria

causano danni ossidativi al

mtDNA, non protetto da istoni;

• Il mtDNA va incontro a più cicli

di replicazione;

• I sistemi di riparazione del

mtDNA sono poco efficienti;

Esempi di malattie mitocondriali sono:

• Neuropatia ottica ereditaria di Leber;

• Epilessia mioclonica a fibre rosse irregolari (MERRF);

• Encefalopatia mitocondriale con acidosi lattica;

La neuropatia ottica ereditaria di Leber (LHON) è una malattia degenerativa che colpisce un tipo

particolare di cellule della retina, le cellule ganglionari. Si manifesta di norma in età giovanile o adulta

(15-30 anni): il paziente percepisce una perdita piuttosto rapida della vista (con sensazione di

annebbiamento e di colori attenuati), soprattutto nella parte centrale, mentre la cornice rimane nitida.

La situazione tende a stabilizzarsi nel giro di un anno; in alcuni (rari) casi, la malattia può regredire

spontaneamente e il paziente recupera da solo alcuni gradi di acuità visiva. La LOHN colpisce molto

più frequentemente i maschi.

I meccanismi di riparo del DNA mancano generalmente nei mitocondri. Il mtDNA può essere

sottoposto a livelli elevati di radicali dell’ossigeno che agiscono come mutageni: il DNA mitocondriale

risulta essere più fragile perché privo di istoni e perché è sottoposto ad un maggior numero di cicli

replicativi. In generale il tasso di mutazione del DNA mitocondriale è circa 10 volte maggiore di quello

del DNA nucleare.

Divisione del mitocondrio: Nuovi mitocondri originano dalla divisione di quelli già esistenti.

Il mitocondrio si accresce ed il suo DNA si duplica; la divisione dell’organello ha inizio con la

costruzione della membrana esterna; nel corso della divisione il DNA mitocondriale segrega in modo

casuale. 21

Decarbossilazione ossidativa del piruvato (β ossidazione).

Le molecole di piruvato prodotte dalla glicolisi sono trasportate attraverso la membrana

mitocondriale interna nella matrice, dove vengono decarbossilate per formare gruppi acetile a due

atomi di carbonio (-CH COO ). Il gruppo acetile forma poi un complesso con il coenzima A per

3 2

formare l’acetil CoA. Il coenzima A è un trasportatore di gruppi acetili legati mediante legami tioesteri.

La decarbossilazione del piruvato ed il trasferimento del gruppo acetile al CoA sono catalizzati dal

complesso multi enzimatico gigante della piruvato deidrogenasi. Ciclo degli acidi

tricarbossilici: una volta

formato, l’acetil CoA entra in

una via ciclica detta ciclo degli

acidi tricarbossilici (ATC) in cui

il substrato viene ossidato e la

sua energia conservata sotto

forma di NADH e FADH . Ad

2

eccezione della succinato

deidrogenasi, che è legata alla

membrana interna, tutti gli

enzimi del ciclo degli ATC si

trovano nella fase solubile

della matrice. Il primo passo

nel ciclo degli ATC è la

condensazione del gruppo

acetile a due atomi di carbonio

con l’ossalacetato a quattro

atomi di C per formare una

molecola di citrato a sei atomi

di C. Durante il ciclo, la catena

della molecola del citrato viene

accorciata, un carbonio alla volta, rigenerando la molecola a 4 atomi di C dell’ossalacetato, che può

tornare a condensarsi con un altro acetil CoA. Sono i due atomi di C rimossi durante il ciclo degli

ATC (che non sono gli stessi che vi erano stati introdotti con il gruppo acetile) ad essere

completamente ossidati fino ad anidride carbonica. Nel ciclo degli ATC avvengono quattro reazioni

in cui una coppia di elettroni viene trasferita da un substrato ad un coenzima accettore di elettroni.

+

Tre di queste reazioni riducono il NAD a NADH, una riduce il FAD a FADH . Il ciclo degli acidi

2

tricarbossilici è la via metabolica principale per la cellula. Infatti i metaboliti che iniziano il ciclo sono

gli stessi composti prodotti dalla maggior parte delle vie cataboliche della cellula. Ad esempio l’acetil

CoA è un importante prodotto finale di parecchie vie cataboliche, compresa la degradazione degli

acidi grassi, che vengono decomposti in unità di due atomi di C alla volta. Questi composti a due

atomi di C entrano nel ciclo degli acidi tricarbossilici come acetil CoA. Anche la degradazione degli

amminoacidi genera dei metaboliti che entrano nel ciclo arrivando nella matrice attraverso speciali

22

sistemi di trasporto sulla membrana mitocondriale interna. È evidente che tutte le macromolecole

che la cellula utilizza a scopo energetico (polisaccaridi, grassi e proteine) vengono decomposte in

metaboliti del ciclo degli ATC.

La prima tappa nell’ossidazione di un acido grasso è la sua attivazione, per legame con il gruppo

tiolico (-SH) del coenzima D, che avviene dopo che il gruppo acetile è stato trasportato attraverso la

membrana mitocondriale interna in associazione con una proteina trasportatrice. Nel mitocondrio, la

molecola dell’acil CoA è sottoposta ad una dissezione graduale, in cui un acetil CoA viene rimosso

dalla catena dell’acido grasso ad ogni giro del ciclo. In aggiunta alla molecola di acetil CoA che viene

introdotta nel ciclo degli ATC, ogni giro del ciclo degli acidi grassi produce un NADH ed un FADH .

2

I prodotti principali delle reazioni del ciclo sono i coenzimi ridotti NADH e FADH che contengono gli

2

elettroni strappati dai diversi substrati che sono stati ossidati. Il NADH è assieme al piruvato anche

uno dei prodotti principali della glicolisi. I mitocondri non sono però in grado di importare il NADH

che si forma nel citosol dalla glicolisi. I suoi elettroni sono utilizzati invece per ridurre un metabolita

+

a basso peso molecolare che può entrare nel mitocondrio e ridurre il NAD a NADH, oppure trasferire

i suoi elettroni al FAD producendo così FADH . Entrambi i meccanismi consentono di spostare gli

2

elettroni dal NADH citosolico alla catena di trasporto degli elettroni mitocondriale ed essere così

utilizzati per la formazione dell’ATP. La reazione globale che si può scrivere è:

+ +

Acetil CoA + 2H O + FAD + 3NAD + GDP + Pi 2CO + FADH + 3NADH + 3H +

2 2 2

GTP + HS-CoA

Ovviamente I prodotti vanno considerate due volte, in quanto le molecole di acido piruvico che

subiscono l’attacco del CoA e che entrano nel ciclo sono due. Vengono prodotte quindi 6 molecole

di NADH, 2 molecole di FADH , 2 molecole di ATP e 4 molecole di CO come prodotti principali.

2 2

Fosforilazione ossidativa: I coenzimi NADH e FADH vengono successivamente ridotti per

2

produrre ATP. Infatti questi contengono gli elettroni ad alta energia strappati dai diversi substrati che

sono stati ossidati. Gli elettroni trasportati dal NADH e dal FADH vengono usati per ridurre ossigeno

2

ad acqua, in una reazione altamente esoergonica. L’energia di ossidazione dei coenzimi viene

convertita in energia di legami fosfato dell’ATP.

FOSFORILAZIONE

Il processo complessivo può essere suddiviso in 3 tappe distinte:

1. Catena di trasporto degli elettroni: gli elettroni ad alta energia vengono passati dal FADH 2

o dal NADH attraverso una serie di trasportatori di elettroni che formano la catena di trasporto

degli elettroni localizzata nella membrana mitocondriale interna. Il passaggio degli elettroni

nella catena respiratoria avviene tramite reazioni che rilasciano energia. Tali reazioni sono

accoppiate a cambiamenti conformazionali dei trasportatori di elettroni, che spostano i

protoni al di là della membrana mitocondriale interna.

23

2. La traslocazione dei protoni e la creazione di una forza motrice protonica: l’energia

rilasciata durante il trasporto degli elettroni viene dunque immagazzinata sotto forma di

gradiente protonico tra i due lati della membrana. Gli elettroni a bassa energia vengono

trasferiti ad un accettore finale di elettroni, l’ossigeno molecolare (O ), che viene ridotto ad

2

acqua. +

3. Accoppiamento chemiosmotico: il ritorno controllato dei protoni (H ) attraverso la

membrana, mediante un enzima che sintetizza ATP, produce l’energia necessaria a far

procedere la reazione endoergonica che porta alla fosforilazione dell’ADP con formazione di

ATP. Il meccanismo con cui ciò avviene viene detto meccanismo chemiosmotico, ovvero

l’accoppiamento tra formazione di legami chimici e trasporto di membrana. Ogni coppia di

elettroni trasferita dal NADH all’ossigeno attraverso la catena di trasporto degli elettroni

rilascia energia sufficiente a formare circa tre molecole di ATP. Ogni coppia rilasciata dal

FADH ne libera abbastanza da formare circa due molecole di ATP.

2

Riassunto: Nella prima tappa della fosforilazione ossidativa quindi, i substrati come l’isocitrato ed

+

il succinato vengono ossidati e gli elettroni vengono trasferiti ai coenzimi NAD e FAD per formare

NADH e FADH . Questi elettroni ad alta energia vengono quindi trasferiti attraverso una serie di

2

trasportatori di elettroni della catena di trasporto degli elettroni. L’energia rilasciata viene utilizzata

per traslocare protoni dalla matrice allo spazio intermembrana, formando un gradiente

elettrochimico di protoni attraverso la membrana mitocondriale interna. Nella seconda tappa i

protoni si muovono in favore del gradiente elettrochimico, attraverso un complesso che sintetizza

ATP: l’energia accumulata nel gradiente viene utilizzata per sintetizzare l’ATP.

Ruolo dei mitocondri nella sintesi dell’ATP: I mitocondri vengono spesso descritti come centrali

energetiche. Essi estraggono energia da materiali organici e questa viene utilizzata per produrre un

gradiente ionico tra i due lati della membrana mitocondriale interna. I mitocondri utilizzano il

gradiente tra i due lati della loro membrana interna per attuare diverse attività, la più notevole delle

quali è la sintesi dell’ATP. Quando la formazione dell’ATP è dovuta all’energia che è liberata dagli

elettroni rimossi durante l’ossidazione di substrati, il processo è detto fosforilazione ossidativa, che

va distinta dalla fosforilazione a livello dei substrati, nella quale di forma ATP direttamente per

trasferimento di un gruppo fosfato da una molecola di substrato all’ADP.

Catena di trasporto degli elettroni.

Gli elettroni ad alta energia associati col NADH o con il FADH vengono trasferiti attraverso una serie

2

di specifici trasportatori di elettroni che costituiscono la catena di trasporto degli elettroni (o catena

respiratoria) della membrana mitocondriale interna.

Tipi di trasportatori di elettroni.

La catena di trasporto degli elettroni è formata da 5 tipi di trasportatori di elettroni legati alla

membrana:

- Flavo proteine;

- Citocromi;

- Atomi di rame;

- Ubiquinone;

- Proteine ferro-zolfo.

Con l’eccezione dell’ubiquinone, tutti i centri redox che accettano e cedono elettroni nella catena

respiratoria sono gruppi protestici, cioè composti di natura non amminoacidica associati a proteine.

 Le flavo proteine consistono in un polipeptide strettamente legato ad uno di due gruppi

prostetici simili, il flavin adenin di nucleotide (FAD) e il flavin minonucleotide (FMN). I gruppi

prostetici delle flavo proteine derivano dalla riboflavina e ciascuno è capace di accettare e

cedere due protoni e due elettroni. Le principali flavo proteine dei mitocondri sono la NADH

deidrogenasi della catena di trasporto degli elettroni e la succinato deidrogenasi del ciclo

degli ATC. 24

 I citocromi sono proteine che contengono gruppi eme. L’atomo di ferro dell’eme puà subire

3+ 2+

una transizione reversibile tra gli stati di ossidazione Fe e Fe , come risultato

dell’acquisizione e della perdita di un singolo elettrone. Nella catena di trasporto degli

elettroni sono presenti almeno tre specie di citocromi, a, b, c, differenti l’uno dall’altro per

sostituzioni nel gruppo eme.

 Tre atomi di rame, inseriti in un unico complesso proteico nella membrana mitocondriale

interna accettano e donano un singolo elettrone alla volta, alternandosi tra gli stati di

2+ 1+

ossidazione Cu e Cu .

 L’ubiquinone è una molecola liposolubile contenente una lunga catena idrofobica formata da

5 subunità isoprenoidi. Ogni ubiquinone è in grado di accettare e donare due elettroni e due

protoni. L’ubiquinone rimane all’interno del doppio strato lipidico della membrana, nel quale

è in grado di diffondere lateralmente.

 Le proteine ferro-zolfo sono proteine contenenti ferro in cui gli atomi di ferro non sono posti

all’interno di un gruppo eme, bensì sono legati ad atomi di zolfo inorganico come parte di un

centro ferro-zolfo. Anche se il singolo centro può contenere più atomi di ferro, l’intero

complesso è in grado di accettare o di donare soltanto un singolo elettrone.

I trasportatori della catena di trasporto degli elettroni sono disposti spazialmente in ordine di

potenziale redox crescente. Ogni trasportatore è ridotto dall’acquisto di elettroni dal trasportatore

precedente e, successivamente, è ossidato dalla cessione di elettroni al trasportatore che segue.

Così gli elettroni passano da un trasportatore al successivo, perdendo energia mentre si muovono

in discesa lungo la catena. L’accettore finale di questo passamano è l’O che accetta gli elettroni

2

ormai privi di energia ed è ridotto ad acqua.

Complessi di trasporto degli

elettroni: Nella membrana interna

è possibile osservare diversi

trasportatori di elettroni come

componenti di 4 complessi distinti,

asimmetrici, che attraversano

completamente la membrana,

definiti come complessi I, II, III e IV.

Due dei componenti della catena di

trasporto degli elettroni, il

citocromo c e l’ubichinone, non

fanno parte di nessuno dei 4

complessi. L’ubichinone esiste

come un pool di molecole disciolte

nel doppio strato lipidico e il

citocromo c come proteina

periferica di membrana. Si pensa che l’ubichinone e il citocromo c si muovano funzionando come

navetta per gli elettroni tra i grossi complessi proteici, relativamente immobili.

1. Complesso I (NADH deidrogenasi): il complesso I rappresenta l’ingresso alla catena di

trasporto degli elettroni, dato che catalizza il trasferimento di una coppia di elettroni dal NADH

all’ubichinone per formare l’ubichinolo.

