Riassunto esame Tossicologia, Prof. Giovannelli Fabio, libro consigliato Casarett & Doull. Elementi di tossicologia, Di John B. III Watkins, Curtis D. Klaassen

Tossicologia

Principi generali di tossicologia

La tossicologia è lo studio degli effetti indesiderati delle sostanze chimiche sugli organismi viventi. Il tossicologo è in grado di esaminare la natura di questi effetti e di valutare la probabilità che essi si verifichino. Sono tossici sostanze chimiche o agenti fisici che producono effetti biologici avversi, sono chiamati veleni i tossici che causano malattia o morte immediata a dosi molto basse. Il termine tossina, invece, si riferisce alle sostanze tossiche prodotte da sistemi biologici quali piante, animali, funghi o batteri.

Lo spettro degli effetti indesiderati delle sostanze chimiche è molto vasto. Ogni farmaco produce numerosi effetti, ma di solito solo uno di questi è associato con l’obiettivo primario della terapia, tutti gli altri sono gli effetti indesiderati o effetti collaterali. Alcuni effetti collaterali sono dannosi per la salute dell’uomo e vengono definiti effetti indesiderati, dannosi o tossici del farmaco.

Tipi di risposte tossiche

• Tossicità immediata e ritardata: Gli effetti tossici immediati sono quelli che si sviluppano rapidamente dopo una singola somministrazione di una sostanza, mentre quelli ritardati si osservano dopo un certo periodo di latenza. Gli effetti cancerogeni hanno generalmente un periodo di latenza molto lungo e spesso nell’uomo occorrono da 20 a 30 anni dall’esposizione iniziale prima che si osservi il tumore.
• Effetti tossici reversibili e irreversibili: Se una sostanza produce un danno a un tessuto, la reversibilità o l’irreversibilità dell’effetto dipende principalmente dalla capacità di rigenerazione del tessuto. La maggior parte delle lesioni a carico del fegato sono reversibili perché il tessuto epatico ha un’elevata capacità rigenerativa, mentre le lesioni a carico del SNC sono per lo più irreversibili perché le sue cellule differenziate non possono essere rimpiazzate. Gli effetti teratogeni e cancerogeni sono generalmente considerati effetti tossici irreversibili.
• Tossicità locale e sistemica: Gli effetti locali sono quelli che si verificano nel sito di primo contatto tra il sistema biologico e l’agente tossico. Invece, gli effetti sistemici sono quelli che richiedono l’assorbimento e la distribuzione dell’agente tossico dal suo sito di entrata a un punto lontano ove è in grado di produrre i suoi effetti tossici. La maggior parte delle sostanze produce effetti sistemici. Alcune hanno effetti sia locali che sistemici. In generale, gli agenti chimici che causano effetti sistemici producono la loro massima tossicità in uno o due organi, definiti organi bersaglio della tossicità.

Tolleranza

La tolleranza è la condizione di diminuita risposta dell'effetto tossico di una sostanza chimica dovuta a una precedente esposizione alla sostanza stessa o ad un’altra strutturalmente simile. I principali meccanismi di tolleranza sono una diminuita quantità di sostanza che raggiunge il sito in cui viene prodotto l’effetto tossico (tolleranza cinetica) e una ridotta reattività del tessuto.

Ad esempio, la glicoproteina P è una pompa d’efflusso multifarmaci energia-dipendente di superficie che è stata trovata in intestino, rene, fegato, cervello, placenta e ghiandole surrenali che è in grado di ridurre l’assorbimento GI, la distribuzione e aumenta l’eliminazione del farmaco.

Esposizione concomitante ad altre sostanze

Tra gli altri fattori che influenzano l’azione tossica c’è l’esposizione concomitante ad altre sostanze. Si ha un effetto additivo quando due sostanze somministrate contemporaneamente producono un effetto pari alla somma degli effetti indotti da ciascuna di esse somministrata singolarmente. Si ha un effetto sinergico quando la combinazione di due sostanze produce effetti maggiori della somma degli effetti indotti dalle sostanze somministrate singolarmente (es. 2+2 = 20).

Si ha potenziamento quando una sostanza di per sé è priva di effetti tossici su un organo o un sistema, ma se viene somministrata contemporaneamente ad un’altra, questa la rende più tossica (es. 0 + 2 = 10). L’isopropanolo da solo non è epatotossico ma è in grado di potenziare l’epatotossicità del tetracloruro di carbonio quando somministrato in associazione. L’antagonismo è la situazione in cui due sostanze interferiscono tra loro oppure una sostanza interferisce con l’azione dell’altra.

