Microbiologia - Terreni Coltura

ESAME BATTERIOLOGICO

Campionamento

L'analisi di un piccolo campione prelevato da una massa di grandi dimensioni ha senso soltanto se il campione è rappresentativo di tutta la massa e ne rispecchia quindi la composizione media. Nelle operazioni di prelievo dei campioni occorre quindi attenersi a norme che rispecchino il probabilismo del campionamento. Vi sono leggi, decreti e ordinanze ministeriali che stabiliscono le quantità da prelevare e il numero di contenitori di una stessa partita da saggiare (Es.: Legge 30 aprile 1962, numero 283; Ordinanza Ministeriale 11 ottobre 1978 G.U. n. 346 del 13/12/1978; Decreto Ministeriale 21 aprile 1986, G.U. n. 229 del 2/10/1986). Per maggiori dettagli fare riferimento ai capitoli sull'esame batteriologico dei singoli alimenti.

Prelievo

Questo paragrafo fornisce indicazioni generali, valide in laboratorio, sulle modalità di prelievo dell'aliquota da analizzare. Anche in questo caso, per maggiori dettagli, fare riferimento ai

ai tamponi, che vengono passati sulla superficie dell'alimento per raccogliere i batteri presenti. I risultati di questa analisi vengono espressi in UFC (unità formanti colonia) per unità di superficie (generalmente cm²). Per la carica batterica profonda, invece, si utilizzano spatole, pinze e forbici per prelevare un campione dell'alimento e analizzarlo. I risultati di questa analisi vengono espressi in UFC per unità di peso (generalmente grammi). È importante notare che prima di ogni prelievo di campione, tutti gli strumenti utilizzati devono essere sterilizzati per evitare contaminazioni. Una volta ottenuti i campioni, vengono trasferiti in contenitori sterili adeguati per l'esecuzione dell'analisi. I risultati dell'esame batteriologico dei singoli alimenti sono fondamentali per valutare la sicurezza e la qualità degli stessi, e vengono utilizzati per prendere decisioni riguardo alla loro commercializzazione e consumo.

All'uso di tamponi sterili, di apparecchi appositi che effettuano il lavaggio della superficie (l'esame viene condotto sul liquido di lavaggio) o al prelievo di una sottile striscia di alimento. Nel caso della carica batterica profonda occorre cauterizzare la superficie e mediante pinza e forbici sterili, prelevare la quantità di alimento necessaria all'analisi e trasferirla in contenitori sterili per l'omogeneizzazione. Tutte le operazioni suddette vanno condotte in condizioni di sterilità operando nei pressi della fiamma.

Omogeneizzazione

Con mixer

Sul mercato ne esistono numerosi modelli. Il prodotto è omogeneizzato finemente con lame multiple mosse da un motorino elettrico che impone loro un movimento rotativo molto rapido. Maggiore è la velocità, maggiore l'omogeneizzazione.

Con stomacher

Negli ultimi 10-15 anni si è diffuso l'utilizzo di strumenti che consentono l'utilizzo di buste di plastica in luogo dei contenitori di vetro.

L'apparecchio è dotato di due pale che, con moto alterno, schiacciano il contenuto dellabusta contro una parete. Metodo Pro Con trouso poco pratico, il coperchio e il vasetto devono garantire una ottima Mixer chiusura ermetica, omogeneizzazione, aumento (anche >5°C) economico, contenitori della temperatura del riutilizzabili contenuto omogeneizzazione non praticità d'uso, non sufficiente concè aumento della alimenti di Stomacher temperatura del consistenza duro- contenuto elastica, scarto di materiale plastico, costo iniziale elevato, costo delle buste di plastica elevato 12 Conteggio dei Esame batteriologico 13 microrganismi E13 Diluizione Poiché gli alimenti contengono enormi quantità di 6 10 batteri (10 -10 /g o ml) si rende necessaria la diluizione del campione per poter gestire numeri più piccoli (30-300/g o ml). La natura del diluente è fondamentale. Va scelto un liquido che assicuri una perfetta dispersione batterica e che non ne

inibisca lo sviluppo. Lo stesso liquido può essere utilizzato per favorire l'omogeneizzazione di alimenti solidi.

Acqua peptonata (con sistema tampone)

peptone ...........................g 20,0

NaCl ...........................g 5,0

Na PO ...........................g 9,042

K PO ...........................g 1,542

Allestimento delle diluizioni

Si ipotizzi di voler raggiungere la diluizione 1:10.000.0007 (cioè 1:10 ).

Necessario:

Pipette da ml 1,

Provette da batteriologia o flaconcini con ml 9 di diluente,

Acqua peptonata con sistema tampone

1. Se il campione non può essere analizzato entro un'ora dall'arrivo al laboratorio, va conservato a 0-5°C.

2. Omogeneizzare 15 grammi di alimento in 135 millilitri di acqua peptonata (diluizione finale 1:10) e lasciare riposare per 15 minuti per rivitalizzare i batteri. Attenzione: tempi superiori comportano la moltiplicazione dei batteri e i risultati non sono più attendibili. In acqua peptonata il tempo di latenza è

di circa 1 ora.

3. Trasferire 1 ml dall'omogeneizzatore alla prima provetta della serie; agitare accuratamente. Si è ottenuta una diluizione del materiale iniziale di 1:100. Proseguire fino alla 6 provetta (diluizione 1:10.000.000).