2. Complesso II (succinato deidrogenasi): il complesso II è costituito da 4 polipeptidi, due

subunità idrofobiche che ancorano la proteina alla membrana e due subunità idrofiliche che

comprendono l’enzima del ciclo degli ATC succinato deidrogenasi. Il complesso II favorisce

una via per traslocare gli elettroni a bassa energia dal succinato al FAD e all’ubichinone. Il

25

passaggio dal FADH al sito catalitico dell’enzima dell’ubichinone porta gli elettroni attraverso

2

tra diversi centri ferro-zolfo.

3. Complesso III (citocromo bc1): il complesso III catalizza il trasferimento di elettroni

dall’ubichinolo al citocromo c. per ogni paio di elettroni trasferiti attraverso il complesso III,

quattro protoni vengono pompati attraverso la membrana.

4. Complesso IV (citocromo c ossidasi): la tappa finale del trasporto degli elettroni in un

mitocondrio è il trasferimento successivo degli elettroni dal citocromo c ridotto all’ossigeno.

La riduzione dell’ossigeno è catalizzata dal complesso IV, un enorme assemblaggio di

polipeptidi, più comunemente chiamato citocromo-ossidasi. Per ogni molecola di O ridotta

2

dalla citocromo ossidati, si pensa che 8 protoni vengano presi dalla matrice. Quattro di questi

protoni vengono consumati nella condensazione di due molecola d’acqua, e gli altri 4

vengono trasferiti al di là della membrana e rilasciati nello spazio intermembrana.

Riassunto: Gli elettroni entrano nella catena dal NADH (attraverso il complesso I) o dal FADH 2

(parte del complesso II). Gli elettroni vengono passati dal complesso I o dal complesso II

all’ubichinone che quindi si trova sotto forma di un pool di molecole nel doppio strato lipidico. Gli

elettroni vengono passati, in seguito, dall’ubichinone ridotto (ubichinolo) al complesso III e poi alla

proteina periferica citocromo c, che si pensa sia mobile. Dal citocromo c gli elettroni vengono trasferiti

al complesso IV (citocromo c ossidasi) ed infine all’O per formare l’H O.

2 2

Se si esaminano i potenziali redox della successione di trasportatori si nota che ci sono tre siti in cui

il trasferimento degli elettroni si accompagna ad un grande rilascio di energia libera. Ognuno di

questi siti di accoppiamento, è posto tra due trasportatori che fanno parte di uno dei tre complessiI,

III e IV. L’energia libera liberata quando gli elettroni passano attraverso questi siti viene conservata

dalla traslocazione di protoni dalla matrice, attraverso la membrana interna, nello spazio

intermembrana. Questi tre complessi proteici sono spesso conosciuti come pompe protoniche. La

traslocazione dei protoni da parte di questi complessi di trasporto degli elettroni produce il gradiente

protonico che rende possibile la sintesi dell’ATP. 2. La traslocazione dei

protoni e la creazione di una

forza motrice protonica.

Abbiamo visto che l’energia

libera rilasciata durante il

trasporto degli elettroni è

utilizzata per spostare i protoni

della matrice nello spazio

intermembrana e nel citosol. La

traslocazione dei protoni

attraverso la membrana interna

è un processo che produce un

voltaggio, perché ha come

risultato l’accumulo di un

maggior numero di cariche

positive nello spazio intermembrana e nel citosol e di un maggior numero di cariche negative

all’interno della matrice. Quindi bisogna considerare due componenti del gradiente protonico:

• Un gradiente chimico, che deriva dalla differenza di concentrazione tra gli ioni idrogeno da

un lato della membrana rispetto all’altro lato;

• Un gradiente elettrico, che deriva dalla separazione di carica tra i due lati della membrana.

26

Un gradiente con tali caratteristiche è detto gradiente elettrochimico.

3. Accoppiamento chemiosmotico: utilizzo del gradiente protonico per la produzione

dell’ATP: L’enzima sintetizzante l’ATP è detto ATP sintetasi ed è un complesso proteico a forma di

fungo formato da due componenti principali: una testa sferica F1 e una sezione basale, detta F0,

inclusa nella membrana interna. Le due porzioni sono connesse tra loro da uno stelo centrale e da

uno stelo periferico. Le teste F1 dell’ATP sintetasi batterica e mitocondriale hanno una struttura

altamente conservata, formata da molte subunità: α, β, δ, γ,ε. Le subunità α e β sono disposte

alternate dentro la testa F1, organizzate in una struttura circolare. Ogni F1 contiene tre siti catalitici

per la sintesi di ATP, uno su ogni subunità β; inoltre la subunità γ si estende dall’estremità della testa

F1 attraverso l’asse centrale e si congiunge con la base F0. La subunità ε supporta l’attacco della

subunità γ alla base F0. La porzione F0 dell’ATP sintetasi risiede nella membrana e consiste di tre

polipeptidi differenti. Inoltre questa base contiene un canale attraverso il quale i protoni sono condotti

dallo spazio intermembrana alla matrice.

Meccanismo di formazione dell’ATP: teoria del cambio di legame:

Come può un gradiente protonico fornire l’energia richiesta per sintetizzare l’ATP? Per chiarire tale

situazione si ricorse al meccanismo del cambio di legame.

Nel complesso tale ipotesi consta di diverse componenti:

1. L’energia rilasciata dal movimento dei protoni non

viene usata direttamente per la fosforilazione

dell’ADP ma principalmente per cambiare l’affinità di

legame nel sito attivo per l’ATP.

2. Ogni sito attivo progredisce successivamente

attraverso tre distinte conformazioni che hanno

diverse affinità per il substrato e per il prodotto.

La testa F1 contiene tre siti catalitici, uno per ognuna delle

subunità β. I diversi siti mostravano alle osservazioni diverse

proprietà chimiche: si pensò che questi fossero presenti in

diverse configurazioni, che li portava ad avere diversa affinità

per i nucleotidi.

Ad ogni dato momento,

• un sito si trova nella conformazione L (loose = lassa), in cui ADP e Pi sono legati in maniera

lassa; 27

• un secondo sito si trova nella conformazione T (tight = stretta), nella quale i nucleotidi (ADP

+ Pi o ATP prodotto) sono legati strettamente;

• un terzo sito attivo di trova nella conformazione O (open = aperta), che data la sua scarsa

affinità per i nucleotidi, permette il rilascio dell’ATP.

Si propose che ognuno dei tre siti catalitici passasse in sequenza attraverso le conformazioni L, T

ed O.

L’ATP è sintetizzato per catalisi rotazionale, in cui una parte dell’ATP sintetasi ruota rispetto all’altra.

Per spiegare i cambiamenti sequenziali della conformazione in ognuno dei siti catalitici, Boyer

propose che le subunità α e β che formano un anello esagonale di subunità all’interno della testa

F1, ruotassero rispetto all’asse centrale. In questo modello, detto catalisi rotazionale, il movimento

di rotazione è impresso dal passaggio dei protoni attraverso la membrana per il canale che si trova

nella base F0. Quindi, secondo questo modello, l’energia elettrica accumulata nel gradiente

protonico viene trasformata in energia meccanica dallo stelo rotante, e viene poi trasformata

nell’energia chimica accumulata dall’ATP.

È stato osservato che il cambio di legame e la catalisi rotatoria sono indotte a partire dalla subunità

γ. La subunità γ dell’enzima è perfettamente posizionata all’interno dell’ATP sintetasi in modo da

trasmettere i cambiamenti conformazionali dal settore F0 sulla membrana ai siti catalitici nell’F1.

Questa subunità si estende come un perno dal settore F0 fino ad una cavità centrale all’interno della

sfera F1. L’estremità apicale della subunità γ è altamente asimmetrica e, ad ogni dato istante, le sue

diverse pari interagiscono con le diverse subunità β, inducendole ad assumere le diverse

conformazioni L, T ed O. quando la subunità γ ruota, ogni sito di legame su questa subunità

interagisce successivamente con le tre subunità β di F1. Durante un singolo ciclo catalitico, la

subunità γ ruota completamente di 360°, facendo passare in sequenza ogni sito catalitico attraverso

le sue tre conformazioni.

Ciclo del cambio di legame: All’inizio del ciclo, il sito è nello stato aperto (O) e i substrati (ADP e

Pi) stanno entrando nel sito. Nella tappa 1, il movimento dei protoni attraverso la membrana induce

il passaggio alla conformazione lassa (L), in cui i substrati sono lassamente legati. Nella tappa 2, il

movimento di ulteriori protoni induce il passaggio alla conformazione stretta (T), in cui l’affinità per i

substrati aumenta, attaccandoli strettamente al sito catalitico. Nella tappa 3 l’ADP e il Pi attaccati

saldamente condensano spontaneamente a formare una molecola di ATP saldamente legata. Nella

tappa 4, il movimento di protoni aggiuntivi induce il passaggio alla conformazione aperta (O), in cui

l’affinità per l’ATP è molto minore, il che permette al prodotto di essere rilasciato dal sito. Una volta

che l’ATP si è dissociato, il sito catalitico è disponibile per il legame con il substrato ed il ciclo si

ripete.

Ruolo della porzione F0 dell’ATP sintetasi:

I dubbi più importanti erano: quale percorso fanno i protoni muovendosi attraverso il complesso F0?

E come porta questo processo alla sintesi dell’ATP? Si è ritenuto che:

1. Le subunità c della base F0 si dispongono in un anello all’interno del doppio strato

fosfolipidico; subunità γ dello stelo;

2. L’anello c è saltato alla

3. Il movimento secondo gradiente dei protoni attraverso la membrana guida la rotazione

dell’anello della subunità c; 28

4. La rotazione dell’anello c di F0 crea la forza di torsione che produce la rotazione dell’annessa

subunità γ, che porta alla sintesi e al rilascio di ATP.

Resa energetica: La produzione teorica totale dell'intera catena di reazioni sarebbe di 38 molecole

di ATP per ciascuna molecola di glucosio ossidata. Tuttavia vanno considerati delle perdite

inevitabili. La resa effettiva del processo è quindi di 30-32 molecole di ATP per molecola di glucosio,

in condizioni ottimali. Ogni NADH che

trasferisce due elettroni

alla catena di trasporto

elettronica genera circa

3 ATP; ogni FADH che

2

trasferisce due elettroni

alla catena di trasporto

elettronica genera circa

2 ATP.

L’energia liberata dalla degradazione completa del glucosio è di 686 Kcal/mole. L’energia che

recuperiamo, dall’idrolisi dell’ATP formata, dall’ossidazione del glucosio però, è di sole 7.3 kcal/mole

29

circa: moltiplicato per il numero di molecole di ATP che si producono (circa 36), si ha un’energia di

263 kcal/mole. Questo vuol dire che ricaviamo solo il 40% dell’energia contenuta nel glucosio: il

restante 60% è perso in calore.

Il consumo di ATP è elevatissimo. L’uomo a riposo consuma circa 40 kg di ATP al giorno, per vari

scopi:

- Sintesi di macromolecole;

- Sintesi di vari metaboliti;

- Moviementi cellulari;

- Trasporto attivo;

- Generazione de potenziale di membrana;

- Calore.

Strategie metaboliche:

Molti organismi non si

nutrono direttamente di

glucosio, bensì riescono ad

assumere energia da altri

generi alimentari, che

vengono demoliti e

trasformati in molecole che

si immettono nella

sequenza metabolica

principale.

I polisaccaridi come

l’amido, sono scissi in

monosaccaridi di cui sono

costituiti e vengono

fosforilati a glucosio 6-

fosfato o a fruttosio 6-

fosfato; in questa forma

entrano nella sequenza gli

colitica, nelle rispettive

tappe.

I grassi invece sono

dapprima scomposti in

glicerolo e acidi grassi. Il

glicerolo viene in seguito demoliti in una serie di reazioni che alla fine, dà luogo a un trasferimento

di elettroni a livello del CoQ della catena di trasporto di elettroni. Gli acidi graddi vengono suddivisi

in frammenti a 2 atomi di C (gruppi acetile) e fatti passare nel ciclo di Krebs come acetil-CoA.

30

In modo analogo le proteine vengono scomposte negli amminoacidi costituenti e i gruppi amminici

vengono rimossi. Il rimanente scheletro carbonioso è trasformato in un gruppo acetile, che entra nel

ciclo di Krebs come acetil-CoA, oppure in uno dei grossi composti intermedi della glicolisi o del ciclo

di Krebs. I gruppi amminici, se non riutilizzati, vengono eliminati come prodotti di rifiuto azotati.

Queste varie sequenze con cui i cibi vengono demoliti per ottenere energia, sono dette nel loro

complesso, catabolismo.

Poiché queste molecole, quali proteine e lipidi, possono essere scomposte e inserite nella sequenza

principale del metabolismo del glucosio, è logico supporre che possa accadere il processo inverso,

vale a dire che i vari prodotti intermedi della glicolisi e del ciclo di Krebs possano servire come

materiale per la biosintesi.

Fermentazione: la glicolisi è capace di fornire alla cellula una piccola quantità netta di ATP per ogni

molecola di glucosio trasformata in piruvato; poiché e reazioni gli colitiche si verificano rapidamente,

una cellula è in grado di produrre una quantità significativa di ATP con questa via metabolica.

Uno dei prodotti dell’ossidazione della gliceraldeide-3-fosfato è NADH. La formazione dell’NADH

+

avviene a spese del NAD , che si trova in piccole quantità nelle cellule; poiché è un reagente

richiesto in questo importante passaggio, se non venisse rigenerato dal NADH, l’ossidazione della

gliceraldeide-3-fosfato si bloccherebbe insieme alle reazioni successive della glicolisi. Tuttavia

+

anaerobicamente il NADH non può essere ossidato a NAD per mezzo della catena di trasporto degli

elettroni, perché l’ossigeno è l’accettore finale di elettroni della catena.

+

Le cellule sono capaci di rigenerare NAD con la fermentazione, il trasferimento di elettroni da NADH

a piruvato, prodotto

finale della glicolisi,

oppure ad un

composto derivato dal

piruvato. Similmente

alla glicolisi, la

fermentazione ha

luogo nel citosol di

una cellula

eucariotica. Per la

maggior parte degli

organismi dipendenti

da ossigeno, la +

fermentazione è un mezzo alternativo per rigenerare NAD quando i livelli di ossigeno sono bassi,

cosicché la glicolisi può continuare e mantenere la produzione di ATP.

