Studio dei batteri, terreni di coltura + test rapidi e biochimici

Microbiologia: tecniche di studio dei batteri

Ruolo del laboratorio di microbiologia nella diagnosi delle malattie infettive

La diagnosi microbiologica si effettua per le malattie infettive, il cui ovvio presupposto sono le infezioni. Il microbiologo lavora esclusivamente su e con i microrganismi agenti d’infezione. La sua diagnosi eziologica di malattia è, in realtà, una diagnosi d’infezione, che ha bisogno di essere correlata con il quadro clinico e anamnestico del paziente. Infatti, il ciclo diagnostico si compone di 3 fasi principali:

• Fase pre-analitica: visita del medico al letto del paziente, che quindi raccoglie tutti i dati anamnestici e i fattori di rischio e, in base alla sintomatologia, invia il campione più idoneo al laboratorio di microbiologia.
• Fase analitica: propria del laboratorio.
• Fase post-analitica: il momento in cui il medico riceve il risultato del laboratorio e provvede a dare la terapia più adeguata al paziente una volta individuato l’agente eziologico.

È opportuno ricordare che la microbiologia si divide in quattro branche, ognuna con la sua specificità:

• Batteriologia
• Virologia
• Micologia
• Parassitologia

Diagnosi diretta vs diagnosi indiretta

La diagnosi diretta è da preferire, poiché può consentire uno studio analitico di un determinato agente eziologico, soprattutto per quanto riguarda i determinanti genetici della virulenza e della resistenza ai farmaci chemioterapici. È una diagnosi praticabile universalmente.

La diagnosi indiretta trova indicazione nelle infezioni acute e nell’infezione primaria (es. malformazioni congenite, da virus o altri microrganismi che, pur derivando da infezioni persistenti, possono essere diagnosticate efficientemente con tecniche sierologiche).

Diagnosi batteriologica

La diagnosi batteriologica è una diagnosi che prevede vari step e, anch'essa, può essere effettuata mediante diagnosi diretta o indiretta: ad esempio, la diagnosi diretta può essere fatta su sangue, feci, urine, biopsie, tamponi, che vengono analizzati mediante esame colturale per cui, una volta effettuata la crescita batterica, il microrganismo viene identificato e viene effettuato un antibiogramma. Affianco a questo tipo di esame è possibile associare una diagnosi indiretta, ovvero il siero del paziente immuno-presunto tale viene sottoposto a test sierologico per valutare se vi è o meno la presenza di un dato anticorpo che indicherà l’avvenuto contatto con l’agente eziologico causa della malattia.

La diagnosi indiretta può poi essere effettuata anche utilizzando i metodi della biologia molecolare e, quindi, andando a ricercare direttamente nel campione biologico il genoma batterico mediante PCR (Multiplex, Real time, ecc.).

Diagnosi batteriologica diretta

La valutazione della presenza dell’agente patogeno può essere effettuata mediante:

• Esame microscopico (batterioscopico)
• Esame colturale (isolamento)
• Ricerca di antigeni
• Ricerca di sequenze geniche

L’esame batterioscopico può essere effettuato valutando le caratteristiche macroscopiche e microscopiche delle colonie che crescono nei terreni di coltura. Le caratteristiche macroscopiche possono essere diverse in:

• Aspetto: puntiforme, circolare, filamentoso, irregolare, rizoide e lenticolare
• Spessore: rasata, convessa, pulvinata e umbonata
• Margini: interi, ondulati, lobati, erosi, filamentosi e stratificati

Quindi già l’aspetto macroscopico della colonia può dare al microbiologo un’indicazione sulla probabile identificazione dell’agente eziologico, per cui possiamo dire che i caratteri coltural forniscono indizi utili per l’identificazione, anche se questi possono dare una identificazione presuntiva, poiché per avere una identificazione corretta è necessario utilizzare i test biochimici.

Le caratteristiche microscopiche, invece, si osservano mediante il microscopio ottico, uno strumento costituito da un tubo metallico che contiene l’oculare (solitamente e bi-oculare ma nella foto rappresentata vi è un solo oculare), al di sotto del quale vi è la ruota degli obiettivi, alla quale sono appunto agganciati gli obiettivi di diverso ingrandimento (10X, 40X, 100X). Poi vi sono i ganci, necessari per tenere fermo, il condensatore, la sorgente di luce, che permette l’illuminazione del vetrino che deve essere osservato, il braccio che tiene l’oculare e il tavolino porta campione, le viti macrometriche e micrometriche che servono per la messa a fuoco e, infine, la base del microscopio. L’ingrandimento del microscopo è dato dall’oculare per gli obiettivi (OCULARE X OBIETTIVO), per cui obiettivo ed oculare lavorano insieme per risolvere l’immagine: l’oculare “risolve” l’immagine “reale” risolta dall’obiettivo.

I campioni possono essere osservati sia a fresco che dopo colorazione (fissati al calore o chimicamente). La scelta del tipo di microscopia dipende dal patogeno presente:

• Microscopia in campo oscuro
• Microscopia in contrasto di fase
• Microscopia in fluorescenza

Spesso si utilizzano delle colorazioni dedicate per mettere in evidenza alcuni batteri, quali:

• Colorazione di Gram (pag. 66 del libro)
• Colorazione di Ziehl Neelsen (alcol-acido resistenza)

Le colorazioni semplici prevedono l’impiego di un solo colorante, solitamente cristalvioletto, fucsina basica o blu di metilene; le colorazioni differenziali prevedono l’impiego di più di un colorante (colorazione di Gram o colorazione di Ziehl Neelsen).

Come si effettua la colorazione?

Innanzitutto, bisogna prelevare una colonia presente sul terreno di coltura. Questa colonia deve essere stemperata (solitamente in cloruro di sodio), deve essere fatta asciugare all’aria e poi fissata sulla fiamma. Una volta che il campione è fissato si può procedere alla colorazione (pag. 66 passaggi della colorazione di Gram). Attraverso la colorazione del campione con tecnica di Gram si osserverà:

• Morfologia: cocchi, bastoncelli, coccobacilli
• Disposizione: catenelle, cluster, diplococchi
• Quantità assoluta di batteri presenti
• Percentuale relativa di Gram positivi o negativi
• Localizzazione in sede intra o extra cellulare

La colorazione di Ziehl Neelsen è una colorazione differenziale che serve per evidenziare i Micobatteri, i quali sono difficilmente colorabili con gli altri metodi di colorazione a causa delle particolari caratteristiche della parete cellulare (alto contenuto in lipidi). I micobatteri sono alcol-acido resistenti, mentre i Gram sono solo alcol resistenti e cioè la colorazione non viene eliminata se decolorata con alcol.