Studio dei batteri, terreni di coltura + test rapidi e biochimici

Micobatteri e la loro colorazione

I micobatteri sono batteri che presentano particolari caratteristiche nella loro parete cellulare, come un alto contenuto di lipidi, che li rende difficilmente colorabili con i metodi di colorazione tradizionali.

Essi sono resistenti all'alcol-acido, a differenza dei batteri Gram che sono solo resistenti all'alcol. Ciò significa che la colorazione non viene eliminata o decolorata con l'alcol. Nel caso dei micobatteri, la colorazione rimane stabile sia con gli acidi che con gli alcoli.

La colorazione di Ziehl Neelsen è un metodo di colorazione a caldo, che prevede il fissaggio del materiale biologico sul vetrino e l'applicazione del primo colorante. Questo colorante deve essere fissato al calore, quindi il vetrino e il colorante vengono posti sopra la fiamma. In questo modo, il colore penetra nei lipidi presenti nella parete cellulare dei micobatteri, che vengono colorati di fucsia.

Successivamente, il vetrino viene sciacquato per eliminare il colore in eccesso.

l'eccesso di colorante e viene cimentato con alcol più acido per eliminare un ulteriore eccesso di colorante, perché i micobatteri non perdono il loro colore, e poi il vetrino viene colorato con blu di metilene che è un colorante di contrasto, per evidenziare quindi tutto ciò che non è micobatterio (ad es. le cellule epiteliali) in modo da avere, su campo blu, dei bacilli fucsia alcol-acido resistenti.

COLTURE MICROBICHE

In campo microbiologico è di primaria importanza riuscire a coltivare e perpetuare i microrganismi in laboratorio e ciò è reso possibile solo dalla disponibilità di adeguati terreni di coltura. I terreni di coltura possono essere costruiti completamente impiegando componenti ben definiti chimicamente, si parla di terreni definiti o sintetici oppure possono contenere costituenti come peptoni (derivati proteici), estratti di lievito o di carne di cui non si conosce l'esatta composizione per cui si parla

diterreni complessi. I vari terrenti di coltura sono classificati in base alla funzione ed alla loro composizione come:

• TERRENI PER USO GENERICO (es. Agar Sangue);
• TERRENI ARRICCHITI con particolari nutrienti, generalmente sangue di pecora o di cavallo, per stimolare la crescita di un determinato microrganismo e inibire quella di altri microrganismi contaminanti presenti nel campione. Questi terreni consentono la crescita di quasi tutti i microrganismi di interesse medico. I terreni di arricchimento sono generalmente i brodi. Nei terreni di arricchimento, inoltre, la specie microbica di interesse vi cresce in un tempo assai più breve rispetto ad altre metodiche;
• TERRENI SELETTIVI, che contengono sali biliari o coloranti basici come il blu di metilene che inibiscono la crescita di gram- favorendo lo sviluppo dei gram+. Sono utilizzati per l'isolamento di specifici microrganismi da campioni altamente contaminati.
• TERRENI DIFFERENZIALI, in grado di distinguere tra

patate bollite e poi sterilizzati. Nello stesso periodo un collaboratore di Koch, Loeffler sviluppò un terreno che contenesse come ingrediente base un peptone e riscosse un buon successo. Data la passione per la fotografia di Koch, fu il primo a fare microfotografie ai batteri, ed essendo capace di prepararsi le lastre fotografiche con sali d'argento e gelatina, intuì che lo stesso metodo poteva essere usato per i terreni solidi, usò quindi il terreno con il peptone più che la gelatina, ma vi erano numerosissimi svantaggi poiché la gelatina non resisteva alle alte temperature ed alcuni batteri erano in grado di idrolizzarla. Nel 1882 fu usato la prima volta l'Agar, già noto da molto tempo come agente solidificante nella preparazione della gelatina. Fu Fannie Hesse, la moglie di un collaboratore di Koch, a suggerire l'uso dell'Agar quando venne a conoscere le difficoltà incontrate con la gelatina: questo fu un grande successo.

Cinque anni più tardi, nel 1887, Jiulius Richard Petri, un altro assistente di Koch, inventò la piastra per coltura che porta il suo nome, da quel momento caddero in disuso le piastre di vetro ricoperte di agar. Queste innovazioni resero possibile l'isolamento di colture pure, che contenevano un solo tipo di batterio, dando un notevole impulso in tutti i campi della batteriologia. I terreni di coltura contengono tutte quelle sostanze organiche e inorganiche necessarie per la crescita del microrganismo. La composizione chimica dei diversi terreni di coltura è in parte differente in relazione alle necessità nutrizionali del batterio che desidera coltivare. Alcune sostanze però sono necessarie a tutti i microrganismi in quantità notevoli, e tra queste carbonio, azoto, ossigeno, idrogeno, zolfo e fosforo. I principali micronutrienti sono invece: - Cobalto: entra nella sintesi di vitamina B12; - Zinco: indispensabile per la funzione di.

metalloenzimi;

• Molibdeno: nelle nitrogenasi e in altri enzimi azoto-riduttori;
• Rame: negli enzimi della respirazione;
• Manganese: attivatore di enzimi;
• Nickel: nelle idrogenasi.