I prodotto della fermentazione varia fra due diversi tipi di cellula o fra diversi organismi. Quando le

cellule muscolari sono soggette a contrazioni ripetute, il livello di ossigeno è basso e non soddisfa

la domanda metabolica della cellula. In queste condizioni, le cellule del muscolo scheletrico

+

rigenerano NAD convertendo il piruvato in lattato. Quando l’ossigeno diventa nuovamente

disponibile, in quantità sufficienti, il lattato può essere convertito in piruvato per continuare

l’ossidazione. Le cellule di lievito hanno superato le sfide della vita anabolica con una soluzione

metabolica differente: esse convertono piruvato in etanolo.

Sebbene la fermentazione sia solo un complemento necessario al metabolismo in numerosi

organismi, essa è l’unica risorsa di energia metabolica in alcuni anaerobi. L’energia ottenuta

solamente dalla glicolisi è scarsa se paragonata alla ossidazione completa del glucosio in CO e

2

acqua. Quando una mole di glucosio è completamente ossidata vengono rilasciate 686 kcal. Al

contrario solo 57 kcal vengono liberate quando la stessa quantità di glucosio è convertita in etanolo

in condizioni standard, e solo 47 kcal sono liberate quando è convertita in lattato. In ogni caso, solo

31

due molecole di ATP vengono formate dall’ossidazione del glucosio per glicolisi e fermentazione;

oltre il 90% dell’energia risiede nel prodotto della fermentazione,

Interazioni tra le cellule e il loro ambiente

I carboidrati presenti nelle proteine e lipidi di membrana formano uno strato addossato alla superficie

esterna della membrana plasmatica (glicocalice) esso media le interazioni cellula-cellula e cellula-

substrato e fornisce una protezione meccanica alle cellule.

La matrice extracellulare (MEC): è una rete organizzata di materiale presente nelle immediate

vicinanza della membrana plasmatica, gioca spesso un ruolo regolatorio nel determinare forma e

attività della cellula.

La membrana basale è uno strato continuo spesso circa 50-200 nm che:

● Circonda le fibre nervose e le cellule muscolari e adipose

● È presente al di sotto della superficie basale dei tessuti epiteliali

● Si trova al di sotto del rivestimento endoteliale interno dei vasi sanguigni

● Contiene due molecole che formano una rete: il collagene IV e la laminina

Fornisce un supporto meccanico per l'adesione cellulare e genera segnali per la sopravvivenza

cellulare, funge da barriera al passaggio di macromolecole e separa i tessuti di un organo.

La maggior parte delle proteine della MEC sono fibrose e si assemblano in una rete interconnessa

che ha la funzione di impalcatura.

Collagene: una famiglia di glicoproteine (circa 27) fibrose presenti solo nella MEC, (sono dei trimeri

formati da tre catene polipeptidiche (catene alfa) che sono avvolte l'una sull'altra a formare una tripla

elica) hanno una elevata resistenza alla trazione e costituisce il 25% delle proteine del corpo. È

prodotto dai fibroblasti, cellule muscolari lisce e epiteliali. All'interno della stessa fibra possono

essere presenti vari tipi di collageni (fibra eterotipica) e ogni collagene può essere localizzato in un

posto particolare. All’interno della stessa fibra sono presenti diversi tipi di collagene (fibre

eterotipiche), ciò conferisce proprietà strutturali e meccaniche a differenti miscele di fibre.

catene polipeptidiche (catene α) e per almeno una parte sono avvolte

Sono dei trimeri formati da tre

a formare una tripla elica. Esse contengono una grande quantità di prolina e molti dei R sono

idrossilati dopo la sintesi del polipeptide in modo da assicurare stabilità alla tripla elica mediante la

formazione di legami H tra le catene che la compongono. (La mancata idrossilazione si evidenzia

nello scorbuto). 32

Alcuni collageni tra cui i tipi I, II e III sono chiamati collageni fibrillari perchè si assemblano in fibrille

rigide a forma di cavo che si assemblano a loro volta in fibre più spesse visibili al M.O. (Le fibrille

sono rinforzate ulteriormente da legami covalenti crociati tra R di lisina di molecole di collagene

adiacenti, questa formazione deve durare per tutta la vita, e contribuisce alla perdita di elasticità

della pelle con l’età).

Ciascuna catena di collagene I ha una lunghezza di 295 nm, in una fibrilla si allineano in file sfalsate,

ciò forma delle bande lungo la fibrilla che si ripetono ogni 67 nm. Le componenti della fibrilla sono

avvolte a spirale intorno ad un asse come in una corda.

Fra i vari componenti della MEC le molecole di collagene costituiscono l’intelaiatura insolubile che

determina le proprietà meccaniche della matrice. (Es: i tendini contengono fibre collagene allineate

parallelamente alla direzione delle forze di trazione; la struttura stratificata dello stroma della cornea

è simile a quella del legno compensato, le fibrille sono parallele alle altre dello stesso strato, ma

perpendicolari alle fibrille degli strati adiacenti).

Il tessuto cicatriziale è costituito in gran parte da fibre di collagene, mutazioni del gene codificante il

collagene I produce l’osteogenesi imperfecta, quella che codifica per il II porta ad una alterazione

del tessuto cartilagineo (nanismo e deformità dello scheletro).

Non tutti i collageni formano fibrille, il tipo IV la cui distribuzione è limitata solo alle membrane basali,

nelle quali sono organizzate a formare una rete che fornisce un supporto meccanico e funziona

come un traliccio per le deposizioni di altri materiali extra cellulari. Il trimero di collagene IV contiene

diverse interruzioni della struttura elicoidale (che forniscono flessibilità) e domini globulari a ciascuna

estremità, che permettono alla molecola di interagire con le altre.

Proteoglicani: è un complesso proteico polisaccaridico che consiste di un nucleo proteico al quale

sono attaccati GAG (glicosamminoglicani), ciascuna catena di GAG è composta da un disaccaride

ripetuto, sono altamente acidi per la presenza di gruppi solfato e carbossilici, ciò permette loro

(grazie alle cariche negative) di attirare cationi che a loro volta legano H O. I proteoglicani risultanti

2

formano un gel resistente alla compressione.

I proteoglicani possono essere assemblati in complessi giganti mediante il legame dei nuclei proteici

con una molecola di acido ialuronico (un GAG non solforato).

Le molecole di collagene vicine agiscono da impalcatura per i proteoglicani.

Fibronectina: sono proteine che agiscono l’una con l’altra in modo altamente

specifico, consiste in una serie lineare di domini distinti che dà ad ogni

polipeptide una architettura modulare, ciascun polipeptide di fibronectina è

formato da una sequenza di 30 domini Fn, ripiegati in modo indipendente.

Questi domini strutturali si combinano a formare unità funzionali più grandi (5-

6). Una molecola di fibronectina è formata da due catene polipeptidiche che

contengono: siti di legame per altri componenti della MEC, siti di legame per i recettori della

superficie cellulare che tengono la MEC collegata alla cellula. (adesione cellulare).

Le cellule che migrano durante lo sviluppo transitano su percorsi ricchi di fibronectina, una assenza

di questo tappeto proteico porterebbe ad una inibizione del movimento cellulare.

Laminina: sono glicoproteine extracellulari che consistono di tre

differenti catene polipeptidiche legate da ponti disolfuro a formare una

croce con tre bracci corti e un braccio lungo. Giocano un ruolo

fondamentale nella migrazione delle cellule germinali primordiali.

Possono legare altre molecole di laminina e altri componenti della

membrana basale. (Es: legano il collagene IV a formare reti

interconnesse che conferiscono forza e flessibilità).

Proprietà dinamiche: la MEC esibisce proprietà dinamiche nello spazio e nel tempo:

● Nello spazio: le fibrille possono stirarsi molte volte rispetto alla loro lunghezza se tirate

dalle cellule e contrarsi se la tensione è allentata.

33

● Nel tempo i componenti sono soggetti a degradazione e ricostruzione.

(Rimodellamento)

La degradazione dei materiali della MEC è compiuta da enzimi contenenti zinco (metalloproteinasi

della matrice) MMC che sono secreti nello spazio extracellulare, e permettono il rimodellamento, la

guarigione della ferite e la formazione di vasi sanguigni.

Interazioni delle cellule con substrati extracellulari: il gruppo più importante di recettori che

legano le cellule al microambiente extracellulare e ne permettono l’interazione è formato dalle

Integrine: sono una famiglia di proteine di membrana (presenti solo negli animali). Dal lato

dell’ambiente cellulare legano una gran varietà di ligandi, mentre nel lato citosolico interagiscono

con differenti proteine della cellula. (una catena α e 8 differenti subunità

Sono composte da due catene polipeptidiche di transmembrana

β). Sono state classificate 12 integrine differenti, e ciascuna ha una distribuzione precisa all’interno

del corpo. La maggior parte delle cellule presenta differenti integrine. Le due subunità formano una

testa globulare extracellulare, connessa alla membrana da un paio di steli rigidi che si estendono

attraverso di essa come una singola elica di transmembrana, e terminano con un piccolo dominio

citoplasmatico costituito da circa 20-70 aa.

Molte integrine possono essere presenti sulla superficie cellulare in una conformazione inattiva, che

può essere attivata da eventi che modificano la conformazione dei domini citoplasmatici,

incrementando la sua affinità per un ligando. Questo tipo di modificazione nell’affinità delle integrine

è conosciuto come segnalazione “interno-esterno”.

La conformazione ripiegata di una integrina corrisponde a quella incapace di legare il ligando, mentre

quella distesa appare essere in grado di farlo. I domini citoplasmatici delle integrine legano una vasta

gamma di proteine, tra cui la talina che provoca la distensione dell’eterodimero attivandolo.

Un aumento dell’affinità di singole integrine è seguito dall’agglomerarsi delle integrine attivate,

ciò esalta l’intensità dell’interazione con i ligandi extracellulari.

34

Le integrine sono coinvolte nella adesione delle

cellule al loro substrato, o ad altre cellule, e nella

trasmissione di segnali. Il legame con un ligando

può modificare infatti il dominio citoplasmatico

che a sua volta può attivare protein-chinasi (FAK

e Src) che possono fosforilare altre proteine.

Le cellule tumorali sono in grado di crescere in

sospensione in un terreno in coltura liquido,

mentre le cellule normali muoiono in quanto le

loro integrine non sono in grado di interagire con

i substrati extracellulari, e non possono

trasmettere segnali per la sopravvivenza della

cellula.

La maggior parte delle proteine extracellulari

sono in grado di legare integrine in quanto

posseggono la sequenza tripeptidica arginina-

glicina-acido aspartico (RGD): l’aggregazione

piastrinica richiede l’interazione di integrine

piastriniche con il fibrinogeno che contiene domini

RGD, per evitare la formazione di trombi si

possono usare molecole che mimano questi

domini e che legandosi alle piastrine ne

impediscono l’azione coagulante.

I domini citoplasmatici contengono siti di legame per una vasta gamma di adattatori in grado di legare

le integrine ai filamenti di actina del citoscheletro. (Connessione tra la MEC e il citoscheletro).

Adesioni focali ed emidesmosomi (l’ancoraggio delle cellule al loro substrato): da

osservazioni in vitro si può vedere che (durante l’attacco di una cellula alla superficie di una piastra

di coltura) inizialmente la cellula ha una morfologia rotondeggiante (come quando è sospesa in un

mezzo acquoso), preso contatto con il substrato emette prolungamenti che formano adesioni sempre

più stabili, fino a che la cellula si estende sul substrato appiattendosi.

La cellula si ancora in siti sparsi e ben definiti (adesioni focali) che sono strutture dinamiche in

grado di disassemblarsi rapidamente, le adesioni possono funzionare come un sensore che

raccoglie informazioni rispetto alle caratteristiche fisiche dell’ambiente extracellulare, e possono

portare a cambiamenti dell’adesione cellulare. (Sono implicate nella locomozione cellulare, dove

sviluppano interazioni con il materiale extracellulare) Sono capaci di rispondere a sollecitazioni

meccaniche (in quanto contengono actina e miosina): forze meccaniche applicate alla cellula

vengono trasformate in segnali citoplasmatici, inducendo cambiamenti fino al nucleo (espressione

genica) e alterando il comportamento cellulare.

Le adesioni focali sono osservabili in vitro, e raramente in vivo. Le integrine sono localizzate nei siti

corrispondenti alle adesioni focali. Il legame con ligandi extracellulari modifica la conformazione

citoplasmatica dell’integrina favorendo il collegamento delle integrine con l’actina del citoscheletro.

I domini citoplasmatici delle integrine sono associati anche a protein-chinasi come le FAK e Src, in

grado di trasmettere segnali attraverso la cellula.

All’interno del corpo le cellule si attaccano alla membrana basale mediante gli emidesmosomi: siti

differenziati alla superficie basale delle cellule epiteliali, dove le cellule sono attaccate alla membrana

basale sottostante. Essi contengono una placca densa sulla superficie interna della membrana

plasmatica, e filamenti spessi e formati da cheratina, che si estendono verso l’esterno del

citoplasma. I filamenti sono classificati come intermedi e hanno funzioni di sostegno, si legano alla

MEC mediante integrine di transmembrana. 35

Interazioni delle cellule con altre cellule: le cellule sono in grado di interagire con le altre legandosi

ad alcune e ignorando le altre, grazie a molecole presenti sulla superficie dei tipi cellulari. Quattro

famiglie di proteine integrali di membrana hanno un ruolo nella mediazione dell’adesione: selectine,

alcuni membri della famiglia delle immunoglobuline e delle integrine, le caderine.

Selectine: i linfociti possono aderire al rivestimento endoteliale selettivamente grazie a una

glicoproteina (LEU-CAM1) che fa parte della famiglia delle selectine: una famiglia di glicoproteine di

membrana che riconoscono e legano una particolare disposizione di zuccheri negli oligosaccaridi

che sporgono dalla superficie di altre cellule. Esse sono composte da un piccolo dominio

citoplasmatico, uno di transmembrana ed un esteso segmento extracellulare che consiste di più

domini separati, compreso uno che funge da lectina (un composto che si lega a gruppi di carboidrati

specifici).

Si conoscono tre tipi di selectina:

1. E-selectina: espressa nelle cellule endoteliali

2. P-selectina: espressa nelle piastrine e nelle cellule endoteliali

3. L-selectina: espressa nei leucociti

Il legame delle selectine ai loro ligandi è calcio dipendente.

