Introduzione allo studio dei microrganismi, Microbiologia

Microbiologia:

introduzione allo studio dei

microrganismi

Antonella Milazzo

Appunti di

Università degli studi di Catania

Testo di riferimento:

Microbiologia Farmaceutica

Nicola Carlone, Raffaello Pompei

Seconda edizione

Edises

Antonella Milazzo Pag. 1

Sommario 4

INTRODUZIONE ALLA MICROBIOLOGIA…………………………………..............

 Grandezze e misure

 Origine della vita sulla terra

 I campi di studio della microbiologia 6

I PROCARIOTI E LE CARATTERISTICHE DEI MICRORGANISMI…………

 Differenze tra una cellula eucariota e una cellula procariote

 Caratteristiche dei microrganismi: grandezza

 Caratteristiche dei microrganismi: forma

 Unione tra batteri: stati di aggregazione

 I cocchi

 I bacilli 8

STRUTTURE CARATTERISTICHE………………………………………….....................

 Strutture essenziali

 Strutture facoltative 13

GENETICA BATTERICA …………………………………………………………………………..

 Le mutazioni genetiche

 La ricombinazione 15

METABOLISMO BATTERICO…………………………………………………………………..

 Respirazione

 Fermentazioni

 Fonti di carbonio

 I nutrienti

 I terreni di coltura

 BEA e MSA 18

DIVISIONE CELLULARE E STRATEGIE DI SOPRAVVIVENZA…………......

 Curva di crescita batterica

 Fattori che influenzano la crescita batterica

 Strategie di sopravvivenza

 La sporulazione

 La germinazione

 Stato vitale non coltivabile

Antonella Milazzo Pag. 2

22

BIOFILM ……………………………………………………………………………………………………

 Formazione del Biofilm

 Esperimenti e osservazioni sul Biofilm

 Quorum sensing

 Glicocalice o capsula del Biofilm

 Combattere il Biofilm 25

RAPPORTI MICRORGANISMI/OSPITE…………………………………………………….

 Fonti d’infezione

 Il ruolo dell’ospite 28

L’INFEZIONE……………………………………………………………………………………………..

 Come si stabilisce un’infezione

 Endotossine: LAL Test

 Esotossine 31

LA REAZIONE DELL’OSPITE DI FRONTE UN’INFEZIONE…………….........

 Immunità umorale : Gli anticorpi

 Immunità cellulo-mediata: i linfociti T

 Immunizzazione

 Il vaccino

 I costituenti del vaccino

DIAGNOSI DELLE MALATTIE INFETTIVE E DETERMINAZIONE 35

DELL’ATTIVITÀ MICROBICA………………………………………………………………….

 Diagnosi diretta

 Antibiogramma

 Antibiogramma per diffusione secondo Kirby Bauer

 Metodo della macrodiluizione (non più usato).

 Valori di breakpoint

CARATTERISTICHE MICROBIOLOGICHE DEI PRODOTTI 39

FARMACEUTICI…………………………………………………………………………………….....

 Determinazione della carica microbica

 Controllo dell’attività di un disinfettante

 Controllo dell’attività di un conservante

 Norme di buona preparazione dei medicinali

Antonella Milazzo Pag. 3

INTRODUZIONE ALLA MICROBIOLOGIA

La microbiologia è una scienza che studia gli organismi microscopici chiamati microrganismi o microbi. Per

studiarli è opportuno osservarli, e per osservare batteri, miceti e protozoi e sufficiente utilizzare il

microscopio ottico, mentre per gli organismi più piccoli, come i virus, è necessario utilizzare il microscopio

elettronico.

 Microscopio ottico = un apparecchio molto piccolo e relativamente poco costoso presente in tutti

i laboratori. Il microscopio presenta due lenti di ingrandimento, una oculare e altre due negli

obiettivi. Il campione viene messo su un vetrino e appoggiato, e da sotto esce una luce visibile che

evidenzia il campione. Con il microscopio ottico si arriva ad avere mille ingrandimenti (i batteri si

vedono mille volte più grandi).

 Microscopio elettronico = un apparecchio molto grande e anche molto costoso. Mentre il

microscopio ottico per evidenziare il campione utilizza la luce nello spettro del visibile, il

microscopio elettronico utilizza un fascio di elettroni. Questi elettroni per passare attraverso il

campione, devono trovare il vuoto (difatti i campioni da analizzare vengono preparati sottovuoto).