Tra i vari tipi di antagonismi, c’è l'antagonismo chimico o inattivazione nel quale tra due sostanze avviene una reazione chimica che dà esito a un prodotto meno tossico. Ad esempio, i chelanti sono in grado di ridurre la tossicità dei metalli e gli antidoti possono neutralizzare le tossine di origine animale.

Caratteristiche dell’esposizione

Gli effetti tossici su un sistema biologico non vengono prodotti senza che l’agente o i suoi metaboliti raggiungano i siti appropriati dell’organismo a una certa concentrazione e per un tempo sufficientemente lungo per avere l’effetto tossico. La risposta tossica dipende dalle proprietà chimico-fisiche dell’agente, dalla sede di esposizione, dal metabolismo dell’agente tossico e dalla suscettibilità del sistema biologico. Le più importanti vie attraverso cui gli agenti tossici hanno accesso all’organismo sono il tratto gastroenterico, i polmoni, la pelle e le vie parenterali.

Generalmente, gli agenti tossici producono gli effetti maggiori e le risposte più rapide quando vengono iniettati direttamente nel sangue (via endovenosa). La via di somministrazione può influenzare la tossicità degli agenti. Ad esempio, un agente che agisce sul SNC ed è detossificato dal fegato dovrebbe essere meno tossico se somministrato per via orale piuttosto che per via inalatoria, perché la via orale richiede che quasi tutta la dose passi dal fegato prima di raggiungere la circolazione sistemica e quindi il SNC.

I tossicologi suddividono generalmente l’esposizione alle sostanze chimiche negli animali da esperimento in quattro categorie: acuta, subacuta, subcronica, cronica. L’esposizione acuta è l’esposizione ad un agente chimico per meno di 24 ore e generalmente si riferisce ad una singola somministrazione.

L’esposizione ripetuta è suddivisa in tre categorie: subcronica, subacuta, cronica. L’esposizione subacuta si riferisce a esposizioni ripetute per un mese o poco meno, quella subcronica da 1 a 3 mesi, quella cronica per più di tre mesi.

Nelle situazioni di esposizione nell’uomo, la frequenza e la durata dell’esposizione sono spesso non chiaramente definite come negli studi animali. Esposizioni occupazionali o ambientali possono essere descritte come acute (singola esposizione), subcroniche (esposizione per alcune settimane o mesi) o croniche (esposizioni che avvengono ripetutamente per molti mesi o anni).

Per numerosi agenti gli effetti tossici ottenuti dopo una singola somministrazione sono molto diversi da quelli ottenuti con esposizioni ripetute. L’esposizione acuta ad agenti che vengono assorbiti rapidamente può favorire effetti tossici immediati.

Al contrario, nell’esposizione cronica, oltre agli effetti a lungo termine osservabili a basse dosi, dopo ogni somministrazione si possono osservare effetti immediati (acuti). Un altro fattore importante per la caratterizzazione temporale delle esposizioni è la frequenza di queste. Ad esempio, una sostanza B la cui emivita è uguale alla frequenza di somministrazione, raggiunge la concentrazione tossica dopo la quarta somministrazione. La sostanza A, che ha una velocità di eliminazione inferiore alla frequenza con cui viene somministrata, raggiunge la stessa concentrazione dopo due sole somministrazioni.

Inoltre, anche se la sostanza non si accumula, dopo ogni somministrazione possono essere presenti danni cellulari o tissutali, pertanto è importante valutare se l’intervallo di tempo che intercorre tra i due dosaggi successivi sia stato sufficiente per permettere un completo recupero del danno. Quindi si possono verificare effetti tossici quando la sostanza si accumula nel sistema biologico, quando produce effetti tossici irreversibili o se tra gli intervalli di esposizione non c’è un tempo sufficiente da permettere un completo recupero del danno.

Relazione dose-risposta

La relazione tra il grado di risposta del sistema biologico e la quantità di sostanza tossica somministrata è un concetto fondamentale in tossicologia. Dal punto di vista pratico, si possono distinguere due tipi di relazioni dose-risposta: (1) la relazione dose-risposta individuale, che descrive la risposta di un individuo a diverse concentrazioni della sostanza (2) la relazione dose-risposta quintale che descrive la distribuzione della risposta a diverse concentrazioni della sostanza in una popolazione di individui.