Immunoglobuline: gli anticorpi (Ig) sono catene polipeptidiche

composte da domini simili, (ognuno dei quali è composto da 70-

110 aa) organizzati in una struttura altamente ripiegata. Il

genoma umano codifica 765 domini Ig, queste proteine sono

membri della superfamiglia delle immunoglobuline o IgSF. La

maggior parte di esse è coinvolta nella funzione immunitaria,

mentre altre mediano l’adesione cellula-cellula indipendente da

ioni calcio. Le IgSF hanno struttura modulare e sono costituite da

singoli domini con struttura simile a quelli presenti in altre

proteine.

Caderine: sono una grande famiglia di glicoproteine che mediano l’adesione cellulare calcio-

dipendente e trasmettono segnali dalla MEC al citoplasma. Esse uniscono cellule dello stesso tipo

legandosi tra loro preferendo una interazione con lo stesso tipo di caderina. Hanno struttura

modulare, e i membri meglio caratterizzati sono:

● E-caderina: epiteliale

● N-caderina: neurale

● P-caderina: placentare

Esse contengono un segmento extracellulare relativamente grande, formato da 5 domini ripetuti di

struttura e dimensione simile, un singolo segmento di transmembrana e un piccolo dominio

citoplasmatico associato a membri della famiglia di proteine citosoliche (catenine) che hanno un

doppio ruolo: collegano le caderine al citoscheletro, e trasmettono informazioni al citoplasma e al

nucleo.

Le caderine presenti sulla suerficie della stessa cellula si associano lateralmente a formare dimeri

paralleli, gli ioni calcio formano dei ponti tra i domini successivi di una singola molecola e

mantengono la porzione extracellulare di ogni caderina in una conformazione rigida (necessaria per

l’adesione cellulare).

L’adesione tra cellule avviene mediante l’interazione di questi domini, tanto più è grande il numero

di caderine (che formano una cerniera interagendo) tanto più è forte l’adesione tra le cellule.

Le caderine rappresentano il fattore più importante nell’unione delle cellule in tessuti, durante lo

sviluppo embrionale mediano molti dei cambiamenti dinamici nei contatti adesivi richiesti per

costruire i tessuti (morfogenesi). 36

Durante lo sviluppo embrionale un gruppo di cellule, da epitelio si converte in mesenchima o

viceversa (transizione epitelio-mesenchima) (EMT), queste cellule si separano da uno strato

coesivo epiteliale (epiblasto) e si muovono come cellule mesenchimali verso regioni interne. Le

cellule dell’epiblasto contengono le E-caderine, mentre quelle che se ne distaccano smettono di

esprimerla.

Giunzioni aderenti e desmosomi: (ancoraggio di cellule con altre cellule) le giunzioni adesive sono

calcio-dipendenti, e si dividono in: giunzioni aderenti e desmosomi. Le cellule epiteliali spesso

contengono anche altri tipi di giunzioni (giunzioni strette e comunicanti), e l’insieme delle giunzioni è

denominato: complesso giunzionale (le giunzioni strette e quelle aderenti circondano la cellula,

mentre i desmosomi e le giunzioni comunicanti sono ristretti a particolari siti tra le cellule adiacenti).

Giunzioni aderenti: sono comuni negli epiteli, nel rivestimento dell’intestino appaiono come cinture

che circondano ciascuna cellula legandola a quelle vicine. In una giunzione aderente le cellule sono

tenute insieme da legami calcio-dipendenti che si stabiliscono tra i domini extracellulari delle

molecole di caderina che fanno da ponte attraverso lo spazio di 30 nm tra le cellule adiacenti. Il

dominio citoplasmatico è legato da α e β-catenine a specifiche proteine citoplasmatiche, tra cui i

filamenti di actina del citoscheletro.

I gruppi di caderine delle giunzioni aderenti permettono la trasmissione del segnale e connettono

l’ambiente esterno al citoplasma della cellula. 1 μm, contengono caderine che

I desmosomi: sono giunzioni a forma di disco con un diametro di

legano le cellule, esse sono caratterizzate da domini differenti a quelli classici, e sono definite

desmogleine e desmocolline. Dense placche citoplasmatiche (sulla superficie interna del bilayer)

servono da siti di ancoraggio per i filamenti intermedi, che sono legati ai domini citoplasmatici dei

desmosomi. La rete di filamenti fornisce integrità e continuità strutturale allo strato di cellule.

Desmosomi

Giunzioni Aderenti 37

Giunzioni strette: o tight junctions non

permettono il passaggio di soluti nello spazio tra

due cellule, sono presenti all’estremità apicale del

complesso giunzionale, che si forma tra le cellule

adiacenti. Le membrane non sono fuse insieme

ma prendono contatto in punti intermittenti, che

rappresentano i siti dove le proteine integrali delle

due membrane si incontrano nello spazio

extracellulare, che formano fibrille continue che

circondano completamente la cellula come una

guarnizione e funzionano come una barriera e

permettono di mantenere la polarizzazione delle

cellule epiteliali (impedendo la diffusione delle

proteine integrali di membrana tra i domini apicali

e quelli laterali e basali). Sono anche coinvolte

nella comunicazione cellulare.

Alcune TJ sono permeabili a specifici soluti, altre

sono impermeabili. Sono formate da claudine e

occludine, di claudine ve ne sono almeno 24

differenti. Le TJ rendono la pelle impermeabile

(connettendo le cellule epiteliali in uno strato

dell’epidermide). Sono anche presenti nelle pareti

dei capillari, e concorrono a formare la barriera emato-encefalica.

Giunzioni comunicanti (mediatori della

comunicazione intercellulare): (o gap

junctions) sono siti specializzati per la

comunicazione intercellulare presenti nelle

cellule animali. Le membrane delle cellule

adiacenti si avvicinano tra loro (fino a 3 nm)

ma non prendono contatto (lo spazio tra

esse è riempito da piccoli filamenti che sono

le condutture molecolari che attraversano la

membrana e collegano i due citoplasmi.

Sono composte da una proteina integrale:

connessina che forma un complesso

(connessone) di 6 subunità organizzate

intorno ad una apertura centrale (annulus)

di 1.5 nm di diametro. I connessoni delle cellule adiacenti si legano mediante interazioni tra i domini

extracellulari, a formare canali intercellulari tra le due cellule, che sono raggruppati in corrispondenza

di regioni specifiche della membrana a formare delle placche di giunzioni gap.

Permettono la diffusione di molecole con un peso fino a 1000 dalton e sono relativamente non

selettivi, possono essere chiusi o aperti, grazie a cambiamenti di voltaggio o alla fosforilazione di

2+

subunità di connessina, o dalla concentrazione di Ca . La contrazione sincrona delle cellule del

muscolo cardiaco è permessa da gap junctions che permettono la diffusione dell’impulso elettrico

generato dal nodo seno-atriale. Inoltre esse possono essere attraversate da molecole regolatrici

(come il cAMP) che permetterebbero di integrare le attività di una singola cellula all’interno di un

tessuto. 38

Negli ultimi anni è stato scoperto un sistema di comunicazione (nelle cellule in vitro) che consiste di

sottili tubuli di 100 nm di diametro che permettono il passaggio di proteine e vescicole

citoplasmatiche tra le cellule (Nanotubi con effetto tunnel).

I sistemi delle membrane citoplasmatiche: struttura, funzione e traffico di membrana

Il citoplasma degli eucarioti è suddiviso in vari organelli distinti (a costituire cisterne) delimitati da

membrane. Gli organelli permettono una compartimentazione di attività (metabolismi) biochimiche e

incrementano la superficie di membrana.

Gli organelli sono visibili tramite microscopia elettronica. Se invece utilizza un microscopio ottico si

sfruttano le proteine specifiche che caratterizzano l’organello tramite marker proteici con la tecnica

dell’immunofluorescenza. Ogni organulo ha un corredo di proteine, lipidi e molecole che gli

conferiscono una funzione specifica. Molte delle molecole funzionali al suo funzionamento non sono

però sintetizzate dal compartimento stesso ma vi sono trasportate (lo stesso avveniva nei

mitocondri). Per questo motivo c’è interdipendenza tra questo sistema e la cellula.

Tutte le informazioni necessarie al riconoscimento, smistamento e funzione della proteina sono

racchiusi nella sua struttura primaria. Lo smistamento avviene tramite 3 meccanismi:

1. Importazione attraverso dei pori

2. Importazione attraverso il doppio strato fosfolipidico

3. Trasporto vescicolare

Il RE, il complesso del Golgi (GC), gli endosomi e i lisosomi che costituiscono insieme il sistema

delle endomembrane. I materiali vengono trasportati in piccole vescicole di trasporto rivestite da

membrana che si formano per gemmazione (le proteine della membrana donatrice sono incorporate

nella membrana della vescicola, e le proteine solubili sono legate a specifici recettori) e si muovono

nel citoplasma, per poi fondersi con il compartimento accettore che riceve sia il carico solubile che

la vescicola di imballaggio.

• Nella via biosintetica o via secretoria (in quanto la maggior parte delle sostanze è destinata

ad essere secreta al di fuori della cellula) le proteine sono sintetizzate nel RE e modificate

nel GC. L’attività secretoria si divide in:

secrezione costitutiva: i materiali sono trasportati in vescicole secretorie e scaricati

o nello spazio extracellulare continuativamente

secrezione regolata: i materiali sono accumulati in comparti delimitati da membrana

o e scaricati solo in seguito ad uno stimolo (come i granuli di secrezione)

• La via endocita funziona in direzione opposta: i materiali si muovono dall’esterno della

cellula ai vari compartimenti.

I segnali di smistamento (codificati nella sequenza di aa della proteina o negli oligosaccaridi

legati ad essa) sono riconosciuti da specifici recettori sulle membrane delle vescicole che

assicurano che la proteina sia trasportata alla giusta destinazione.

Gli organelli che non appartengono al sistema (Esempio: Mitocondri) utilizzano delle proteine che,

come degli shuttle, portano i fosfolipidi sull’organello che normalmente non riceve vescicole.

Non a caso il mitocondrio non ha il colesterolo nella membrana: non riceve vescicole che lo

trasportano né vi sono proteine in grado da fare da shuttle per il colesterolo.

RE: Il RE è diviso in due categorie: reticolo endoplasmatico rugoso (RER) e reticolo endoplasmatico

liscio (REL), entrambi compongono un sistema di membrane che racchiude un lume (cisterna o

spazio luminale) che è separato dal citosol circostante. Le loro membrane sono interconnesse, e i

due RE svolgono attività comuni come: la sintesi di lipidi e colesterolo, ma presentano anche

caratteristiche differenti:

• Il RER ha ribosomi legati alla superficie citosolica, appare come un organello composto da

estese membrane e sacche appiattite (cisterne), è in continuazione con la membrana esterna

dell’involucro nucleare. Sintetizza un gran numero di proteine e di carboidrati e fosfolipidi che

39

viaggiano attraverso i compartimenti membranosi della cellula. Nelle cellule epiteliali

ghiandolari sono posizionati nella cellula nella parte basale rivolta verso il circolo sanguigno,

in modo da produrre una polarità distinta da una parte all’altra; il GC è disposto al centro e il

citoplasma della estremità apicale contiene granuli di secrezione il cui contenuto può

essere rilasciato in seguito a segnali.

• Il REL ha membrane più curvate e tubulari che formano un sistema di canali interconnessi

che si diramano nel citoplasma. È sede della sintesi di ormoni steroidei nelle cellule delle

gonadi e della corteccia surrenale, della detossificazione nel fegato e in altre cellule (svolta

2+

da enzimi che trasferiscono O, ossigenasi), sequestro e rilascio di ioni calcio (Ca ) nel

citoplasma delle cellule (Es: permette la contrazione dei muscoli).

Sintesi di proteine sui ribosomi: le proteine sono sintetizzate in due luoghi nella cellula:

• sui ribosomi attaccati alla superficie citosolica del RER (proteine secrete, integrali di

membrana, solubili che risiedono nelle endomembrane).

• sui ribosomi liberi che non aderiscono al RE (proteine destinate a rimanere nel citosol,

periferiche della superficie interna delle membrane, trasportate al nucleo, proteine che

devono essere incorporate in perossisomi e mitocondri).

Il sito di sintesi di una proteina dipende dalla sequenza di aa N-terminale che è la prima parte ad

emergere dal ribosoma durante la sintesi proteica. Il polipeptide si muove nel RE attraverso un

canale acquoso co-traduzionalmente, anche se il trasporto può avvenire post-traduzionalmente.

Esempio: Le proteine di secrezione contengono una sequenza segnale che dirige il polipeptide e

il ribosoma alla membrana del RE, il polipeptide si muove nelle cisterne del RE attraverso la

membrana man mano che viene sintetizzato (co-traduzionalmente).

La sintesi di un polipeptide inizia dopo che un mRNA si lega ad un ribosoma libero, quelli che devono

essere assemblati legati alle membrane contengono una successione di 6-15 R di aa idrofobici

(sequenza segnale) che è riconosciuta da una particella di riconoscimento del segnale (SRP)

che si lega al ribosoma e alla proteina nascente arrestando la sintesi del polipeptide, l’SRP indirizza

il complesso creatosi al RE. Il complesso si lega al RE sia mediante il recettore per l’SRP che con il

traslocone (un canale nella membrana del RE che permette al polipeptide nascente di muoversi dal

citosol al lume del RE). Una volta che il complesso è legato l’SRP è rilasciata dal recettore, il

ribosoma si attacca al traslocone e la sequenza segnale passa nel poro (portando allo spostamento

di un tappo costituito da una α-elica che lo inattivava) e è poi traslocato attraverso il poro idrofobico

nel lume del RE. Una volta che è terminata la traduzione e il polipeptide è rilasciato nel RE il ribosoma

viene rilasciato dalla membrana del RE.

Diverse tappe della sintesi e del traffico di proteine sono regolate dal legame o dall’idrolisi del GTP,

in quanto le proteine G in grado di legare il GTP presentano forme diverse a seconda che siano

legate al GTP (forma attivata) o al GDP (forma inattivata), quindi la proteina che lega il GTP innesca

un processo, mentre l’idrolisi del GTP lo spegne.

Appena un polipeptide entra nelle cisterne del RER la sequenza segnale viene rimossa (ad opera

della peptidasi del segnale), i carboidrati vengono aggiunti per mezzo dell’oligosaccariltransferasi. Il

lume del RER contiene proteine chaperon che permettono alle proteine di assumere la struttura

nativa e vari enzimi che processano le proteine.

