Riassunto esame Tossicologia, prof. Esposito/Campolongo, libro consigliato Casarett

Principi generali

Gli agenti tossici possono essere classificati in modi diversi a seconda della necessità degli studiosi. Il termine tossina si riferisce a sostanze di origine naturale mentre agente tossico indica sostanze prodotte dall’attività umana.

Reazioni allergiche e fenomeni di ipersensibilità

L’allergia ad un agente chimico è una reazione di origine immunologica che deriva da una precedente sensibilizzazione dell’organismo in seguito all’ingresso della stessa sostanza in tempi passati. Le reazioni allergiche, come vedremo, vengono dette di “ipersensibilità”. Ovviamente, alcuni agenti chimici possono non essere dotati di potere immunogeno intrinseco e si comportano da apteni legandosi a specifiche proteine con formazione di un complesso in grado di scatenare l’intervento di anticorpi.

Idiosincrasia

L’idiosincrasia è un fenomeno geneticamente predeterminato, innescato da una reazione anormale dell’organismo all’ingresso di un agente chimico. Un chiaro esempio è il rilassamento prolungato legato allo stato di apnea indotto da una singola dose di succinilcolina. Generalmente, questo farmaco induce un rilassamento muscolare di breve durata poiché viene velocemente metabolizzato dall’enzima plasmatico pseudocolinesterasi ma i pazienti soggetti ad idiosincrasia presentano un particolare polimorfismo nel gene che codifica tale enzima presente nel plasma il quale risulta poco attivo.

Tossicità immediata e ritardata

La tossicità immediata si manifesta rapidamente dopo una singola somministrazione di sostanza mentre la tossicità ritardata impiega decisamente più tempo a dare i suoi effetti (basta pensare ai cancerogeni che possiedono un lungo periodo di latenza).

Tossicità reversibile e irreversibile

La tossicità può essere reversibile o irreversibile a seconda della capacità di rigenerazione del tessuto colpito dall’agente tossico. Il fegato, ad esempio, è dotato di cellule altamente rigenerabili e la maggior parte degli effetti tossici a livello epatico si rivela reversibile mentre il SNC (sistema nervoso centrale), costituito da cellule altamente differenziate che non possono dividersi, è spesso soggetto ad effetti tossici irreversibili.

Tossicità locale e sistemica

La tossicità locale è esclusivamente prodotta nel sito di contatto tra l’agente tossico e il tessuto/organo e non tende ad estendersi ad altre sezioni dell’organismo (vedi ingestione o inalazione di sostanze irritanti). La tossicità sistemica, al contrario, si manifesta anche in punti decisamente distanti dal sito di contatto iniziale a causa dell’assorbimento dell’agente tossico da parte dell’organismo (spesso è il SNC il bersaglio principale di un effetto tossico sistemico).

Relazione dose-risposta

Per relazione dose-risposta si intende il legame esistente tra l’esposizione ad un agente tossico e gli effetti tossici riscontrati. La relazione dose-risposta può essere graduale (descrive la risposta di un individuo alla somministrazione graduale di diverse concentrazioni di una sostanza) o quantale (descrive la risposta della popolazione alla somministrazione di diverse concentrazioni della sostanza). Nella relazione dose-risposta quantale si prende come riferimento il concetto del “tutto o nulla”, ovvero, viene preso in esame un singolo effetto (morte, comparsa di tumore ecc…) e si determina la dose minima necessaria alla comparsa dello stesso effetto in ogni singolo individuo della popolazione.

Un metodo classico per rappresentare graficamente l’andamento dose-risposta è la curva gaussiana (a campana) dove sull’asse y abbiamo la % dei soggetti e sull’asse della x la dose somministrata in mg/kg. Dal tracciato della curva è facile intendere che pochi soggetti rispondono alla dose più bassa ed a quella più alta; la maggior parte dei soggetti risponde, infatti, alle dosi intermedie e la massima risposta si registra nella regione centrale della campana. I pochi soggetti che rispondono alla dose minima sono detti ipersensibili mentre quelli che rispondono solo alle dosi più elevate sono considerati resistenti.

È possibile, poi, creare una curva dose-risposta cumulativa dove si prendono in considerazione non solo i soggetti che rispondono alla dose determinata ma anche a dosi minori. Tale curva è una sigmoide disegnata su grafico semilogaritmico (cioè, sull’asse della x c’è il logaritmo della dose) e presenta una porzione relativamente lineare che va dal 16% all’84%. Questi valori rappresentano il limite di una deviazione standard (SD) dalla media. Prendendo come esempio una popolazione con distribuzione normale, per SD=+1 \ -1 si ha il 68,3% di risposta alla dose da parte della popolazione, per SD=+2\-2 il 95,5%.