A seconda delle lunghezze d’onda, si ha una risoluzione diversa: la luce visibile ha una lunghezza

d’onda maggiore e arriva a dare 1000 ingrandimenti (questo nel microscopio ottico); gli elettroni

invece viaggiano ad una lunghezza d’onda inferiore rispetto alla luce visibile e si riescono ad avere,

nel microscopio elettrico, 200.000 ingrandimenti. Il microscopio ottico è di due tipi:

 A scansione

 A trasmissione, riesce ad avere ingrandimenti ancora maggiori fino a 500.000

ingrandimenti.

Essi si differenziano principalmente per la preparazione del campione.

Grandezze e misure

Ciò che vediamo e analizziamo al microscopio ottico, ha come ordine di grandezza il micrometro. Un

micrometro è la millesima parte del millimetro.

Ciò che vediamo e analizziamo al microscopio elettronico, ha come ordine di grandezza il nanometro. Un

nanometro è un millesimo di micrometro, cioè un milionesimo di millimetro.

Origine della Vita sulla terra

I batteri sono i primi esseri viventi comparsi sulla terra, poiché hanno un grande spirito adattativo a

qualsiasi condizione. Quattro miliardi e mezzo di anni fa, pare che l’atmosfera della terra per noi uomini

fosse irrespirabile in quanto era costituita da ammoniaca, metano, idrogeno, vapore acqueo, anidride

solforosa e ossido di carbonio. La maggior parte dei ricercatori pensa che grazie all’energia dei fulmini e

all’energia solare, questi gas cominciarono a reagire dando vita ai primi composti organici, che si disciolsero

nell’acqua formando il noto brodo primordiale. I primi composti che si formarono furono: amminoacidi,

zuccheri e gli acidi organici, i mattoncini fondamentali della materia vivente. Dopo altri anni di evoluzione,

venne a formarsi una molecola con una straordinaria capacità, ovvero di fare copie identiche di se stessa, il

DNA. Da esso, si formarono le prime proto cellule, rivestite da una sottile membrana, che galleggiavano

nel brodo primordiale. Una volta nate le proto cellule, nacquero le cellule da noi conosciute,e nacquero i

primi batteri che però utilizzavano i nutrienti già disciolti nell’acqua (organismi eterotrofi). Circa 3 miliardi

e mezzo di anni fa, sul fondo dei mari si formarono delle strutture che sembravano dei panettoni molto

irregolari, chiamati stromatoliti, e si vide che questi erano rivestite da numerosissimi strati di alghe verdi e

azzurre, che noi chiamiamo ciano batteri. I ciano batteri sono i primi organismi autotrofi di cui si ha notizia,

capaci di trasformare la luce solare in energia con il meccanismo della fotosintesi. Nella fotosintesi l’acqua si

scinde in idrogeno e ossigeno, e i batteri cominciarono a liberare ossigeno, dapprima nel brodo primordiale

Antonella Milazzo Pag. 4

e successivamente nell’atmosfera. Grazie a questi batteri l’ossigeno diede il via a quella lunga ma costante

evoluzione che portò la vita sulla terra così come oggi la conosciamo.

I campi di studio della Microbiologia

 Microbiologia pura = studia la morfologia, la fisiologia, la genetica, la distribuzione nell'ambiente,

la tassonomia, cioè l’inquadramento in famiglie, e l’evoluzione dei microrganismi.

 Microbiologia applicata = studia principalmente i microrganismi dannosi e il controllo delle loro

attività nocive, con antibiotici, disinfettanti. Studia anche i microrganismi utili e il modo di sfruttare

le loro attività:

 Nei depuratori delle acque reflue urbane. In esse si trova un filtro completamente ricoperto

di batteri, che si cibano e metabolizzano sostanze a noi nocive e come prodotto di scarto

producono delle sostanze a noi innocue.

 Biodegradazione del petrolio

 Servono per la produzione di cibi e bevande (yogurt, formaggi, birra, vino, pane)

 Produrre sostanze organiche (metanolo, acetone)

 Produzione di sostanze terapeutiche, come l’insulina, una volta estratta dal pancreas dei

maiali e adesso prodotta dai microrganismi utili.