La segregazione delle proteine neosintetizzate nel RE consente la loro modifica e che siano spedite

alla giusta destinazione.

Sintesi delle proteine integrali di membrana: sono sintetizzate nei ribosomi del RER, vengono

trasferite nel RE co-traduzionalmente, i segmenti idrofobici vengono deviati dal traslocone nel doppio

strato lipidico passando per un solco e si integrano come un segmento di transmembrana nel bilayer

lipidico, ogni segmento del polipeptide (passando nel traslocone) a seconda della proprietà di

solubilità può spostarsi nel bilayer lipidico o nel traslocone.

40

Biosintesi delle membrane nel RE: le membrane derivano solo da membrane preesistenti, esse

crescono quando le proteine neosintetizzate e i lipidi sono inseriti nelle membrane del RE già

esistenti. Quando una membrana si muove da un compartimento ad un altro le sue proteine e lipidi

sono modificati da enzimi che risiedono in quel compartimento conferendo ad ogni compartimento

una peculiare composizione. Quando una proteina è sintetizzata nel RER viene orientata nel bilayer

in base alla sequenza di aa e questo orientamento è mantenuto durante lo spostamento nelle

endomembrane.

Sintesi di lipidi di membrana: sono sintetizzati nel RE (tranne le sfingomieline e i glicolipidi, la cui

sintesi è completata nel GC, e da alcuni lipidi particolari delle membrane che sono sintetizzati da

enzimi che risiedono in quelle medesime membrane). I lipidi sono trasportati dal RE al GC e verso

la membrana plasmatica come parte del bilayer che costituisce le pareti delle vescicole di trasporto.

I cambiamenti nella composizione dei lipidi dipende da: enzimi che li modificano direttamente nella

membrana: gli organelli membranosi hanno enzimi che modificano i lipidi presenti nella membrana,

durante la gemmazione delle vescicole alcuni fosfolipidi possono essere inclusi preferenzialmente

nella membrana mentre altri possono essere esclusi, le cellule contengono proteine in grado di

trasportare fosfolipidi, questi enzimi possono facilitare il trasporto di alcuni specifici lipidi (anche non

facenti parte del flusso di membrane lungo la via biosintetica).

1. I fosfolipidi vengono assemblati sul REL e vengono trasportati allo strato interno della

m. plasmatica e spostati sullo strato interno tramite una specifica flippasi a seconda della

testa polare del fosfolipide presente in alcune membrane e non in altre.

2. I fosfolipidi si sintetizzano da glicerolo esterificato con due acidi grassi e un gruppo

fosfato che attacca una testa polare. La catena di acido grasso è anfipatica e per permettere

l’attacco nucleofilo sul glicerolo la si attiva ad acetil coenzima A.

3. Due molecole di acidi grassi complessati ad acetil CoA per opera dell’enzima

aciltrasferasi vanno ad esterificare il glicerolo trifosfato che prende il nome di acido

fosfatidico.

REL (catabolismo del glicogeno epatico): Negli epatociti si formano dei granuli di glicogeno

legami α-4

(omologo della cellulosa, glicosidico) e sulla membrana del REL c’è la glucosio-6-

fosfatasi. L’enzima che va però ad agire per primo è la glicogeno-fosforilasi che opera una fosfolisi:

l’attacco nucleofilo non avviene con l’ossidrile dell’acqua ma con l’ossigeno del fosfato. Il risultato è

glucosio-1-fosfato. La fosfoglicomutasi sposta il fosfato dalla posizione 1 alla 6 (importante per la

prima reazione della glicolisi. Il primo risultato della reazione vede il passaggio dal glucosio a una

molecola diversa ovvero il glucosio-6-fosfato che è già un prodotto utile all’epatocita. La reazione

successiva forma alla formazione del fruttosio-6-fosfato e poi fruttosio-1,6-difostato.

Tuttavia la glucosio-6-fosfatasi che è sul REL fa si che il glucosio possa uscire staccandolo quindi

dal fosfato e si crea un gradiente di concentrazione (alto nella cellula, basso nell’apparato

circolatorio) tale che il trasportatore GLUT2 (al contrario del GLUT1) può trasportarlo fuori dalla

cellula.

Glicosilazione nel RER: le proteine prodotte sui ribosomi legati alla membrana diventano

glicoproteine, i gruppi carboidratici hanno un ruolo chiave nella loro funzione (Es: come siti di legame

nella interazione con macromolecole e nel ripiegamento delle macromolecole). L’aggiunta di

oligosaccaridi è catalizzata da enzimi legati a membrane (glicosiltrasferasi), l’organizzazione degli

zuccheri nelle catene oligosaccaridiche di una glicoproteina dipende dalla localizzazione spaziale di

particolari enzimi lungo la “catena di montaggio”. Il segmento basale di ogni catena di carboidrati è

montato indipendentemente su un trasportatore lipidico (dolicol fosfato) e poi trasferito in blocco a

R di asparagina sul polipeptide che è trasferito al lume del RE. Gli zuccheri sono aggiunti al

trasportatore lipidico: inizia con una N-acetilglucosamina 1-fosfato, seguito dal N-acetilglucosamina

e 9 unità di mannosio e 3 di glucosio. 41

In seguito la catena oligosaccaridica subisce modificazioni che iniziano nel RE attraverso la

rimozione enzimatica di due dei tre residui terminali di glucosio da parte delle glicosidasi

(meccanismo di controllo della qualità) per iniziare questo processo le glicoproteine si legano ad uno

chaperon e successivamente il glucosio è rimosso portando alla liberazione della proteina. Se la

proteina non è piegata correttamente un enzima di monitoraggio (GT) aggiunge nuovamente un

singolo R di glucosio all’oligosaccaride che induce gli chaperon a ripiegare nuovamente la proteina.

Il processo può continuare e ripetersi fino a che la proteina non assume la forma nativa o viene

degradata (è degradata se un enzima taglia un R di mannosio da una estremità dell’oligosaccaride

di una proteina che è stata nel RE per un lungo periodo, se i R di mannosio sono stati rimossi la

proteina non può essere riciclata).

Meccanismi che assicurano l’eliminazione delle proteine non ripiegate correttamente: le

proteine non correttamente ripiegate sono trasportate nel citoplasma mediante un processo di

“traslocazione inversa”, le catene oligosaccaridiche sono poi rimosse e le proteine sono distrutte nei

proteasomi. Se le proteine ripiegate scorrettamente si accumulano nel RE la cellula scatena una

risposta alle proteine non ripiegate (UPR) che porta alla espressione di geni che alleviano le

condizioni all’interno del RE, alla fosforilazione di una proteina richiesta per la sintesi proteica che

porta a ridurre il flusso delle proteine neosintetizzate, alla espressione di geni che codificano per

chaperoni e proteine coinvolte nel trasporto di proteine al di fuori del RE. UPR attiva anche la via per

l’apoptosi in casi gravi.

Dal RE al GC: la prima tappa del trasporto vescicolare è la gemmazione dal RE, le vescicole

formatesi si fondono tra loro a formarne di più grandi, e formano tubuli interconnessi nella regione

tra il RE e il GC (ERGIC), i tubuli e le vescicole (VTC) si allontano dal RE per dirigersi al GC lungo i

binari composti dai microtubuli.

Il complesso del Golgi (GC): ha una morfologia caratteristica che consiste di cisterne membranose

appiattite a forma di disco con bordi dilatati, associate a vescicole e tubuli. Le cisterne (diametro:

μm) sono disposte in pile ordinate (il cui numero può variare enormemente), le pile di cisterne

0,5-1

del Golgi sono interconnesse, nei mammiferi, da tubuli membranosi per formare un grande

complesso unico simile ad un nastro adiacente al nucleo. Le vescicole gemmano da un dominio

tubulare periferico di ogni cisterna.

Il GC è diviso in diversi compartimenti distinti per funzionalità, disposti secondo un asse che va dalla

faccia cis (o di entrata, più vicina al RE: si compone di una rete di tubuli interconnessi detta rete

cis del Golgi (CGN) che distingue fra le proteine da rispedire al RE e quelle che possono continuare

il percorso) alla faccia trans (o di uscita, dalla parte opposta: contiene una rete di tubuli e vescicole

denominata rete trans del Golgi (TGN) centro di smistamento per le proteine). Le cisterne si

dividono in: cis, mediali e trans; le differenze che si riscontrano nella composizione dei compartimenti

è dovuta al fatto che il GC è un impianto di lavorazione: le proteine entrano dalla faccia cis per poi

viaggiare attraverso alla pila, dove vengono modificate, fino alla faccia trans.

L’impalcatura del GC può essere legata fisicamente a proteine motrici che dirigono il movimento di

vescicole e tubuli che entrano ed escono dal complesso.

La glicosilazione nel GC: il GC assembla i carboidrati delle glicoproteine e dei glicolipidi: quando

le le proteine attraversano le cisterne cis e mediali anche i R di mannosio vengono rimossi dagli

oligosaccaridi della base, ed altri zuccheri vengono aggiunti in sequenza dalle glicosiltrasferasi. La

sequenza in cui gli zuccheri sono incorporati dipende dalla disposizione spaziale delle

glicosiltrasferasi. Gli oligosaccaridi legati all’O sono assemblati interamente nel GC, a differenza di

quelli legati all’N.

Movimento di materiale attraverso il GC: nel modello del trasporto vescicolare il carico di

proteine viene trasportato attraverso la pila del Golgi dal CGN al TGN in vescicole che gemmano da

un compartimento e si fondono col successivo (le cisterne restano degli elementi stabili). Ogni

cisterna di una pila del Golgi contiene enzimi differenti, e a dimostrazione del modello le vescicole

42

di trasporto in preparazioni acellulari sono in grado di gemmare da una cisterna del GC e fondersi

con un’altra in posizione più trans della pila.

In un secondo modello (modello della maturazione delle cisterne) le cisterne progrediscono da

una posizione cis ad una trans e si disperdono nel TGN e le vescicole muovono i carichi in direzione

retrograda. Esso prevede un GC altamente dinamico, in cui le cisterne sono continuamente formate

nella faccia cis e dispersi nella trans, e l’esistenza del GC dipende dall’afflusso di trasportatori dal

RE all’ERGIC, nelle cellule ciò accade se la formazione di trasportatori è inibita (a dimostrazione del

modello). Alcuni materiali vengono prodotti nel RE e viaggiano nel GC dove rimangono. Alcune

vescicole si muovono in senso retrogrado. Inoltre studi sul lievito hanno dimostrato che la

composizione di una cisterna cis può variare in una trans.

Articolo sul movimento di materiale attraverso il GC: Secondo il modello di trasporto vescicolare:

le cisterne cis, mediane e trans sono strutture stabili e le molecole trasportate si spostano da una

cisterna a quella successiva attraverso vescicole che si formano alla periferia di ogni cisterna.

Tuttavia questo modello non spiega come molecole a volta anche molto grandi, come i filamenti di

procollagene, possano passare all'interno di vescicole. Per questo è stato proposto il modello di

maturazione/progressione delle cisterne. In cui i sacculi del Golgi non sono fissi, ma rappresentano

una struttura dinamica nella quale le cisterne procedono attraverso le interfacce cis, mediana e trans,

portandosi dietro il loro carico. Nella fase finale la cisterna stessa diventa una grande vescicola

secretoria che si fonde con la membrana plasmatica. Il movimento delle cisterne o delle vescicole

nella direzione in avanti viene definito trasporto anterogrado.

Il trasporto vescicolare retrogrado mantiene la distribuzione spaziale degli enzimi e di altre proteine

funzionali all'interno dei sacculi del Golgi agendo come una contro corrente nei riguardi della

progressione delle cisterne. Quando una determinata cisterna cis si sposta in avanti verso la zona

mediana le vescicole che si formano alla periferia trasportano indietro il suo corredo di enzimi e

recettori con un trasporto retrogrado verso la cisterna cis che si sta formando.

Tipi di vescicole di trasporto: I materiali sono trasportati fra i vari compartimenti da vescicole (o

altri trasportatori delimitati da membrane) che gemmano dalle membrane donatrici e si fondono con

le accettrici. La maggior parte delle gemme è coperta sulla superficie citosolica da un rivestimento

proteico formato da proteine solubili che si accumulano sul versante citosolico della membrana

donatrice nei siti dove avviene la gemmazione. L’assemblaggio inizia a seguito dell’attivazione di

una proteina G, ogni gemma si distacca a formare una vescicola rivestita. I rivestimenti proteici

hanno due funzioni:

● Fungono da dispositivo che permette alla membrana di curvarsi e porta alla

formazione della vescicola

● Costituiscono un meccanismo per la selezione di ciò che è trasportato nella vescicola

ovvero: il carico di proteine (di secrezione, lisosomali o di membrana) e il meccanismo per

indirizzare la vescicola alla membrana ricevente.

Il rivestimento proteico è costituito da uno strato esterno (citosolico) di impalcatura e uno interno

composto da proteine in grado di legare il carico della vescicola (in base alla affinità specifica per le

code citosoliche delle proteine di membrana che risiedono nella membrana donatrice), le proteine

più comuni che costituiscono il rivestimento vescicolare sono:

● Vescicole rivestite da COPII (Anterograde): spostano i materiali dal RE al ERGIC

ed al CGN: alcune proteine di membrana del RE e parte della loro coda citosolica contengono

un segnale di esportazione che interagisce con le COPII che li catturano selezionando e

concentrando per l’appunto solo determinati componenti.

Tra le COPII si annoverano: proteine di membrana, enzimi che agiscono nelle successive

fasi della via biosintetica, proteine che agganciano al compartimento bersaglio, proteine della

membrana che possono legare un carico solubile. Fra di esse la Sar1 (una proteina G) che

è reclutata a livello della membrana del RE: regola l’assemblaggio del rivestimento

43

vescicolare e inizia la formazione di esse. È legata al GDP nella fase inattiva e lo scambia

con del GTP che causa un cambiamento conformazionale che porta la sua α-elica N-

terminale a inserirsi nel bilayer che porta al ripiegamento della membrana a formare la

vescicola, anche grazie ai polipeptidi Sec23 e Sec24 che creano un dimero che fornisce una

ulteriore pressione. Una volta che l’intero rivestimento COPII è assemblato la gemma si

separa dal RE, i componenti del rivestimento proteico vengono disassemblati e liberati nel

citosol (innescata dall’idrolisi del GTP legato alla Sar1 che porta al complesso Sar1-GDP con

minore affinità per la membrana che porta al rilascio delle altre subunità di COPII) e la

vescicola può finalmente fondersi con la membrana bersaglio.