In entrambi i casi, le risposte vengono riportate sull’asse delle ordinate e possono rappresentare il grado di risposta di un individuo o di una frazione di popolazione che risponde, mentre l’intervallo delle dosi è riportata in ascisse. La dose letale 50 è la dose singola, calcolata statisticamente, che può prevedibilmente causare la morte del 50% degli animali esposti. La dose minima efficace di ogni sostanza che evoca una risposta tutto o nulla viene definita dose soglia e non può essere determinata sperimentalmente.

La dose è la quantità di sostanza assunta in un’unica volta. In genere espressa come la quantità di sostanza assunta per unità di peso dell’individuo esposto. La dose letale 50 o DL50 è la dose che, somministrata ad una popolazione, provoca la morte del 50% dei soggetti.

La dose letale è la dose capace di uccidere un essere vivente in un’unica somministrazione. La DL50 si ottiene tracciando una linea orizzontale al punto in cui si ha il 50% di mortalità, fino alla curva dose-effetto. Nel punto d’intersezione si traccia una linea verticale che intercetta l’ascissa nel punto corrispondente alla DL50.

Usi della DL50

• Per standardizzare la potenza di un tossico
• Per calcolare l’indice terapeutico
• Per selezionare le dosi per gli studi di tossicità cronica
• Per ottenere informazioni sulla biodisponibilità
• Per predire le sintomatologie tossiche

Oltre alla DL50 si può calcolare la pendenza della curva dose-risposta. La sostanza B che ha una pendenza minore ha bisogno di aumentare notevolmente la dose per ottenere una variazione significativa della risposta. Per la sostanza A che ha una curva dose-risposta molto ripida, sono sufficienti piccoli aumenti della dose per avere una marcata variazione della risposta.

Un altro importante aspetto della relazione dose-risposta a basse dosi è il concetto di soglia, al di sotto del quale la probabilità di una risposta individuale è zero. La presenza o l’assenza di soglia è importante per identificare livelli “sicuri” di esposizione a una sostanza.

L’indice terapeutico è il rapporto tra la dose necessaria a produrre un effetto tossico (DL50) e quella necessaria a produrre una risposta desiderata (DE50). Maggiore è il rapporto, maggiore sarà la relativa sicurezza del farmaco in esame.

Variazioni nelle risposte tossiche

Per tossicità selettiva s’intende la capacità di una sostanza di produrre un danno su un organismo senza avere effetti su altri. Sfruttando i vantaggi della diversità biologica è possibile, infatti, sviluppare agenti chimici letali per una specie e innocui per un’altra. È inoltre importante tenere presente che nella risposta ad agenti tossici possono esistere differenze sia quantitative che qualitative tra le diverse specie e che anche all’interno della stessa specie possono verificarsi delle variazioni individuali nella risposta agli agenti chimici che dipendono da sottili differenze genetiche definite come polimorfismo genetico.

Studi di tossicità su animali da esperimento

La maggior parte delle sostanze di sintesi oggi sono soggette a stretto controllo sulla sicurezza prima di poter essere immesse sul mercato. Esistono vari metodi per la valutazione della tossicità tra questi troviamo: gli studi sperimentali su animali da laboratorio, gli studi su cellule isolate, studi epidemiologici ovvero lo studio e l’osservazione della popolazione umana durante il normale uso di una sostanza o in seguito a una esposizione accidentale e i trials clinici (per i farmaci).

I principi fondamentali alla base di tutti i test di tossicità descrittiva eseguiti su animali da esperimento sono due. Il primo è che gli effetti prodotti da una sostanza su animali da esperimento, quando opportunamente provati, sono indotti anche nell’uomo. Il secondo principio è che l’esposizione di animali da laboratorio ad alte dosi di agenti tossici è un metodo valido e necessario per scoprire eventuali pericoli nell’uomo, perché l’incidenza di un effetto in una popolazione è maggiore con l’aumento della dose o del periodo di esposizione.

Per ottenere risultati statisticamente validi da un basso numero di animali, la dose della sostanza in esame dovrà dunque essere relativamente alta, in maniera tale che l’effetto sia così frequente da poter essere osservato.