Antonella Milazzo Pag. 5

I PROCARIOTI E LE CARATTERISTICHE DEI

MICRORGANISMI

Differenze tra una cellula eucariota e una cellula procariote

 Il nome deriva dal greco: per gli eucarioti vuol dire “dotato di nucleo”, per i procarioti il nome

significa “prima del nucleo”. Ciò vuol dire che le eucariote hanno una membrana che ricopre il

materiale genetico, mentre nei batteri tale membrana non esiste e il DNA è disperso nel citoplasma,

anche se si trova in un’area ben definita che viene detta nucleoide.

 Negli eucarioti si trova più di un cromosoma per cellula. L’uomo per esempio, ha 23 coppie di

cromosomi (46 cromosomi), mentre nei procarioti esiste un solo cromosoma di forma circolare. Nei

batteri poi si trovano dei pezzettini di DNA più piccoli e sempre di forma circolare che vengono

chiamati plasmidi.

 Nei batteri troviamo la parete cellulare, tranne nei micoplasmi che non hanno questa caratteristica.

Negli eucarioti la parete cellulare è molto rara e si trova solo in alghe e funghi. La parete cellulare è

una struttura rigida che serve a dare protezione e forma ai batteri. Dato che gli eucarioti non hanno

parete cellulare, hanno una membrana intercalata da steroli, delle molecole rigide che servono

appunto a dare rigidità e resistenza a questo rivestimento. Nel batteri gli steroli sono generalmente

esterni e si trovano nei micoplasmi, dei batteri molto particolari che non avendo la parete cellulare

hanno bisogno degli steroli che fanno loro da membrana.

 I ribosomi sono pressoché identici, costituiti in entrambi i casi da due sub unità e di dimensioni

differenti ma la funzione è assolutamente identica, ovvero relativa alla sintesi proteica.

 Negli eucarioti sono presenti degli organelli deputati alla respirazione, intesa come produzione di

energia, che sono i mitocondri. Nei procarioti invece sono presenti degli enzimi respiratori che si

trovano appiccicati alla membrana citoplasmatica.

 Per quanto riguarda la riproduzione, negli eucarioti può essere sia sessuata che asessuata, mentre

nei procarioti avviene sempre e solo in maniera asessuata, per scissione binaria, ovvero che dalla

cellula madre, dopo un accrescimento, avviene la separazione dalla quale nascono due cellule figlie

completamente identiche alla cellula madre.

 Per le dimensioni, ovviamente gli eucarioti sono nettamente più grandi dei procarioti.

Caratteristiche dei microrganismi: Grandezza

Se prendiamo un batterio, in base alla forma può avere grandezza differente:

 Di forma sferica, può arrivare a una grandezza di un micron

 Di forma allungata, può avere dimensioni di due micron ma può anche arrivare a 5 micron.

Caratteristiche dei microrganismi: Forma

I batteri possono variare non solo per grandezza, ma anche per forma:

 Forma sferica, e prendono il nome di cocchi

 Forma cilindrica, e prendono il nome di bacilli

 Forma cilindrica e incurvata, o meglio a forma di virgola, e prendono il nome di vibrioni

 Forma incurvata, e prendono il nome di spirilli o spirochete. Essi non posseggono una sola curva

come i vibrioni ma ne hanno più di una e anche su più piani.

Per agente eziologico si intende quel batterio che causa una determinata malattia.

Antonella Milazzo Pag. 6

Unione tra batteri: stati di aggregazione

I batteri difficilmente si trovano da soli, difatti possiamo elencare determinati stati di aggregazione in base

a come i batteri si uniscono tra di loro e soprattutto evidenziando la forma particolare che assumono.

I Cocchi

Per quanto riguarda i cocchi:

 Quando si formano dei mucchetti disordinati, essi vengono chiamati stafilococchi

 Quando si formano delle lunghe catene ordinate, questi vengono chiamati streptococchi (strepto dal

greco vuol dire proprio collana)

 Quando si accoppiano a due a due, essi vengono chiamati diplococchi e possono essere di due tipi:

 A chicco di caffè, quando si evidenzia una parte esterna arrotondata

 A punta di lancia, quando si evidenzia una parte esterna appiattita

La maggior parte dei cocchi sono gram positivi, anche se fanno eccezione i batteri che si dispongono a

chicco di caffè, che sono gram negativi.

I Bacilli

Per quanto riguarda i bacilli:

 Si chiamano streptobacilli, quando formano lunghe catene ordinate

 Si chiamano a palizzata, quando si dispongono l’uno di fianco all’altro. Tale disposizione viene

anche chiamata disposizione a mozzetto di sigari.