● Vescicole rivestite da COPI: mediano il trasporto di proteine in senso retrogrado:

dall’ERGIC e GC al RE, e dalle cisterne trans del GC alle cisterne cis.

● Vescicole rivestite da clatrina: spostano il materiale dal TGN verso gli endosomi e

i lisosomi, e dalla membrana plasmatica ai compartimenti citoplasmatici lungo la via endocita.

Sono composte da una gabbia esterna a nido d’ape composta dalla clatrina (ogni molecola

di clatrina è costituita da tre catene pesanti e tre leggere unite a formare una struttura a tre

gambe chiamata trischelio), e da un guscio interno composto da complessi proteici

(adattatori): il termine adattatore descrive una molecola che si lega fisicamente a due diverse

tipologie di materiale. La formazione delle vescicole comincia con il reclutamento sulla

membrana ARF1 che lega GTP, dopo che la vescicola è gemmata dal TGN perde il

rivestimento di clatrina, gli MPR si dissociano dagli enzimi lisosomali e ritornano al TGN.

Nel determinare quale proteina deve rimanere sul RE e quale deve gemmare e procedere verso il

GC agisce una combinazione di due meccanismi:

● La ritenzione delle molecole residenti sul RE per mezzo delle stesse proprietà fisiche

delle proteine

● Il recupero delle molecole “sfuggite” che vengono riportate nel comparto in cui

risiedono normalmente

Le proteine che risiedono nel RE contengono alla estremità C-terminale sequenze di aa che servono

da segnali di recupero. Il recupero è effettuato da recettori che le catturano e le restituiscono al RE

in vescicole di COPI. Ogni compartimento della membrana della via biosintetica ha il proprio segnale

unico di recupero che le permette di mantenere la propria composizione di proteine.

Smistamento delle proteine al TGN: la cellula smista (nel TGN) le proteine destinate a luoghi

differenti in differenti carrier rivestiti da membrana.

Smistamento di enzimi lisosomali: sono sintetizzate sui ribosomi legati al RE e trasportate nel

GC, vengono riconosciute da enzimi che in due tappe catalizzano l’aggiunta di un gruppo fosfato a

certi zuccheri mannosio delle catene di carboidrati legate all’azoto che funzionano come segnali di

riconoscimento, i recettori per il mannosio 6-fosfato (MPR) che sono proteine integrali di membrana

del TGN li catturano e li trasportano in vescicole rivestite da clatrina. Gli enzimi lisosomali sono

scortati dal TGN da GGA (adattatori proteici). Una molecola di GGA presenta diversi domini, in grado

di legare la clatrina e un segnale di smistamento nelle code citosoliche dei MPR. Gli MPR legano gli

enzimi all’interno del lume della vescicola. Il risultato è che i MPR del TGN e gli enzimi del lume del

TGN si concentrano in vescicole di clatrina.

Smistamento di proteine non-lisosomali: le proteine della membrana destinate alla membrana

plasmatica e gli altri materiali secretori sono trasportati da carrier prodotti quando il TGN si

frammenta in vescicole e tubuli di diverse dimensioni (modello della maturazione delle cisterne). Le

proteine (destinate alla secrezione) formano grandi granuli secretori che sono trattenuti e gemmati

dalla regione trans delle cisterne del Golgi e dal TGN; i granuli sono immagazzinati nel citoplasma

finchè i contenuti sono rilasicati in seguito ad uno stimolo. In alcune cellule lunghi tubuli lasciano il

TGN mediante proteine motrici che operano sui microtubuli, questi tubuli si suddividono poi in

vescicole. 44

Il trasporto delle proteine di membrana verso la membrana plasmatica dipende da segnali di

smistamento insiti in esse.

Indirizzamento delle vescicole verso un compartimento: la fusione selettiva è uno dei fattori che

assicura un flusso direzionale attraverso i compartimenti membranosi della cellula e avviene grazie

a delle proteine di membrana in grado di indirizzare le vescicole: i movimenti delle vescicole sono

diretti dai microtubuli, il contatto con la membrana bersaglio è mediato da proteine di ormeggio (a

forma di bacchetta, fibrose, in grado di formare un ponte tra le due membrane, e grandi complessi

multiproteici, che mantengono le membrane più vicine) che richiede una specificità fra i due

componenti conferita dalle Rab (una famiglia di proteine G), esse si legano alle membrane per

mezzo di un’ancora lipidica, Rab differenti sono associati a diversi compartimenti, ciò fa si che ogni

compartimento abbia una sua identità specifica. Quando sono attive ovvero legate a GTP reclutano

proteine di ormeggio a superfici di membrana specifiche.

L’attracco delle vescicole al compartimento bersaglio avviene in seguito all’interazione tra le

regioni citosoliche delle proteine integrali delle due membrane. Le più importanti sono le SNARE

esse sono caratterizzate da un dominio comune (motivo SNARE) di 60 aa che li permette di formare

complessi con altre SNARE. Si dividono in:

● v-SNARE: incorporate nelle membrane delle vescicole di trasporto nella gemmazione

● t-SNARE: situate nelle membrane dei compartimenti bersaglio

Le molecole interagiscono a formare dei fasci a quattro filamenti, ogni fascio è formato da due α-

eliche, che formano un fascio intrecciato che tira i due bilayer adiacenti in una associazione molto

stretta. Ciò porta le SNARE a far parte della stessa membrana.

La dissociazione del complesso è dovuta ad una proteina (NSF) che gli si attorciglia attorno al fascio

di SNARE e grazie a ATP lo spezza.

L’abilità di una vescicola di fondersi dipende dalla combinazione di proteine interagenti come Rab e

SNARE.

Esocitosi: la fusione di una vescicola o di un granulo secretorio con la membrana plasmatica e la

conseguente estrusione del contenuto è detta esocitosi. Essa è solitamente innescata dal rilascio di

2+

Ca . Il contatto tra la vescicola e la membrana forma un piccolo poro di fusione circondato da

proteine, che si dilata portando alla fuoriuscita di materiale. La superficie luminale della vescicola si

fonde con la superficie esterna della membrana plasmatica, quella citosolica con l’interna.

I Lisosomi: sono gli organelli digestivi della cellula animale, contengono circa 50 enzimi idrolitici

(idrolasi acide) (prodotti nel RER) in grado di idrolizzare ogni macromolecola biologica. Il pH

+

lisosomale è circa 4.6 ed è mantenuto grazie alla pompa protonica (H -APTasi) presente nella

membrana del lisosoma, che contiene anche proteine di membrana altamente glicosilate che la

proteggono dagli attacchi degli enzimi all’interno.

Sono responsabili della degradazione delle sostanze portate nella cellula dall’ambiente esterno

(Es: i batteri ingeriti possono essere inattivati dal pH lisosomale per poi essere digeriti

enzimaticamente), del turnover (i ricambio degli organelli) che avviene per mezzo di un processo

denominato autofagia (un organello è circondato da una doppia membrana che costituisce una

membrana detta autofagosoma), la membrana si fonde poi con un lisosoma formando un

autofagolisosoma, il risultato è la degradazione e il riciclo dei prodotti. In una cellula senza

nutrimento l’autofagia viene sfruttata per produrre energia. Ciò che resiste al processo di digestione

intracellulare sotto forma di resti non digeribili costituisce un corpo residuo, alcuni vengono eliminati

dalla cellula mentre altri vengono depositati all'interno della stessa; l’accumulo di substrati all’interno

della cellula porta ad una serie di malattie note come LSD (malattie da accumulo lisosomale).

Il percorso endocito: movimento di membrane e materiali all’interno della cellula: un segmento

delle membrana si invagina a formare vescicole citoplasmatiche che sono trasportate all’interno della

cellula mediante due processi: 45

● Endocitosi: quella generalizzata (o pinocitosi) porta all’assunzione non specifica di

fluidi extracellulari, essa porta alla rimozione anche di parte della membrana e all’entrata di

molecole grandi e piccole presenti nel liquido esterno. L’endocitosi mediata da recettori

(RME) porta all’assunzione di specifiche molecole che possono anche essere presenti a

bassa concentrazione nei fluidi extracellulari: i legandi si legano ai recettori che si trovano in

aree (fossette rivestite) e portano alla invaginazione di una fossetta che forma una vescicola

rivestita di clatrina. Esse presentano proteine accessorie come la dinamina che permette il

rilascio della vescicola formando una collana intorno al collo di una fossetta invaginata e

portando al distacco della vescicola dalla membrana plasmatica (grazie ad una moodifica

conformazionale indotta dall’idrolisi di GTP).

● Fagocitosi: si verifica in poche cellule specializzate nell’assunzione di particelle

grandi (>0.5 μm) dall’ambiente: i macrofagi e neutrofili riconoscono grazie a recettori i

materiali da legare e li fagocitano distruggendoli grazie agli enzimi lisosomali e ai radicali

liberi dell’O presenti nel lume del fagosoma (un vacuolo che si distacca dal bilayer e si fonde

con un lisosoma a generare un fagolisosoma).

Il percorso endocito:

● I recettori di mantenimento (“housekeeping”) sono responsabili dell’assunzione dei

materiali che saranno utilizzati dalla cellula, a seguito della endocitosi i recettori sono

destinati a tornare sulla superficie cellulare per proseguire in un ulteriore ciclo

● I recettori di segnale sono invece responsabili dei legami di ligandi extracellulari che

portano messaggi e cambiano l’attività della cellula, i recettori vengono degradati (grazie al

legame covalente con ubiquitina) per un processo denominato regolazione negativa, che

riduce la sensibilità della cellula a un determinato fattore

I materiali internalizzati vengono trasferiti agli endosomi (una rete di tubuli e vescicole dinamica)

che gli smistano verso i loro percorsi.

Endosomi e lisosomi sono destinati alla raccolta, degradazione e digestione di particelle e sostanze

importate nelle cellule dall’esterno.

Il citoscheletro e la motilità cellulare

Il citoscheletro ha la funzione di: struttura e supporto, trasporto intracellulare, contrattilità e motilità

e organizzazione spaziale, è formato da strutture filamentose ben definite: microtubuli (lunghi tubi

cavi non ramificati formati da tubulina), microfilamenti (strutture piene sottili e spesso organizzate in

una rete ramificata, formati da actina) e filamenti intermedi (robuste fibre a forma di corda composte

da diverse proteine correlate). Sono polimeri di subunità proteiche tenuti insieme da legami deboli

non-covalenti, ciò le rende velocemente assemblabili o disassemblabili.

Proprietà Microtubuli Filamenti intermedi Microfilamenti

Subunità incorporate Eterodimero di GTP-αβ- Circa 70 proteine Monomeri di ATP-actina

nel polimero tubulina diverse

Estremità + (β-tubulina)

Sito preferenziale di Interno Estremità + (sfrangiata)

incorporazione

Polarità Si No Si

Attività enzimatica GTPasi Nessuna ATPasi

Proteine motrici Chinesine, Dineine Nessuna Miosine

Principali gruppi di MAP Plachine Proteine leganti actina

proteine associate 46

Struttura Tubo rigido, cavo e Filamenti resistenti, Filamenti ad elica, flessibili,

inestensibile flessibili, estensibili inestensibili

Dimensioni Diametro esterno 25 nm Diametro 10-12 nm Diametro 8 nm

Distribuzione Tutti gli eucarioti Animali Tutti gli eucarioti

Funzioni primarie Supporto, trasporto Supporto strutturale Motilità, contrattilità

intracellulare,

organizzazione della

cellula

Distribuzione sub- Citoplasma Citoplasma e nucleo Citoplasma

cellulare

Il citoscheletro è una impalcatura dinamica che fornisce supporto strutturale e determina la struttura

cellulare e la posizione dei vari organelli all’interno della cellula, rappresenta una rete di binari per

dirigere i movimenti di materiali e di organelli nella cellula, e permette lo spostamento a una cellula

(tramite ciglia o flagelli), inoltre è fondamentale nella divisione cellulare: separa i cromosomi e

suddivide la cellula madre dalla figlia.

Microtubuli: strutture cave, tubulari, relativamente rigide (costituiscono il fuso mitotico e l’asse

centrale di ciglia e flagelli), hanno un diametro esterno di circa 25 nm e una parete di spessore di 4

nm e possono estendersi anche per tutto il diametro della cellula. La parete è formata da proteine

(subunità di α-tubulina e β-tubulina

gloubulari disposte in file longitudinali dette protofilamenti a una

estremità e all’altra a formare un dimero asimmetrico), allineate parallelamente all’asse longitudinale

del tubulo. I microtubuli appaiono formati da 13 protofilamenti disposti circolarmente, avendo tutti i

protofilamenti la stessa polarità il polimero è polare e presenta una estremita + (terminata da una

fila di subunità di β-tubulina) (terminata da una fila di subunità di α-tubulina).

e una estremità -

di α-tubulina è legata a GTP che non è idrolizzato e non è scambiabile, la β-tubulina

La subunità

lega GDP che viene scambiato con GTP prima dell’assemblaggio in un polimero.

I microtubuli presentano proteine associate ad essi (MAP), alcune hanno un dominio che si lega ad

un lato di un microtubulo e un altro che si estende come un filamento dalla superficie, altri connettono

i microtubuli tra di loro per mantenerne l’allineamento parallelo, altri aumentano la stabilità e ne

promuovono l’assemblaggio. La loro attività è controllata mediante addizione e rimozione di gruppi

fosfato a R di aa specifici.

Supporto strutturale: i microtubuli possono resistere a forze di compressione, e la loro distribuzione

in una cellula ne determina la forma (nelle cellule animali si estendono dal nucleo verso l’esterno

producendo la forma rotonda caratteristica). I microtubuli mantengono l’organizzazione interna

della cellula. Il trasporto interno ad una cellula si basa su una disposizione di microtubuli e filamenti

citoscheletrici: nell’assone il trasporto avviene grazie a vescicole membranose secondo un moto

anterogrado, mentre le vescicole di endocitosi che si formano ai terminali dell’assone e trasportano

sostanze provenienti dalle cellule bersaglio si muovono in senso retrogrado. Entrambi i movimenti

sono mediati dai microtubuli, grazie a proteine motrici, o mediante alla polimerizzazione e

depolimerizzazione diretta verso zone d’interesse extracellulari.

