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ESTRATTO DOCUMENTO

Coltivazione dei batteri Preparazione dei terreni 10 E10

Distribuzione dei terreni di coltura

Il principio fondamentale è quello di mantenere sterile

il terreno durante tutte le operazioni successive alla

sterilizzazione.

Terreni liquidi: possono essere sterilizzati in bottiglie,

qualora se ne preveda l'utilizzo in grandi quantità (Es.:

terreni di arricchimento), o direttamente in provetta. In

questo secondo caso, dopo la sterilizzazione, sono pronti per

l'uso.

Terreni solidi: qualora siano stati sterilizzati in bottiglie,

al momento dell'utilizzo vanno disciolti (bagnomaria o forno a

microonde), eventualmente addizionati dei componenti aggiuntivi

e versati in provette o in piastre Petri. Se il terreno non

richiede aggiunta di ingredienti termolabili, le provette

possono essere riempite prima della sterilizzazione. Le

provette vengono poste a solidificare su supporti appositi (in

verticale o su piano inclinato, per terreno cosiddetto a "becco

di clarino"), le piastre su superfici la cui planarità è stata

verificata con una livella

Conservazione dei terreni di coltura

Nel determinare il quantitativo di piastre e provette da

approntare, va tenuto conto dei limiti di tempo entro i quali è

possibile usare il prodotto. Per i terreni di uso più comune

vengono osservate le seguenti indicazioni:

piastre conservate a +4°C 2 settimane

piastre conservate a +4°C in 8-10 settimane

sacchetti di plastica

provette con tappo 3-4 settimane

conservate a +4°C

provette con tappo conservate 1-2 settimane

a temperatura ambiente

flaconi con tappo a vite 3-6 mesi

conservati a +4°C 10

Conteggio dei Esame batteriologico 11

microrganismi

Prima parte - LUNEDI Anno accademico ....... E11

Data ...................

CONTEGGIO DEI MICRORGANISMI NEGLI

ALIMENTI

ESAME BATTERIOLOGICO

Campionamento

L'analisi di un piccolo campione prelevato da una massa di

grandi dimensioni ha senso soltanto se il campione è

rappresentativo di tutta la massa e ne rispecchia quindi la

composizione media. Nelle operazioni di prelievo dei campioni

occorre quindi attenersi a norme che rispecchino il

probabilismo del campionamento. Vi sono leggi, decreti e

ordinanze ministeriali che stabiliscono le quantità da

prelevare e il numero di contenitori di una stessa partita da

saggiare (Es.: Legge 30 aprile 1962, numero 283; Ordinanza

Ministeriale 11 ottobre 1978 G.U. n. 346 del 13/12/1978;

Decreto Ministeriale 21 aprile 1986, G.U. n. 229 del

2/10/1986). Per maggiori dettagli fare riferimento ai capitoli

sull'esame batteriologico dei singoli alimenti.

Prelievo

Questo paragrafo fornisce indicazioni generali, valide

in laboratorio, sulle modalità di prelievo dell'aliquota da

analizzare. Anche in questo caso, per maggiori dettagli, fare

riferimento ai capitoli sull'esame batteriologico dei singoli

alimenti.

Alimenti liquidi

Necessario:

Pipette,

cilindri graduati,

siringhe.

Il contenitore va agitato per ovviare alla possibile

flambage

stratificazione dei vari componenti. Dopo

dell'apertura del contenitore si preleva sterilmente con

pipetta sterile la quantità necessaria per l'esecuzione

dell'analisi e la si trasferisce in contenitore sterile

adeguato. I risultati verranno espressi in UFC (unità formanti

colonia) per unità di volume (generalmente il millilitro).

Alimenti solidi

Necessario: 11

Conteggio dei Esame batteriologico 12

microrganismi E12

Tamponi,

spatole,

pinze,

forbici.