Semina

Per inclusione

1. Contrassegnare le piastre con matita vetrografica opennarello per vetro (data, n. del campione, tipo di terreno, diluizione).
2. Trasferire da ciascuna provetta 1 ml del contenuto in ciascuna piastra.

13Conteggio dei Esame batteriologico 14microrganismi

3. Versare in ogni piastra 10-15 ml di terreno allo stato liquido (≈45°C) e miscelare con movimenti di va e vieni perpendicolari e rotatori.
4. Lasciare solidificare l'agar.

14Conteggio dei Esame batteriologico 15microrganismi

In superficie

1. Trasferire da ciascuna provetta 0,1 ml del contenuto in piastre con terreno solido pronto all'uso.
2. Distribuire uniformemente sulla superficie del terreno con l'ausilio di bacchette di vetro o di plastica ricurve.

Lasciare assorbire.

Incubazione

L'ambiente in cui si pone il terreno è fondamentale affinché la coltivazione abbia successo. In particolare i parametri che è possibile variare sono la temperatura, la concentrazione di CO2, la disponibilità di ossigeno per gli anaerobi e sua eliminazione per gli anaerobi (per es. immettendo azoto inerte).

Le piastre vanno poste a incubare capovolte per evitare che eventuali tracce di condensazione formatesi sotto al coperchio cadano sul terreno.

Conteggio dei microrganismi

Seconda parte - MERCOLEDI Anno accademico .......Data ................... E16

CONTEGGIO DEI MICRORGANISMI NEGLI ALIMENTI

ESAME BATTERIOLOGICO

Lettura dei risultati

Sono considerate le piastre con un numero di colonie compreso tra 30 e 300.

M = n/V · F

dove: M = numero dei microrganismi/ml

n = numero di colonie cresciute

V = volume inoculato

F = fattore di diluizione

Se vengono utilizzate più piastre per ogni diluizione la formula

La formula è la seguente: M = (∑n/V · F)/x dove: M = numero dei microrganismi/ml ∑n = sommatoria del numero di colonie cresciute in tutte le piastre considerate V = volume inoculato F = fattore di diluizione x = numero in cui la stessa cifra (che corrisponde al numero delle piastre seminate per ciascuna diluizione) è ripetuta tante volte quante sono le piastre considerate (Es.: 3 piastre per ciascuna diluizione, 4 diluizioni: il numero è 3333). Di seguito vengono fornite le indicazioni dei terreni di batteriologia di coltura più comunemente impiegati in alimenti.

Conteggio dei microrganismi

Esame batteriologico 17

Carica microbica totale 17

Conteggio dei microrganismi

Esame batteriologico 18

microrganismi Enterobatteri E18

Conteggio dei microrganismi

Esame batteriologico 19

microrganismi E19

Conteggio dei microrganismi

Esame batteriologico 20

microrganismi E20

Conteggio dei microrganismi

Esame batteriologico 21

microrganismi E21

Conteggio dei microrganismi

Esame batteriologico 22

microrganismi E22

Conteggio dei microrganismi

23microrganismi Stafilococchi E2323Conteggio dei Esame batteriologico

24microrganismi E2424Conteggio dei Esame batteriologico

25microrganismi Enterococchi E2525Conteggio dei microrganismi. Metodi diversi

26 E26Seconda parte - MERCOLEDI Anno accademico ........Data ...................CONTEGGIO DEI MICRORGANISMI NEGLIALIMENTIMETODI DIVERSI DALL'ESAME BATTERIOLOGICO

Una sospensione batterica che appaia leggermente torbida aocchio nudo contiene approssimativamente 10 milioni di batteri7(10 ) per millilitro.

Conteggio cellulareMicroscopiaIl numero di microrganismi può essere stabilito perosservazione diretta al microscopio grazie all'impiego diparticolari camere di conteggio, ossia di vetrini portaoggettisu cui è impresso un reticolo costituito da una serie diquadratini il cui lato misura 50 i bordi del reticolo sonoµm.leggermente rialzati, in modo tale che, una volta deposta lagoccia della sospensione batterica in esame e ricoperto iltutto con un sottile

vetrino coprioggetto, l'altezza dellacamera, cioè la distanza tra la superficie del reticolo equella del coprioggetto, corrisponda esattamente a 20 Leµm.sole cellule batteriche che vengono contate sono quelle che siosservano all'interno dei vari quadratini del reticolo; ilnumero ottenuto viene rapportato al valore volumetrico dellacamera e, se il campione della sospensione batterica è statodiluito prima di essere stato esaminato, viene moltiplicato peril relativo fattore di diluizione. La camera di conteggio cheviene di solito impiegata in batteriologia è detta camera diPetroff-Häuser. Tale tecnica non consente di distinguere lecellule batteriche morte da quelle vive e fornisce quindivalori di conte totali.Camera di Petroff-Häuser per il conteggio delle cellule batteriche. Le dimensioni diciascuno dei quadratini che costituiscono il reticolo sono: 0,05 mm x 0,05 mm x 20µm; il volume corrisponde a 50.000 µm3. Il numero deibatteri contati sull'intera area del reticolo (quadrato grande) viene moltiplicato per il valore volumetrico e per il fattore di diluizione della sospensione batterica, qualora.