Le proteine motrici convertono ATP in energia meccanica, possono essere raggruppate in tre

famiglie: miosine (si muovono lungo i microfilamenti), chinesine e dineine (si muovono lungo i

microtubuli). Esse si muovono in moto unidirezionale, man mano che si spostano subiscono

cambiamenti conformazionali (ciclo meccanico) e attuano un ciclo chimico (che consiste nel legare

una molecola di ATP e idrolizzarla per ricavare energia per il movimento) che si ripetono lungo tutto

il percorso seguito da esse.

Legano ATP e si stabilizzano compiendo un primo movimento, questo comporta una distorsione del

sito di legame di quella che ora è ADP che viene rilasciato tornando ad uno stato energetico instabile

che riporta la proteina allo stato nativo iniziale al netto però di uno spostamento lungo la direzione

del microtubulo e nel verso specifico della proteina.

47

Chinesina: è un tetramero costituito da 2 catene pesanti

identiche (avvolte l’una sull’altra a spirale nella zona dello

stelo) e due catene leggere identiche (legate alla parte

terminale delle catene pesanti), è formata da diverse parti: 2

teste globulari (dominio motore) che si legano al microtubulo

e idrolizzano ATP per generare energia, esse sono a loro

volta connesse ad un collo, ad uno stelo bastoncellare e ad

una coda a ventaglio che si lega al carico da trasportare. È

diretta verso l’estremità +, si muove a seconda della

concentrazione di ATP fino ad una velocità massima di 1 μm

al secondo, ogni passo è lungo 8 nm (la lunghezza di un

dimero di tubulina in un protofilamento) e richiede l’idrolisi di

una molecola di ATP. Quando una delle teste si lega al

microtubulo, l’interazione induce un cambiamento

conformazionale che porta al movimento dell’altra testa in avanti, questo movimento continuato è

definito processivo, una delle due teste resta sempre legata al microtubulo.

La molecola di chinesina I è uno dei membri della famiglia delle KLP (proteine simili alla chinesina),

le porzioni motrici delle KLP hanno sequenze di aa simili, mentre le code sono differenti (ciò è dovuto

ai diversi carichi che queste proteine trasportano). Le proteine che si muovono in direzione - hanno

differenti caratteristiche nella struttura delle regioni del collo, mentre le teste sono indistinguibili. Nella

maggior parte delle cellule i microtubuli sono allineati con le estremità + in direzione opposta al

centro della cellula, quindi le KLP tendono a spostare vescicole e organelli vero la periferia della

cellula.

Dineina citoplasmatica: è la proteina responsabile del movimento di ciglia e flagelli, ne esistono

solo 2. È una proteina enorme (massa di 1.5 mln di Dalton) formata da due catene pesanti identiche

e da diverse catene intermedie leggere, ognuna delle catene pesanti è costituita da una testa

globulare con una proiezione allungata (peduncolo) che contiene il sito di legame al microtubulo, la

coda lega le catene leggere ed intermedie (con funzioni sconosciute). La dineina si muove verso

l’estremità - del polimero. Ha due ruoli:

● Genera forza nella disposizione del fuso mitotico e nel movimento dei cromosomi durante la

mitosi

● Motore microtubolare diretto verso l’estremità - che determina la posizione del centrosoma e

del GC

Nelle cellule nervose la dineina muove in senso retrogrado gli organelli membranosi e in senso

anterogadro i microtubuli. Trasporta carichi quali: endosomi, lisosomi, vescicole del RE e dirette al

GC anche grazie alla cooperazione di un complesso formato da più subunità (dinactina) che ne

regola l’attività e collabora al legame della proteina motrice col microtubulo.

Gli organelli possono legare simultaneamente dineina e chinesina, ciò li fornisce la capacità di

muoversi in direzioni opposte a seconda delle condizioni.

I centri di organizzazione dei microtubuli (MTOC): La funzione dei microtubuli dipende dal loro

posizionamento, l’assemblaggio dai dimeri di αβ-tubulina avviene in due fasi distinte: una lenta

(nucleazione) in cui si forma una piccola porzione, e una veloce (allungamento). Nella cellula anche

la nucleazione avviene velocemente perchè è associata a diverse strutture specializzate (MTOC)

ovvero centri di organizzazione dei microtubuli come il centrosoma: nelle cellule animali i

microtubuli nucleano da esso. È caratterizzato da una struttura complessa che contiene due centrioli

circondati da materiale pericentriolare (PCM) amorfo (I centrioli sono: strutture cilindriche di circa

0.2 μm di diametro e lunghi il doppio, contengono nove fibrille regolarmente spaziate formate da una

banda di tre microtubuli: A, B, C. Si trovano sempre a coppie i cui membri sono posti ad angolo retto

l’uno rispetto all’altro).

Tipicamente il centrosoma resta al centro della cellula ed è il principale sito di origine dei microtubuli,

la polarità dei microtubuli è sempre la stessa: l’estremità - è associata al centrosoma e quella + è

dalla parte opposta. L’estremità crescente di un microtubulo può contenere proteine specifiche per

l’attacco ad un bersaglio.

Molte cellule mancano dei centrosomi o i microtubuli non si associano ad essi ma a estremità –

sparse nella cellula. 48

Corpi basali ed altri MTOC: i microtubuli possono essere generati anche da microtubuli uniti in una

struttura: corpo basale (ciò avviene in ciglia e flagelli) essi hanno la stessa struttura dei centrioli, e

possono interconvertirsi con essi.

La nucleazione dei microtubuli: gli MTOC controllano: il numero di microtubuli, la loro polarità, il

numero di protofilamenti e il momento e luogo di assemblaggio. Hanno tutti in comune la γ-tubulina

che forma uno stampo a forma di anello aperto (tenuto in zona da proteine che costituiscono il

complesso γ-TuRC) αβ-tubulina.

su cui si assembla il primo giro di

Le proprietà dinamiche dei microtubuli: sono stabilizzati da MAP legate ad essi, in particolare i

microtubuli del fuso mitotico e del citoscheletro sono estremamente labili, il disassemblaggio può

essere indotto da una varietà di sostanze chimiche e da stress fisici, ma soprattutto in base alle

necessità della cellula. Il taxolo (farmaco) inibisce il disassemblaggio dei microtubuli ed è perciò

usato in chemioterapia. alla subunità di β-

L’assemblaggio di dimeri di tubulina richiede che una molecola di GTP si leghi

tubulina e dopo che il dimero è incorporato nel microtubulo il GTP è idrolizzato, e il GDP si lega al

polimero assemblato. Quando il dimero viene disassemblato finisce nel citosol dove il GDP è

sostituito da un GTP che lo riattiva rendendolo nuovamente disponibile a essere polimerizzato.

L’idrolisi di GTP rende i microtubuli instabili, e perciò in grado di disassemblarsi rapidamente in

mancanza di stabilizzatori come le MAP.

Durante l’accrescimento dimeri di tubulina sono aggiunti più velocemente di quanto il GTP sia

idrolizzato, le subunità legate a GDP sono meno adatte ad incastrarsi in un protofilamento. In

assenza delle MAP l’energia immagazzinata dall’idrolisi di GTP rende i microtubuli instabili e

destinati a collassare.

L’instabilità dinamica si riferisce al fatto che i microtubuli che crescono e si accorciano possono

coesistere nella stessa regione di una cellula e che uno stesso microtubulo può passare

imprevedibilmente da fasi di accorciamento a accrescimento. Grazie a questa proprietà i microtubuli

possono cercare nel citoplasma un sito di attacco che li stabilizzi temporaneamente.

Ciglia e Flagelli: sono sottili organelli motori che si proiettano dalla superficie delle cellule

eucariotiche, sono essenzialmente la stessa struttura, un ciglio muove la cellula in una direzione

perpendicolare a se stesso, nella fase di spinta è mantenuto rigido e spinge contro lo spazio

circostante, nel ritorno diventa flessibile, offrendo poca resistenza al mezzo.

Il movimento del flagello è simile a quello ondulatorio di un serpente, quello coordinato delle ciglia è

simile al remare sincrono degli schiavi in una nave romana.

Le ciglia sono presenti in gran numero sulla superficie di una cellula e il loro battito è coordinato.

Non tutte però sono mobili, alcune cellule contengono un singolo ciglio (ciglio primario) che ha una

funzione sensoriale.

I flagelli mostrano diversi tipi di battito (forme d’onda)

a seconda del tipo cellulare, quello dei batteri appare

come un moto rotatorio ondulatorio, anche se non

hanno nulla in comune con quelli eucariotici.

Il ciglio e il flagello partono da un corpo basale

(paragonabile al centriolo) sono coperti da una

membrana che è continua con quella plasmatica, la

parte centrale del ciglio (assonema) contiene un

insieme di microtubuli che percorre longitudinalmente

l’intero organello. E’ formato da 9 coppie periferiche di

microtubuli (collegati tra loro da ponti intercoppia) che

circondano un paio di microtubuli singoli centrali che

sono circondati da una guaina centrale, collegata ai

tubuli con una serie di raggi (disposizione 9+2).

I microtubuli dell’assonema hanno la stessa polarità, le

estremità + sono all’apice dell’estroflessione e quelle -

alla base. Le coppie periferiche sono formate da un

microtubulo completo, il tubulo A, ed uno incompleto: il tubulo B, formato da 10 o 11 subunità invece

che 13. I tubuli centrali sono circondati da una guaina centrale collegata ai tubuli A delle coppie

periferiche mediante dei raggi, le coppie sono collegate tra loro con ponti intercoppia composti da

49

nexina che limita l’estensione dello scorrimento delle coppie adiacenti e causa una flessione

dell’assonema in risposta alla forza di scorrimento.

La crescità avviene all’estremità + dei microtubuli, e il loro mantenimento in situ è garantito dal

trasporto intraflagellare (IFT). La chinesina II muove i materiali lungo i protofilamenti fino all’apice

dell’assonema, le molecole di chinesina sono trasportate indietro dalla dineina citoplasmatica.

I bracci di dineina: il movimento di ciglia e flagelli è dovuto alla dineina ciliare (o assonemale)

presente sui tubuli A assonemali, lo scorrimento reciproco delle coppie di microtubuli adiacenti

avviene infatti grazie ai bracci di dineina che lavorano come ponti trasversali oscillanti generando le

forze per il movimento.

Normalmente lo stelo è ancorato al tubulo A della coppia inferiore e i bracci si muovono sul tubulo B

di quella superiore. Inizialmente i bracci di dineina ancorati al tubulo A della coppia inferiore si legano

ai siti di legame sul tubulo B della coppia superiore, subendo un cambiamento conformazionale

(colpo di potenza) che causa lo scivolamento della coppia inferiore verso l’estremità basale della

coppia superiore. Successivamente i bracci di dineina si staccano dall tubulo B della coppia

superiore e si riattaccano alla coppia superiore in modo che il ciclo incominci nuovamente.

Lo scorrimento su un lato dell’assonema si alterna con lo scorrimento sul lato opposto, in modo che

il ciglio si pieghi prima in una direzione e poi in un’altra.

La resistenza allo scorrimento fornita dai ponti di nexina causa una flessione dell’assonema in

risposta alla forza di scorrimento.

Filamenti intermedi (IF): è un filamento pieno e non ramificato del diametro di circa 10-12 nm

presenti solo nelle cellule animali, e provvedono alla resistenza meccanica delle cellule sottoposte

a stress fisici, sono un gruppo di strutture eterogenee, le subunità polipeptidiche dei IF sono

suddivise in 5 classi, ma pur essendo chimicamente differenti sono in grado di organizzarsi in

strutture comuni, presentano un dominio centrale ad α-elica di forma bastoncellare con lunghezza e

sequenza di aa simili:

1. Cheratina acida: presente negli epiteli

2. Cheratina basica: presente negli epiteli

3. Vimentina, Desmina, GFAP, Periferina: rispettivamente presenti in cellule mesenchimali,

muscoli, astrociti e neuroni periferici

4. Proteine dei neurofilamenti: presenti nei neuroni dei nervi centrali e periferici

5. Proteine della lamina: presenti nel involucro nucleare

Gli IF sono spesso interconnessi ad altri

filamenti citoscheletrici mediante ponti

trasversali di plectina (costituita da un dominio

che si lega al IF e un altro che a seconda

dell’isoforma lega un microtubulo, un IF o un

microfilamento).

Il dominio centrale è affiancato ad entrambi i lati

da domini globulari variabili, due polipeptidi di

questo genere reagiscono spontaneamente, e

le due α-eliche si avvolgono a formare un

dimero di 45 nm orientato con una estremità C-

terminale e una N-terminale.

L’unità base degli IF è un tetramero costituito da

due dimeri che si accostano lateralmente in

modo sfalsato con le estremità N e C-terminali

antiparallele, ciò rende il tetramero non polare;

8 tetrameri si associano a formare un filamento

di 60 nm, i IF sono formati dall’associazione di

tali unità.

Gli IF sono poco sensibili ad agenti chimici e sono più difficili da solubilizzare, l’assemblaggio e il

disassemblaggio infatti è regolato da fosforilazioni e defosforilazioni delle subunità, di conseguenza

le subunità non vengono incorporate ad una estremità ma assemblate lungo tutto l’intero filamento.

Abbiamo una serie di cellule staminali che si appoggiano sulla strato del derma,che si differenziano

in cellule dell’epitelio. Per poi fare un viaggio, dalla parte basale dell’epitelio fino alla parte apicale,e

50

mano a mano che matura si va a riempire di IF, fino a morire, andando a formare una strato

impermeabile sull’epidermide, in quanto la cheratina è una proteina idrofobica.

I IF citoplasmatici fanno una rete, e di solito formano delle interconnessioni che vanno da una parte

all’altra della cellula e vanno a disporsi in strutture che prendono il nome di desmosomi e

emidesmosomi. Fanno dunque dei ponteggi tra i desmosomi (strutture che connettono tra loro le

cellule); se invece non connettono altre cellule, ho dunque una sola placca e si parla di

emidesmosomi (cioè la metà).

Microfilamenti: sono coinvolti nei processi di motilità cellulare e intercellulare, movimento di

vescicole, fagocitosi: la loro funzione principale è la motilità (mitosi, locomozione, contrazione), ma

hanno anche un ruolo in strutture stabili cellulari e nell'interazione e stabilizzazione intercellulare.

Hanno un diametro di circa 8 nm e sono composti da subunità globulari di actina che in presenza di

ATP polimerizza a formare un filamento flessibile ad elica: un doppio filamento con due solchi che

corrono lungo tutta la sua lunghezza; dato che ogni subunità ha una polarità e tutte le subunità sono

orientate in una direzione, l’intero filamento risulta avere una sua polarità. E’ presente in tutte le

cellule eucariotiche.