 Si chiamano a lettere cinesi, quando hanno una disposizione puramente casuale e disordinata.

I micoplasmi, dei particolari batteri, non avendo la parte cellulare, hanno la particolarità di assumere

qualsiasi forma vogliono. Si parla dunque di pleomorfismo dei micoplasmi.

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STRUTTURE CARATTERISTICHE

Esistono delle strutture essenziali e fondamentali per la cellula procariote, talmente importante da

deciderne anche l’esistenza. Altre strutture invece, sono considerate facoltative poiché alcuni batteri

possono averle, altre no, non compromettendo l’esistenza del procariota.

Essenziali Facoltative

NUCLEOIDE (1) CAPSULA E GLICOCALICE (6)

CITOPLASMA (2) FLAGELLO (7)

MEMBRANA CITOPLASMATICA (3) FIMBRIE (8)

PARETE CELLULARE (4)

MEMBRANA ESTERNA (5)

STRUTTURE ESSENZIALI

1. Nucleoide

Formato dal cromosoma circolare del batterio che si dispone generalmente al centro della cellula

procariota. Si chiama nucleoide pochè assomiglia al nucleo ma è sprovvisto di membrana.

Inoltre vi è un piccolissimo filamento del DNA che viene chiamato Plasmidio, ed è una parte del

materiale genetico indipendente dal cromosoma e può essere trasmesso non solo ad altre cellule

figlie quando la madre si divide, ma può essere trasmesso anche per via orizzontale, cioè da una

cellula ad un’altra con caratteristiche simili.

Sul cromosoma sono presenti le informazioni fondamentali del batterio, sui plasmidi si trovano

invece delle informazioni accessorie e dove molto spesso viene codificata la resistenza agli

antibiotici. Difatti, i batteri con caratteristiche simili, trasmettendosi il plasmidio, possono

trasmettersi di conseguenza la resistenza agli antibiotici.

Il cromosoma è molto grande rispetto al batterio. Quando il cromosoma è in un avvolgimento

disordinato, arriva a misurare anche 10 micron. I batteri dunque prendono tale cromosoma e

cominciano a ordinarlo e ad avvolgerlo formando strutture con estroflessioni ad ansa, che riducono

notevolmente le dimensioni del cromosoma, passando da 10 a 2 micron. Ma ancora non è

sufficiente: quindi il batterio continua a super avvolgere le anse finché il cromosoma non diventa

così piccolo da riuscire ad entrare nel batterio. Tale lavoro è svolto da un particolare enzima,

chiamato DNA girasi.

2. Citoplasma.

Nel citoplasma vediamo il materiale genetico disciolto dove sono presenti molte sostanze tra cui

amido e ribosomi. I ribosomi sono simili sia nei procarioti che negli eucarioti: sono costituiti da due

sub unità, di grandezze diverse a seconda della cellula, 50 S e 30 S nei procarioti e 60S e 40S negli

eucarioti. Tali sub unità si associando e diventano di 70S nei procarioti e 80S negli eucarioti. La S

sta per “velocità di sedimentazione” della sub unità e tale differenza è fondamentale per alcuni

antibiotici.

3. Membrana citoplasmatica

La membrana citoplasmatica è simile a quella degli eucarioti, costituita da un doppio strato

fosfolipidico con le teste polari verso l’esterno o verso il citoplasma e le code idrofobe che si

fronteggiano all’interno. La vera differenza tra la membrana degli eucarioti e la membrana dei

procarioti sta nel fatto che nei batteri ci sono intercalate numerose proteine, chiamate di trans-

membrana, che presentano varie funzioni:

 Ritenzione del contenuto cellulare, ovvero del citoplasma

Antonella Milazzo Pag. 8

 Barriera osmotica

 Funzione impermeabile

 Sito di attività metabolica. Ogni proteina che finisce con –asi ha funzione enzimatica:

 Permeasi = permettono il trasporto di sostanze nutrienti dall’esterno verso

l’interno della cellula e facilitano il trasporto dall’interno verso l’esterno delle

sostanze di scarto.

 Enzimi biosintetici = si occupano di sintetizzare delle parti fondamentali del

batterio.

 Proteine respiratorie = sono infilate dentro la membrana citoplasmatica che si

occupano della produzione di ATP.

 Secerne enzimi extracellulari, cio&egrav