I batteri possono essere ricercati sulla superficie [carica

batterica superficiale: risultati espressi in UFC per unità di

2

superficie (generalmente cm )] o nella profondità [carica

batterica profonda: risultati espressi in UFC per unità di peso

(generalmente grammi)]. Per la carica batterica superficiale si

ricorre all'uso di tamponi sterili, di apparecchi appositi che

effettuano il lavaggio della superficie (l'esame viene condotto

sul liquido di lavaggio) o al prelievo di una sottile striscia

di alimento. Nel caso della carica batterica profonda occorre

cauterizzare la superficie e mediante pinza e forbici sterili,

prelevare la quantità di alimento necessaria all'analisi e

trasferirla in contenitori sterili per l'omogeneizzazione.

Tutte le operazioni suddette vanno condotte in condizioni di

sterilità operando nei pressi della fiamma.

Omogeneizzazione

Con mixer

Sul mercato ne esistono numerosi modelli. Il prodotto è

omogeneizzato finemente con lame multiple mosse da un motorino

elettrico che impone loro un movimento rotativo molto rapido.

Maggiore è la velocità, maggiore l'omogeneizzazione.

Con stomacher

Negli ultimi 10-15 anni si è diffuso l'utilizzo di

strumenti che consentono l'utilizzo di buste di plastica in

luogo dei contenitori di vetro. L'apparecchio è dotato di due

pale che, con moto alterno, schiacciano il contenuto della

busta contro una parete.

Metodo Pro Contro

uso poco pratico, il

coperchio e il vasetto

devono garantire una

ottima

Mixer chiusura ermetica,

omogeneizzazione, aumento (anche >5°C)

economico, contenitori della temperatura del

riutilizzabili contenuto

omogeneizzazione non

praticità d'uso, non sufficiente con

c'è aumento della alimenti di

Stomacher temperatura del consistenza duro-

contenuto elastica, scarto di

materiale plastico,

costo iniziale

elevato, costo delle

buste di plastica

elevato 12

Conteggio dei Esame batteriologico 13

microrganismi E13

Diluizione

Poiché gli alimenti contengono enormi quantità di

6 10

batteri (10 -10 /g o ml) si rende necessaria la diluizione

del campione per poter gestire numeri più piccoli (30-300/g o

ml). La natura del diluente è fondamentale. Va scelto un

liquido che assicuri una perfetta dispersione batterica e che

non ne inibisca lo sviluppo. Lo stesso liquido può essere

utilizzato per favorire l'omogeneizzazione di alimenti solidi.

Acqua peptonata (con sistema tampone)

peptone ...........................g 20,0

NaCl ...........................g 5,0

Na PO ...........................g 9,0

4

2

K PO ...........................g 1,5

4

2 Allestimento delle diluizioni

Si ipotizzi di voler raggiungere la diluizione 1:10.000.000

7

(cioè 1:10 ).

Necessario:

Pipette da ml 1,

Provette da batteriologia o flaconcini con

ml 9 di diluente,

Acqua peptonata con sistema tampone

1. Se il campione non può essere analizzato entro un'ora

dall'arrivo al laboratorio, va conservato a 0-5°C.

2. Omogeneizzare 15 grammi di alimento in 135 millilitri

di acqua peptonata (diluizione finale 1:10) e lasciare riposare

per 15 minuti per rivitalizzare i batteri. Attenzione: tempi

superiori comportano la moltiplicazione dei batteri e i

risultati non sono più attendibili. In acqua peptonata il tempo

di latenza è di circa 1 ora.

3. Trasferire 1 ml dall'omogeneizzatore alla prima

provetta della serie; agitare accuratamente. Si è ottenuta una

diluizione del materiale iniziale di 1:100. Proseguire fino

a

alla 6 provetta (diluizione 1:10.000.000).

Semina

Per inclusione

1. Contrassegnare le piastre con matita vetrografica o

pennarello per vetro (data, n. del campione, tipo di terreno,

diluizione).

2. Trasferire da ciascuna provetta 1 ml del contenuto in

ciascuna piastra. 13

Conteggio dei Esame batteriologico 14

microrganismi

3. Versare in ogni piastra 10-15 ml di terreno allo E14

stato liquido (≈45°C) e miscelare con movimenti di va e vieni

perpendicolari e rotatori.