Preparazione dei terreni di coltura e ricerca di microrganismi

I terreni di coltura attualmente possono essere prodotti oppure ordinati da ditte che già li producono in quantità industriale e standardizzata. L'importante è che i terreni abbiano determinati materiali, tra cui:

• Agar in polvere;
• Acqua distillata;
• Piastre Petri in plastica;
• Provette;
• Becher;
• Bunsen;
• Pipette pasteur;
• Pipette di vetro;
• Cotone;
• Incubatore;
• Vetrini;
• Microscopio.

Come si preparano i terreni di coltura?

1. Pesata degli ingredienti;
2. Dissoluzione degli ingredienti;
3. Correzione del pH al valore desiderato;
4. Distribuzione nei recipienti (terreni liquidi);
5. Sterilizzazione terreni (calore umido o filtrazione);

Distribuzione in capsule di Petri (terreni solidi); Controllo della sterilità dei terreni. Le colture microbiche si ottengono seminando sulla superficie dell'agar il materiale microbico che si deve analizzare: si parla quindi di piastratura, su cui ogni cellula potrà riprodursi sul terreno formando un agglomerato di microrganismi detto colonia. Esistono 3 tecniche di piastratura: - PIASTRA PER DIFFUSIONE - Tipo I: nel centro di una piastra contenente agar si semina una piccola quantità di una miscela microbica diluita e per mezzo di una spatola si stende uniformemente sul terreno; - Tipo II: il campione originale viene diluito più volte in diverse provette e poi miscelato ad agar fluido, poi si versa la miscela su una capsula di Petri e si lascia raffreddare per permettere la solidificazione e la crescita delle colonie. - PIASTRA PER STRISCIO: la miscela microbica viene seminata ai margini della piastra per mezzo di un'ansa da inoculo, quindi...

si stende con una serie di strisci (piastra grande E. coli, S.aureus).

TIPI DI SEMINA

Premessa: in laboratorio si eseguono studi qualitativi e quantitativi sui microrganismi e occorre che essi siano in coltura pura, cioè che il ceppo da esaminare sia esente da altri microrganismi. Una coltura pura si può ottenere separando i vari microrganismi presenti in uno stesso terreno iniziale mediante tecniche dette di isolamento. Quindi per conoscere le proprietà di specie di microrganismi che convivono nel medesimo ambiente dovremo riuscire a:

• Separarli fisicamente gli uni dagli altri;
• Farli crescere separati in laboratorio.

Per cui si può affermare che le operazioni fondamentali dell'indagine microbiologica sono ISOLAMENTO e COLTIVAZIONE. Per isolamento si intende la separazione di un dato individuo (cellula) dagli altri individui (popolazione mista naturale di cellule) con cui convive; per coltivazione si intende la moltiplicazione del singolo individuo (cellula).

su un substrato adatto alla crescita così daottenere alla fine una popolazione di cellule appartenenti ad un’unica specie. COLTURA PURA o AXENICA: coltura o popolazione cellulare derivante dalla moltiplicazione di unasingola cellula microbica. TECNICHE DI SEMINA per isolamento Presupposto fondamentale per lo studio e l’identificazione dei microrganismi isolati dai vari materialisottoposti all’esame microbiologico è quello di disporre di una coltura pura. Per ottenere unacoltura pure è quindi necessario:

• Diluire il campione iniziale per separare le cellule presenti (isolamento);
• Trasferire una singola colonia in un terreno sterile in modo da ottenere una popolazione dicellule identiche (coltura pura).

ISOLAMENTO PER STRISCIAMENTO: è necessario un terreno agarizzato su piastra Petri; si deponesul terreno una piccola quantità del campione da analizzare (popolazione mista) e con l’ansa sistriscia il campione su tutta la piastra. Il

Il sistema può variare in relazione al percorso da far seguire all'ansa sulla superficie dell'agar. Le cellule vengono rilasciate in maniera disuguale: le strisciate iniziali rilasceranno molte cellule che daranno origine, dopo incubazione, ad una patina; il progressivo esaurimento del carico dell'ansa determinerà alla fine la semina di poche cellule separate tra loro. Questo processo si svolge in 3 fasi: nella fase uno si osserva un composto massivo, nella fase due si ha una diminuzione della carica batterica e, infine, nella fase tre si riusciranno a distinguere le colonie isolate.

Isolamento degli stafilococchi

Il terreno per l'isolamento degli stafilococchi viene chiamato terreno di Chapman ed è ricco di NaCl (cloruro di sodio), che è ben tollerato da S. aureus mentre inibisce la maggior parte degli altri batteri, con l'aggiunta di mannitolo (che è uno zucchero costantemente fermentato da S. aureus): è arricchito di NaCl.

Perché gli stafilococchi sono batteri aerobi gram-positivi, che si presentano sotto forma di piccole sfere raggruppate a grappolo. Questi batteri sono molto diffusi nell'ambiente e possono colonizzare diverse parti del corpo umano, come la pelle, le mucose e le vie respiratorie. Gli stafilococchi possono causare una serie di infezioni, che vanno da lievi irritazioni cutanee a infezioni più gravi, come la polmonite o la setticemia. La loro resistenza agli antibiotici è un problema significativo nella gestione delle infezioni stafilococciche.