Convertendo tali percentuali in unità di deviazione dalla media DEN (deviazioni equivalenti normali) avremo DEN=0 per una risposta della popolazione alla dose somministrata del 50% e DEN=+1 per una risposta dell’84,1%. A sua volta il DEN può essere convertito in PROBIT (probability unit) dove un probit corrisponde alla differenza tra la risposta all’84,1% e quella al 50%. Alla risposta 50% si dà valore 5 per non avere valori negativi. Dunque: 50% = DEN 0 = PROBIT 5; 84,1% = DEN +1 = PROBIT 6 e così via…

Con il probit possiamo ottenere una retta (sempre con il log della dose sull’asse della x) che comprende le risposte della popolazione in un intervallo di dosi somministrate molto ampio. I vantaggi sono: semplicità nell’estrapolare la dose che determina una precisa % di risposta, semplicità nel confronto con curve di altre sostanze.

Tornando alla relazione dose-risposta graduale, si può notare nella relativa curva un aumento concentrazione-dipendente dell’intensità della risposta legato all’alterazione di un particolare processo biochimico. Dunque, se la risposta misurata è un parametro continuo (peso di un organo, glicemia…), si può esprimere l’intensità della risposta in funzione della dose (sull’asse della y abbiamo % di inibizione, sull’asse della x il log della dose in mg/kg. Cerca fig. sul libro pag. 20).

Inoltre, le curve dose-risposta graduali possono essere trasformate in curve quantali fissando un limite minimo di intensità della risposta e considerando solo i soggetti la cui risposta è superiore al limite fissato.

Parametri della relazione dose-risposta

I parametri che caratterizzano la relazione dose-risposta sono: risposta massima (E max), dose che produce un effetto pari al 50% di E max (DE 50), la minima concentrazione alla quale si ha un effetto (dose soglia). Per soglia si intende la dose al di sotto della quale la probabilità che un individuo risponda è uguale a 0. La dose soglia è una misura della potenza della sostanza. Di fondamentale importanza è il confronto tra diverse curve dose-risposta all’interno dello stesso grafico: curve dose-risposta con la stessa pendenza (pendenze parallele) indicano un meccanismo d’azione simile delle diverse sostanze; dosi soglia diverse indicano potenze diverse; il confronto tra E max dà informazioni sul tipo di meccanismo d’azione (effetto totale o parziale della sostanza sul bersaglio molecolare) (vedi fotocopia).

Più precisamente, la potenza si riferisce anche all’intervallo di dosi all’interno del quale una sostanza produce effetti sempre maggiori (nella fig. a pag. 27 A è più potente di B e C è più potente di D). L’efficacia massima si riferisce, invece, al limite della relazione dose-risposta di una certa sostanza (A e B hanno stessa efficacia mentre l’efficacia di C è minore di D).

Indice terapeutico

Per indice terapeutico si intende il rapporto tra la dose necessaria di una sostanza per produrre un effetto tossico e la dose necessaria per produrre una risposta terapeutica desiderata: DT50\DE50 (50 indica la dose tossica e quella efficace mediana). Ovviamente, maggiore è questo rapporto maggiore è la sicurezza della sostanza (spesso farmaco). Poiché le dosi mediane non danno informazioni relative alla pendenza delle rispettive curve dose-risposta per l’effetto tossico ed efficace si preferisce utilizzare il margine di sicurezza DL1\DE99 (DL sta per DT) (su 100, per 99 casi la dose della sostanza somministrata è efficace e per 1 caso è tossica). È chiaro che tale rapporto è utile per una singola somministrazione della sostanza e non è indicativa per quelle sostanze la cui efficacia terapeutica si esplica dopo varie somministrazioni.

Un discorso a parte va fatto per le sostanze richieste per le normali funzione fisiologiche (vitamine ed alcuni elementi come cromo o cobalto…) le quali presentano un tipico andamento ad U della curva dose-risposta graduale. La curva indica chiaramente che a dosi molto basse si hanno numerosi effetti negativi che diminuiscono man mano che aumenta la dose fino a raggiungere una regione di omeostasi. Tuttavia, se la dose somministrata raggiunge livelli eccessivamente elevati si registrano effetti avversi che aumentano con la dose (fig. pag.23).