4. Lasciare solidificare l'agar. 14

Conteggio dei Esame batteriologico 15

microrganismi

In superficie E15

1. Trasferire da ciascuna provetta 0,1 ml del

contenuto in piastre con terreno solido pronto all'uso.

2. Distribuire uniformemente sulla superficie del

terreno con l'ausilio di bacchette di vetro o di plastica

ricurve.

3. Lasciare assorbire.

Incubazione

L'ambiente in cui si pone il terreno è fondamentale affinché la

coltivazione abbia successo. In particolare i parametri che è

possibile variare sono la temperatura, la concentrazione di

CO , la disponibilità di ossigeno per gli anaerobi e sua elimi-

2

nazione per gli anaerobi (per es. immettendo azoto inerte).

Le piastre vanno poste a incubare capovolte per evitare

che eventuali tracce di condensazione formatesi sotto al

coperchio cadano sul terreno. 15

Conteggio dei Esame batteriologico 16

microrganismi

Seconda parte - MERCOLEDI Anno accademico .......

Data ................... E16

CONTEGGIO DEI MICRORGANISMI NEGLI

ALIMENTI

ESAME BATTERIOLOGICO

Lettura dei risultati

Sono considerate le piastre con un numero di colonie

compreso tra 30 e 300.

M = n/V ·

F

dove: M = numero dei microrganismi/ml

n = numero di colonie cresciute

V = volume inoculato

F = fattore di diluizione

Se vengono utilizzate più piastre per ogni diluizione la

formula è la seguente:

M = (∑n/V · F)/x

dove: M = numero dei microrganismi/ml

∑n = sommatoria del numero di colonie

cresciute in tutte le piastre considerate

V = volume inoculato

F = fattore di diluizione

x = numero in cui la stessa cifra (che

corrisponde al numero delle piastre

seminate per ciascuna diluizione) è

ripetuta tante volte quante sono le piastre

considerate (Es.: 3 piastre per ciascuna

diluizione, 4 diluizioni: il numero è

3333).

Di seguito vengono fornite le indicazioni dei terreni di

batteriologia degli

coltura più comunemente impiegati in

alimenti

. 16

Conteggio dei Esame batteriologico 17

microrganismi E17

Carica microbica totale 17

Conteggio dei Esame batteriologico 18

microrganismi Enterobatteri E18

18

Conteggio dei Esame batteriologico 19

microrganismi E19

19

Conteggio dei Esame batteriologico 20

microrganismi E20

20

Conteggio dei Esame batteriologico 21

microrganismi E21

21

Conteggio dei Esame batteriologico 22

microrganismi E22

22

Conteggio dei Esame batteriologico 23

microrganismi Stafilococchi E23

23

Conteggio dei Esame batteriologico 24

microrganismi E24

24

Conteggio dei Esame batteriologico 25

microrganismi Enterococchi E25

25

Conteggio dei microrganismi. Metodi diversi 26 E26

Seconda parte - MERCOLEDI Anno accademico ........

Data ...................

CONTEGGIO DEI MICRORGANISMI NEGLI

ALIMENTI

METODI DIVERSI DALL'ESAME BATTERIOLOGICO

Una sospensione batterica che appaia leggermente torbida a

occhio nudo contiene approssimativamente 10 milioni di batteri

7

(10 ) per millilitro.

Conteggio cellulare

Microscopia

Il numero di microrganismi può essere stabilito per

osservazione diretta al microscopio grazie all'impiego di

particolari camere di conteggio, ossia di vetrini portaoggetti

su cui è impresso un reticolo costituito da una serie di

quadratini il cui lato misura 50 i bordi del reticolo sono

µm.

leggermente rialzati, in modo tale che, una volta deposta la

goccia della sospensione batterica in esame e ricoperto il

tutto con un sottile vetrino coprioggetto, l'altezza della

camera, cioè la distanza tra la superficie del reticolo e

quella del coprioggetto, corrisponda esattamente a 20 Le

µm.

sole cellule batteriche che vengono contate sono quelle che si

osservano all'interno dei vari quadratini del reticolo; il

numero ottenuto viene rapportato al valore volumetrico della

camera e, se il campione della sospensione batterica è stato

diluito prima di essere stato esaminato, viene moltiplicato per

il relativo fattore di diluizione. La camera di conteggio che

viene di solito impiegata in batteriologia è detta camera di

Petroff-Häuser. Tale tecnica non consente di distinguere le

cellule batteriche morte da quelle vive e fornisce quindi

valori di conte totali.