Assemblaggio e disassemblaggio: per essere incorporato in un filamento, un monomero di actina

lega una molecola di ATP, l’actina è una ATPasi, l’ATP legato all’actina infatti viene idrolizzato ad

ADP in seguito all’incorporazione nel filamento, quindi un filamento è formato da subunità di actina-

ADP.

La fase iniziale (nucleazione) avviene lentamente, mentre l’allungamento è molto più rapido, quando

la concentrazione di monomeri di actina è alta esse sono aggiunte ad entrambi le estremità (alla +

cioè quella sfrangiata la vi è una crescita più rapida rispetto a quella osservata sull’estremità -

appuntita); ma se la concentrazione di ATP-actina diminuisce i monomeri vengono aggiunti solo

all’estremità +, in quanto vi è maggiore affinità, e se la concentrazione di actina diminuisce

ulteriormente i monomeri si distaccano dalla estremità - per legarsi alla + finché in questa reazione

dinamica si raggiunge un equilibrio tra la lunghezza del filamento e il numero di monomeri liberi

(definito stato stazionario). Le estremità si muovono da una estremità all’altra per un processo detto

treadmilling (filatura), grazie a proteine accessorie la cellula è in grado di modificare l’equilibrio e ciò

le permette di sfruttare l’organizzazione dei microfilamenti in processi come: la locomozione

cellulare, i cambiamenti di forma e la citocinesi.

Miosina: i motori che agiscono in connessione con i microfilamenti sono le miosine, che si muovono

verso l’estremità + di un filamento, sono caratterizzate da una testa che contiene un sito che si lega

ad un filamento di actina, uno che lega e idrolizza ATP e una coda caratterizzata da domini differenti.

Le miosine si suddividono in:

● Convenzionali (tipo II): sono i principali motori della contrazione muscolare, ma si trovano

anche in altre cellule, è formata da sei catene polipeptidiche (una coppia di catene pesanti e

due coppie di catene leggere) in modo da formare una proteina asimmetrica. E’ formata da

un paio di teste globulari unite ai due colli (formati da una singola α-elica ininterrotta e da due

catene leggere associate), e una lunga coda bastoncellare formata dall’avvolgimento

reciproco di tratti dell’α-elica delle catene pesanti. La coda permette alla molecola di formare

filamenti, le miosine si assemblano in modo che le estremità delle code sono rivolte verso il

centro del filamento e le teste siano dirette verso le estremità, il filamento è quindi bipolare,

in quanto vi è una inversione di polarità al centro: le teste di miosina alle estremità opposte

di un filamento possono tirare i filamenti di actina l’uno verso l’altro.

● Non-convenzionali: non era in grado in vitro di assemblarsi in filamenti, la miosina I è più

piccola della II e ha una sola testa (è localizzata nei microvilli intestinali), la miosina V è una

miosina con due teste che si sposta lungo i filamenti di actina, ciò è dovuto alla affinità per

l’actina che permette ad una testa di restare attaccata al filamento finchè l’altra non vi si

attacchi di nuovo, è caratterizzata da un lungo collo che le permette di fare passi più lunghi

in una modalità simile alla chinesina. Diverse miosine (I, V e VI) sono associate a vescicole

e organuli citoplasmatici, si ritiene che una volta che le vescicole si siano avvicinate alla fine

del microtubulo le vescicole si spostino su binari di microfilamenti per il movimento nella

periferia della cellula, ricca di actina. 51

Contrattilità muscolare: le cellule muscolari sono definite fibre muscolari, sono costituite da

filamenti sottili e cilindrici (miofibrille)

che consistono in successioni ordinate

di sarcomeri, i quali mostrano un

sistema di bande dovuti alla

sovrapposizione di filamenti sottili e

filamenti spessi. Ogni sarcomero si

estende da una linea Z alla successiva

e contiene zone scure e chiare: una

coppia di bande I (costituita da filamenti

sottili) ai margini esterni, e una banda A

(costituita da entrambi i filamenti

sovrapposti) situata tra le bande I, ed

una zona H (costituita da filamenti

spessi) collocata al centro della zona A,

al centro della zona H si trova una zona

M.

Motilità non muscolare: le strutture alla base sono limitate ad una zona corticale della cellula subito

sotto la membrana plasmatica (cortex) è responsabile della ingestione di materiale extracellulare,

dell’espansione di processi e della divisione della cellula.

Proteine che legano l’actina: (Actin Binding Proteins)i filamenti actinici nelle cellule sono

organizzati in molti modi, compresi vari tipi di fasci, reti sottili e complessi 3D. Ciò avviene grazie a

proteine che ne regolano assemblaggio e disassemblaggio, e le loro interazioni reciproche e con

organelli cellulari. Si suddividono in:

● Proteine di nucleazione: la nucleazione richiede che 2-3 monomeri di actina si riuniscano

col giusto orientamento. La formazione è accelerata dalla presenza di uno stampo

della γ-tubulina.

preesistente formato dal complesso Arp2/3 che agisce alla pari

● Proteine che sequestrano i monomeri: sono proteine che si legano ai monomeri di actina-

ATP e ne impediscono la polimerizzazione, sono responsabili della concentrazione alta di

monomeri di actina nelle cellule non muscolari: sono in grado di favorire la

polimerizzazione/depolimerizzazione di actina in una certa regione della cellula.

● Proteine che bloccano l’estremità (di incappucciamento): regolano la lunghezza dei

filamenti actinici legandosi ad una estremità a formare un cappuccio che blocca sia la perdita

che il guadagno di subunità.

● Proteine che polimerizzano monomeri: promuovono la crescita di filamenti di actina

associandosi ad un monomero di actina e catalizzando la dissociazione di ADP legato che è

52

sostituito da ATP che può assemblarsi così all’estremità sfrangiata del filamento di actina in

crescita.

● Proteine che depolimerizzano filamenti di actina: si legano alle subunità di actina-ADP e

possono promuovere la frammentazione dei filamenti o la loro depolimerizzazione

all’estremità appuntita.

● Proteine che formano legami crociati: alterano l’organizzazione tridimensionale dei

filamenti di actina, possono legare due actine separate. L’associazione in fasci di filamenti

aumenta la loro rigidità.

● Proteine che tagliano i filamenti: legano un filamento esistente e lo rompono in due.

● Proteine che legano la membrana: sono proteine che legano la membrana plasmatica

all’actina in modo da facilitare le attività che ne implicano la deformazione.

Esempi di contrattilità e motilità non muscolari: i filamenti di actina insieme a miosine motrici

sono responsabili della citocinesi, fagocitosi, il traffico di vescicole, l’interazione cellula-substrato e

la locomozione cellulare.

Locomozione cellulare: è necessaria nei vertebrati più evoluti e negli organismi unicellulari, in

entrambi il movimento ha inizio con l’estroflessione di una parte della superficie cellulare nella

direzione in cui sta per muoversi, una porzione della superficie inferiore si attacca al substrato

temporaneamente, e la massa della cellula si muove in avanti sopra i punti di adesione. La cellula

poi rompe il contatto posteriore provocando l’avanzamento della coda.

Un fibroblasto su piastra di coltura si muove mediante una estensione ampia (lamellipodio) che

presentano un movimento ondulatorio, si espande dalla cellula e aderisce al substrato in punti

specifici fornendo siti di ancoraggio per la cellula (Il movimento del lamellipodio è dinamico, e si

assiste al treadmilling). Le forze maggiori coinvolte nella locomozione sono quelle richieste per

trainare il corpo principale della cellula in avanti.

Quando una cellula riceve lo stimolo a muoversi innesca la polimerizzazione di actina localizzata,

che porta ad una polarizzazione della cellula, che porta al movimento della cellula.

La polimerizzazione dell’actina è responsabile per l’estensione del margine guida di una cellula verso

l’esterno, mentre la miosina genera la forza contrattile di trazione che tira in avanti il resto della

cellula.

I filamenti di actina nel disporsi sotto la membrana plasmatica possono seguire diverse geometrie

(fascio contrattile, rete simile a gel, stretto fascio parallelo) in base alla funzione deputata. Un fascio

di filamenti di actina sarà ovviamente più resistente di un singolo filamento. E se creo un fascio

contrattile potrò generare movimento mediante motori molecolari.

Fasci paralleli di actina formano lo scheletro dei microvilli, e sono tenuti insieme da legami crociati e

laterali creati dalle ABP, a fornire rigidità allo scheletro del microvillo.

Immunofluorescenza: può essere utilizzata per fare indagini sia quantitative che topologiche: mi

può dire di una proteina quanta ce ne è e dove è posizionata all’interno della cellula. Una colorazione

può essere doppia o anche tripla, cioè io in una cellula posso colorare più proteine e cercare di

capire se sono strettamente associate oppure no: se non sono associate ottengo due colori diversi,

quando invece sono associate i due colori si fonderanno e ne formeranno un terzo, e lì si parla di

colocalizzazione, le due proteine si stanno toccando.

Omologia di sequenza: non è che devo avere una perfetta coincidenza degli amminoacidi: se

prendo la leucina e l’isoleucina, sono amminoacidi diversi, ma contengono entrambi una

caratteristica, che è quella di essere idrofobici più o meno delle stesse dimensioni, quindi l’omologia

di sequenza di due proteine non è qualcosa che è in essere al 100%.

La struttura di ciglia e flagelli: è simile al centrosoma, soprattutto nello spermatozoo al livello del

corpo basale. Lungo la coda troviamo coppie di microtubuli radiali e una coppia di microtubuli

53

centrale (10 in tutto, 9+1). Trai singoli filamenti troviamo proteine di giunzione lasse come la nexina

che permettono lo scorrimento dei tubuli periferici, a dispetto della coppia centrale fissa che

costituisce la colonna vertebrale del peduncolo. Questo scorrimento è garantito dalla proteina

Dineina assonemale. La natura del gene e il genoma

Esperimenti

● Chargaff: studia la distribuzione delle 4 basi (già scoperte). Formula la legge di

Chargaff: A+G = T+C, ossia A=T E C=G. Lo scopre separando i componenti del DNA fino ad

avere una miscela di basi; poi usa la cromatografia su carta. La miscela viene assorbita dalla

carta, man mano che il solvente viene assorbito viene separato determinandone i

componenti in base alla quantità.

● Rosalind Frankilin: grazie alla cristallografia a raggi X ottenne l’immagine di una

molecola di DNA

● Griffith: Ipotesi: Trasformazione genica di pneumococchi non virulente.

Metodo: Possiedo un ceppo S di cellule (batteri) lisce e virulente; e un ceppo R di cellule

(batteri) rugose prive di capsula non virulente. Prendo le cellule S e dopo averle scaldate

(denaturate) le inietto in un topo, noto che il topo vive. Prendo le cellule R le metto in

coltura con le cellule S scaldate e le inietto nel topo, noto che il topo muore. Risultati:

Nei topi morti sono presenti batteri S vivi e dunque i batteri R si sono trasformati in batteri

S.

Conclusione: Nei pneumococchi S vi è un principio trasformante.

● Avery, Mc Leid e Mc Carty: Ipotesi: Il DNA è il principio trasformante.

Metodo: Prendo batteri S virulenti, li scaldo e li liso in modo tale che nel mio filtrato

rimangano solo Rna, Dna e proteine. Divido il tutto in 3 provette uguali e ne tratto: una

con DNAasi, una con RNAasi e una con PROTEINasi. Aggiungo i batteri R.

Risultato: noto che solo nella provetta con DNAasi non trovo cellule S virulente.

Conclusione: il DNA è il principio trasformante.

● Hershey e Chase: Ipotesi: il Dna è il principio trasformante.

Metodo: Utilizzo batteriofagi T2: i nuclei vengono marcati con 32P, le proteine

dell’involucro con 35S (questo perchè le proteine contengono C, H, O, N e S, mentre gli

acidi nucleici C, H, O, N e P). I batteri vengono infettati da questo batteriofago. Dopo

l’infezione fagica i batteri vengono più volte centrifugati. Metto in provetta i centrifugati.

Risultati: Con i fagi marcati con 35S trovo la radioattività nel sovranatante, mentre i

batteri sono nel pellet. Inoltre il batterio infetto aveva DNA virale al suo interno mentre le

proteine dell’involucro nel sovranatante se rimosse toglievano al batterio la capacità di

formare nuove particelle fagiche.

Con i fagi marcati con 32P trovo la radioattività nel pellet, dove si trovano anche i batteri.

Quindi la radioattività è nel batterio.

Conclusione: Il principio trasformante è il Dna.

I geni sono fattori ereditari mantenuti nel corso della vita di un individuo e trasferiti alla progenie,

risiedono sui cromosomi e sono costituiti da DNA. Il genoma è l’insieme di tutti i geni necessari ad

un determinato organismo.

La struttura del DNA: l’unità strutturale del DNA è il nucleotide, costituito da: uno zucchero a

cinque atomi di carbonio (desossiribosio) esterificato da un fosfato nella posizione C5 dell’anello e

con una base azotata (pirimidine ad anello singolo: T e C, purine a doppio anello: A e G) legata al

C1. I nucleotidi sono collegati tra loro da legami covalenti a formare un polimero lineare (filamento)

con uno scheletro di gruppi zucchero e fosfato alternati e uniti da legami fosfodiesterici 3’-5’. Il

54

nucleotide è polarizzato: l’estremità 5’ (dove è situato il fosfato) e una estremità 3’, essendo ogni

nucleotide disposto nello stesso senso, nel filamento, un’estremità di esso è 3’, l’altra 5’.

La composizione in basi dei campioni segue la regola di Chargaff, il numero delle purine è sempre

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DESCRIZIONE APPUNTO

Riassunto per l'esame di biologia e genetica, nella facoltà di Medicina e Chirurgia, basato su appunti personali e studio autonomo del testo, Karp (Il mondo della cellula) e Genetica - Russel, fatti nel 2015 e integrati anche con vari particolari detti a lezione. Sono sufficienti da soli a prendere anche il massimo del voto nelle facoltà di Medicina e Chirurgia o che hanno un approccio base con la Biologia, se sono accompagnati alle sbobine o alle slides/appunti delle lezioni del professore. Gli schemi sono fatti seguendo l'impostazione dell'indice del libro e integrati via via con le lezioni. Nella seconda pagina vi è un indice.


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in medicina e chirurgia (a ciclo unico)
SSD:
A.A.: 2015-2016

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Benjamin Meghnagi di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biologia e genetica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università La Sapienza - Uniroma1 o del prof Mancone Carmine.

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