Numerose evidenze suggeriscono che anche alcune sostanze tossiche non nutrizionali possono dare effetti benefici a basse dosi ed effetti avversi ad alte dosi (curva ad U). Questo concetto è definito con il termine di ormesi, fenomeno che definisce la capacità di alcune sostanze di stimolare i sistemi biologici a basse dosi e di inibirli a dosi più elevate (l’assunzione cronica di alcol aumenta il rischio di cancro epatico ma il suo consumo moderato riduce l’incidenza di malattie coronariche e di ictus).

Metodi degli studi tossicologici e valutazione del rischio

La valutazione del rischio si occupa dei potenziali effetti avversi sulla salute legati all’esposizione dell’uomo ad agenti pericolosi. Per rischio si intende la probabilità che si verifichi un effetto avverso in seguito all’esposizione ad un agente nocivo. La valutazione del rischio contempla informazioni scientifiche sia qualitative che quantitative (informazione qualitativa sulla natura dell’effetto tossico integrata con dati quantitativi sul tempo di esposizione o sensibilità dell’ospite…).

La gestione del rischio si riferisce ai provvedimenti politici per gestire il pericolo identificato mentre la comunicazione del rischio riguarda la divulgazione delle informazioni alla comunità inerente alla gestione dell’agente tossico.

Studi tossicologici

Per stabilire la tossicità dei prodotti chimici si utilizzano informazioni provenienti da quattro tipi di studio:

• Relazione struttura-attività (SAR)
• Studi in vitro a breve termine
• Saggi sull’animale in vivo
• Studi epidemiologici sull’uomo

I primi tre sono studi tossicologici sperimentali (si somministra la sostanza con modalità definite e controllate tenendo in considerazione tempo, dose, via di somministrazione, per poi analizzare gli effetti tossici. Si effettuano su animali, colture cellulari, microrganismi) mentre gli studi epidemiologici trattano gli effetti su popolazioni umane di una sostanza presente nell’ambiente o somministrata a scopo terapeutico (vaccini, farmaci). Da considerare a parte gli studi epidemiologici ecologici legati agli effetti di una sostanza a livello di ecosistemi esposti.

Negli studi sperimentali la variabilità dei soggetti è ridotta al minimo (animali della stessa età-sesso\sani\con dieta controllata), l’esposizione alla sostanza è strettamente controllata, l’esposizione ad altre sostanze è eliminata o limitata. Negli studi epidemiologici l’esposizione non può essere controllata (tranne che per i farmaci), gli individui sono contemporaneamente esposti a molte altre sostanze o condizioni che possono influenzare l’effetto tossico, le popolazioni esposte sono eterogenee (alta variabilità).

Dettagli degli studi tossicologici

Vediamo, adesso, nel dettaglio i quattro principali studi tossicologici:

1) Relazione struttura-attività (SAR)

Lo studio di cancerogenicità di un singolo agente chimico svolto su un roditore richiede, ad esempio, informazioni dettagliate sulla struttura-attività della sostanza impiegata (struttura chimica del composto, solubilità, stabilità al PH, elettrofilia, volatilità, reattività). I rapporti struttura-attività sono molto utilizzati per la valutazione di miscele complesse di diverse sostanze (riferimento allo studio svolto su TCDD, tetraclorodibenzotossina, in relazione alla sua reattività a contatto con la miscela di sostanze presenti nell’atmosfera). Nel caso di miscele di composti dotati di simile struttura chimica la valutazione del rischio prende in considerazione i TEF (fattori di equivalenza di tossicità). La stima di tossicità per tali miscele viene calcolata con la somma del prodotto della concentrazione di ciascun composto moltiplicata per il suo valore TEF.

2) Studi in vitro a breve termine

L’approccio successivo per l’identificazione del rischio comprende test in vitro fondamentali per comprendere i meccanismi d’azione delle sostanze tossiche. Inoltre, tali saggi sono veloci e poco costosi a differenza di quelli biologici. Bisogna sempre accertarsi che i test in vitro siano sufficientemente specifici (ad esempio, in grado di distinguere carcinogeni da non carcinogeni).

3) Saggi sull’animale in vivo

Gli effetti prodotti da una sostanza in animali da laboratorio, quando opportunamente provati secondo gli standard GPL (buone pratiche di laboratorio), vengono prodotti anche nell’uomo. Per quanto riguarda il dosaggio, esso è simile in animali da esperimento e uomo quando espresso come rapporto peso della sostanza in esame/superficie corporea. Se invece il dosaggio è espresso con il rapporto peso della sostanza/peso corporeo l’uomo è circa 10 volte più sensibile delle cavie.