Camera di Petroff-Häuser per il conteggio delle cellule batteriche. Le dimensioni di

ciascuno dei quadratini che costituiscono il reticolo sono: 0,05 mm x 0,05 mm x 20

µm; il volume corrisponde a 50.000 µm3. Il numero dei batteri contati sull'intera

area del reticolo (quadrato grande) viene moltiplicato per il valore volumetrico e

per il fattore di diluizione della sospensione batterica, qualora una tale

diluizione si sia resa necessaria prima di procedere al conteggio. (da Boyd,

Microbiologia generale, Medical Books). 26

Conteggio dei microrganismi. Metodi diversi 27 E27

Resistenza elettrica

Le cellule sono dei cattivi conduttori di elettricità

e oppongono resistenza al passaggio della corrente

elettrica. Il contatore Coulter è una apparecchiatura in

cui una sospensione cellulare viene fatta passare

attraverso una sottilissima fessura su entrambi i lati della

quale sono posti degli elettrodi. Una cellula batterica che si

frapponga tra i due elettrodi impedisce il passaggio della

corrente e determina una caduta di voltaggio che viene

registrata sotto forma di un impulso la cui altezza è

proporzionale al volume della cellula. Contando gli impulsi e

la loro forma, tale sistema consente di determinare il numero e

le dimensioni delle cellule presenti in una data sospensione.

Anche in questo caso non si distinguono le cellule vive da

quella morte e i valori sono quindi riferiti a conte totali.

Una possibile fonte di errore è la presenza nella sospensione

batterica di particelle di pulviscolo o di fibre.

Densità cellulare

I sistemi fotometrici sono quelli maggiormente impiegati

per determinare la concentrazione di una sospensione batterica.

il raggio di luce che viene diretto sulla sospensione batterica

subisce una deviazione quando colpisce la parete cellulare.

Nella tecnica detta turbidometria si valuta l'intensità della

luce non deviata (luce trasmessa); nella tecnica detta

nefelometria si valuta l'intensità della luce deviata. Per le

determinazioni nel campo della crescita batterica si ricorre

quasi esclusivamente alle tecniche turbidometriche.

lampadina

reticolo di galvanometro

diffrazione campione

fessura filtro

di uscita fotocellula Rappresent

azione schematica dello spettrofotometro impiegato per determinare la torbidità di

una sospensione batterica. La luce bianca emessa da un filamento di tungsteno,

colpendo un reticolo di diffrazione produce uno spettro di fotoni di differente

lunghezza d'onda. Solo quei fotoni che passano attraverso la fessura di uscita

raggiungono il campione (modificando la fessura di uscita si può selezionare la

lunghezza d'onda desiderata). I fotoni che passano attraverso il campione vanno a

eccitare una fotocellula che è collegata a un galvanometro il quale misura

l'intensità luminosa. Quanto minore è la concentrazione cellulare del campione tanto

maggiore è la quantità di luce emessa e viceversa. (da Boyd, Microbiologia generale,

Medical Books).

Gli strumenti utilizzati per misurare la luce assorbita sono

detti fotometri o spettrofotometri. La teoria su cui si basa

27


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AUTORE

kalamaj

PUBBLICATO

+1 anno fa


DETTAGLI
Esame: Microbiologia
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in medicina e chirurgia (a ciclo unico - 6 anni)
SSD:
Università: Foggia - Unifg
A.A.: 2012-2013

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher kalamaj di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Microbiologia e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Foggia - Unifg o del prof Massa Salvatore.

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