Prove di tossicità acuta

Il primo test di tossicità che si esegue su una nuova sostanza è il test di tossicità acuta. Si valutano gli effetti avversi che si verificano entro un tempo breve dalla somministrazione di una dose singola o multipla di una sostanza, per un’esposizione totale della durata massima di 24 ore. Gli studi di tossicità acuta sono la “prima linea di azione” in assenza di informazioni sugli effetti a lungo termine nelle prime fasi di sviluppo di nuove molecole. In questo gruppo rientrano anche gli studi di letalità.

La DL50 e gli altri effetti tossici sono valutati usando una o più vie di somministrazione (via orale o via di esposizione prevista per la sostanza) in una o più specie di animali da laboratorio, normalmente il topo e il ratto ma a volte anche coniglio e cane. Gli animali si osservano per 14 giorni e durante questo periodo di registra la mortalità. Questi test danno una valutazione quantitativa della tossicità della sostanza (DL50), forniscono informazioni sugli organi bersaglio e sulle manifestazioni cliniche di tossicità, identificano le specie suscettibili e le differenze di specie, stabiliscono se l’effetto tossico è reversibile o meno, permettono di individuare livelli di dose da usare negli studi successivi.

In genere, i test di tossicità acuta per via dermica si eseguono nel coniglio. Il sito di applicazione viene rasato, dopodiché si applica la sostanza e si copre con un bendaggio. Dopo 24 ore il bendaggio viene rimosso e la pelle viene ripulita dai residui della sostanza. Gli animali vengono osservati per 14 giorni e si calcola il DL50.

Gli studi di tossicità acuta per via inalatoria si eseguono in maniera simile e il periodo di esposizione è di 4 ore. Gli studi di letalità acuta sono dunque essenziali per caratterizzare gli effetti tossici degli agenti chimici e la loro pericolosità per l’uomo. Le più importanti informazioni per questi test derivano dalle osservazioni cliniche post-mortem degli animali piuttosto che dal valore specifico di DL50.

Il test di irritazione cutanea si esegue sulla cute del coniglio. Il pelo della regione dorsale viene rimosso e la sostanza in esame viene applicata su un’area di cute intatta e su due aree di cute abrase. Le aree vengono coperte con un bendaggio per 4 ore. Il grado di irritazione cutanea è distinto di eritema (arrossamento), escara (formazione di croste), edema e azione corrosiva. Le osservazioni per la registrazione di tali sintomi sono ripetute a vari intervalli dopo la rimozione del bendaggio.

Il test di irritazione oculare (test di Draize) consiste nell’istallazione della sostanza in esame in un occhio di ciascuno dei conigli usati nel test. L’occhio controlaterale viene usato come controllo. Gli occhi vengono esaminati a vari intervalli di tempo dall’applicazione della sostanza. Le sostanze non irritanti non danno alcun effetto, quelle irritanti provocano danni minori (opacità corneale, edema congiuntivale e leggera iperemia dell’iride con recupero entro 7 giorni). Le sostanze definite pericolose causano perdita epitelio corneale, congiuntivite, opacità corneale marcata con recupero entro 21 giorni. Le sostanze corrosive provocano danni persistenti che vanno oltre 21 giorni e necrosi del tessuto. Recentemente sono stati sviluppati metodi alternativi per la valutazione della tossicità cutanea e oculare, come le colture di cheratinociti epidermici e le colture di cellule epiteliali corneali.

Per tutte le sostanze che vengono ripetutamente a contatto con la pelle sono necessarie anche informazioni sulla capacità di indurre sensibilizzazione cutanea. In genere, si usa la cavia come specie animale (Guinea Pig). La sostanza viene applicata per via topica o intradermica su pelle depilata, per un periodo che va dalle 2 alle 4 settimane. Due o tre settimane dopo l’ultimo trattamento, si applica agli animali una dose della sostanza in esame e si valuta una possibile comparsa di eritema.

Tossicità subacuta

Gli studi di tossicità subacuta vengono eseguiti per ottenere informazioni sulla tossicità di una sostanza chimica dopo somministrazioni ripetute per un periodo della durata tipica di 14 giorni. La durata media di questi studi è di 1-2 mesi. Tali studi servono a: determinare gli effetti tossici a dosi più basse, che consentono la sopravvivenza degli animali, determinare gli effetti tossici su un periodo di esposizione maggiore, identificare specifici organi...