Tutte le sostanze cancerogene per l’uomo (tranne l’arsenico) lo sono anche per molte specie animali (non per tutte) anche se non è certo che molte sostanze cancerogene per l’animale lo siano per l’uomo. L’esposizione di animali da laboratorio ad alte dosi di agente tossico è un metodo valido e necessario per scoprire eventuali pericoli per l’uomo; questo perché, sperimentalmente, l’uso di dosi elevate conferisce dati successivamente utilizzabili per valutare l’entità del rischio associato alla somministrazione di basse dosi.

In generale, tali test di tossicità non sono indirizzati a dimostrare che una sostanza è sicura ma a caratterizzare gli effetti tossici che può produrre. I primi test che si eseguono sulla cavia riguardano la tossicità acuta della sostanza e possono dare importanti informazioni sulla tossicità intrinseca dell’agente nocivo (espressa come dose letale DL50). Le specie animali utilizzate sono il topo, ratto, coniglio. Possono essere scelte diverse vie di somministrazione, una delle quali deve essere orale. L’esame è autoptico con osservazione degli animali per 15 giorni. La DL50 per supertossici è <5mg/kg. La DL50 per i non tossici è >15mg/kg.

La tossicità acuta di un agente tossico può provocare irritazione cutanea o oculare. Per valutare i due tipi di irritazione si predilige la via di somministrazione locale e le cavie sono conigli. Il test di irritazione cutanea prevede l’applicazione della sostanza (0,5 ml se liquida, 0,5g se solida) sulla pelle del dorso precedentemente rasata dell’animale ricoperta con la garza e tenuta a contatto per 4 ore. Il test di irritazione oculare, invece, prevede l’instillazione in un solo occhio della sostanza in esame (0,1 ml se liquida o 100 mg se solida). In seguito all’esecuzione di entrambi i test si osserva il grado di irritazione a vari intervalli di tempo.

Infine, per tutte le sostanze che possono venire ripetutamente a contatto con la pelle, si svolgono test di sensibilizzazione allergica che prevedono l’applicazione per via topica o intradermica della sostanza per un periodo di 2-4 settimane (utilizzo di sostanze adiuvanti nel test di Freund).

4) Test di tossicità subacuta

I test di tossicità subacuta si eseguono per ottenere informazioni sugli effetti tossici indotti dopo somministrazione ripetuta dell’agente tossico. La via di somministrazione è orale, l’animale da laboratorio è il ratto. Generalmente, si effettuano 3-4 somministrazioni per un periodo di 2 settimane e successivamente si analizzano i dati provenienti da analisi chimico-cliniche (tossicità d’organo, ad esempio a livello del fegato).

Si prosegue valutando la tossicità subcronica della sostanza scegliendo come cavia ratto e cane con un periodo di esposizione di 90 giorni. La via di somministrazione è orale (solo in casi specifici si preferisce quella inalatoria o dermica) e si impiegano almeno tre dosi della sostanza (dose alta con max di letalità del 10% circa; dose bassa non tossica; dose intermedia). Lo scopo di questo test è l’individuazione del NOAEL (il livello più alto di dose che non produce effetto tossico) e del LOAEL (il livello più basso di dose che produce effetto tossico).

È importante tenere in considerazione anche l’ADI (assunzione quotidiana accettabile) utilizzata per descrivere i livelli di assimilazione, degli agenti chimici, tollerabili in quanto al di sotto dei valori che causano effetti avversi sulla salute. Le osservazioni vengono fatte in vivo: Peso corporeo/consumo di cibo e acqua (la diminuzione del peso è sintomo generale di tossicità e può essere legata a minore assunzione di cibo mentre l’assunzione di acqua permette di identificare effetti diuretici) Analisi ematologiche (consentono di identificare effetti tossici sul sistema ematopoietico) Analisi chimico-cliniche (tossicità d’organo) Analisi delle urine (volume urinario, indice di disidratazione, livelli di glucosio, colorazione per indagine su ematuria o emoglobinuria, ricerca di calcoli).

Le osservazioni post-mortem sono: Necropsia (per individuare alterazioni morfologiche evidenti degli organi) Peso degli organi, Analisi istologica. Tutte queste indagini servono ad identificare l’organo bersaglio e il tipo di tossicità. Gli studi di tossicità cronica si eseguono in...