Microbiologia - Terreni Coltura

La coltivazione dei I terreni di coltura 1

batteri E1

Prima parte - LUNEDI Anno accademico ..........

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LA COLTIVAZIONE DEI BATTERI

I TERRENI DI COLTURA

La coltivazione dei batteri in laboratorio richiede

l'impiego dei cosiddetti "terreni" o "mezzi di coltura", con i

quali si cerca di riprodurre artificialmente un ambiente in

grado di soddisfare le esigenze metaboliche del microrganismo

che si desidera coltivare. Il terreno, prima della semina, deve

essere sterile e contenuto in recipienti sterili dotati di un

sistema di chiusura che garantisca la sterilità del contenuto.

Tutte le operazioni relative alla semina devono essere condotte

osservando precauzioni necessarie a evitare la contaminazione

del terreno ad opera dei batteri presenti nell'ambiente.

Gli impieghi dei terreni di coltura sono numerosi:

-) conteggio dei microrganismi che contaminano alimenti e

superfici;

-) isolamento dei microrganismi;

-) mantenimento in coltura;

-) identificazione e studio delle caratteristiche biochimiche;

-) coltivazione per la produzione di antibiotici, enzimi,

tossine, antisieri, vaccini, colture starter;

-) valutazione dell'attività di preparati farmacologicamente

attivi (per es.: antibiotici; ricerca sostanze inibenti).

Componenti dei terreni di coltura

I componenti dei terreni di coltura devono soddisfare le

esigenze nutritive dei microrganismi che per moltiplicarsi

hanno bisogno di fonti di idrogeno, carbonio, azoto, ossigeno,

sodio, magnesio, fosforo, zolfo, potassio, manganese, ferro. I

componenti dei terreni di coltura sono suddivisibili nelle

seguenti classi: peptoni, carboidrati, indicatori, sali

minerali, agenti selettivi, agenti solidificanti, ingredienti

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aggiuntivi . La composizione chimica dei terreni di coltura è

differente in relazione alle necessità nutrizionali della

specie che si desidera coltivare. Per la maggior parte dei

batteri è possibile allestire terreni di coltura sintetici, di

composizione definita, nei quali sono presenti, in quantità ben

definite, le singole sostanze di cui necessita il germe in

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Vengono anche chiamati "arricchimenti" traducendo dall'inglese la parola

"enrichment", tuttavia questo termine potrebbe venire confuso con "terreno

di arricchimento" che è invece un terreno estremamente povero di sostanze

nutritive. 1

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esame. Tuttavia, nella routine diagnostica si ricorre a terreni

complessi contenenti sostanze naturali chimicamente non ben

definite (peptoni, siero, sangue, estratto di lievito). Questi

terreni derivano dai tradizionali "brodi" e hanno il vantaggio

di essere economici e di garantire una maggiore rispondenza

alle esigenze dei batteri patogeni nel corso del loro

isolamento.

Peptoni

Le fonti di azoto possono derivare da alimenti quali

latte, uova, infusi di carne, patate, pomodori, anche se oramai

vi è una enorme disponibilità di prodotti industriali altamente

affidabili e che garantiscono un'elevata riproducibilità delle

loro caratteristiche fondamentali. Si tratta di idrolizzati di

proteine di origine biologica detti peptoni. I materiali di

base per la loro produzione sono la carne, la caseina, la soia,

le cellule di lievito, la gelatina. I peptoni sono costituiti

da amminoacidi liberi e polimerizzati in catene di lunghezza

variabile in rapporto al tipo di idrolisi subita. Comunemente

vengono impiegati due tipi di idrolisi: l'idrolisi enzimatica

(con enzimi quali la tripsina, la pepsina ed enzimi estratti

dalla papaia) e l'idrolisi acida (con acidi inorganici forti

quali l'acido cloridrico e l'acido solforico). Con l'idrolisi

enzimatica è possibile agire in punti precisi della proteina e

preservare l'integrità degli amminoacidi e delle vitamine

presenti nel materiale di partenza; con l'idrolisi acida

vengono rotti tutti i legami peptidici e si producono

amminoacidi liberi.

Simili ai peptoni sono gli infusi e gli estratti di carne

ottenuti per coagulazione delle proteine con il calore.

Carboidrati

Gli zuccheri costituiscono un elemento nutritivo

fondamentale. Sono fonte di carbonio e vengono utilizzati anche

come substrati fermentabili per la differenziazione dei

microrganismi. I più utilizzati sono il glucosio, il lattosio,

il mannitolo e il saccarosio.

Indicatori

In microbiologia ve ne sono fondamentalmente tre tipi:

indicatori di pH, di ossidoriduzione e di idrogeno solforato.

Tra gli indicatori di pH vanno ricordati il rosso fenolo,

il rosso neutro, il blu di bromotimolo e il porpora di

bromocresolo (c.d. bromocresol-porpora). Il tornasole e

l'indicatore di Andrade sono in disuso, ma in certe

formulazioni sono ancora presenti. Gli indicatori di pH hanno

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lo scopo di evidenziare la formazione di acidi a partire dai

carboidrati e la formazione di basi (ioni ammonio) a partire da

peptoni, singoli amminoacidi o ammine. Tra questi, il rosso

fenolo è il più sensibile in quanto reagisce anche a minime

variazioni di pH nel terreno. Il rosso neutro trova impiego nei

terreni per l'evidenziazione degli enterobatteri (per es.:

terreno di Mac Conkey).

Gli indicatori di ossidoriduzione più utilizzati sono il

blu di metilene (da incolore a blu, se ossidato) e la

resazzurrina (da incolore a rosa, se ossidata).

Gli indicatori di H S, sono costituiti da sali di ferro

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(citrato ferrico, solfato ferroso, ferro ammonio solfato, ferro

ammonio citrato). L'idrogeno solforato, prodotto dai batteri a

partire da sodio tiosolfato, reagisce con i sali di ferro dando

luogo a ferro solfuro nero. Questa reazione è sfruttata sia nei

terreni di coltura solidi (caratteristiche colonie con parte

centrale nera), che in quelli liquidi ponendo cartine imbevute

di acetato di piombo all'estremità delle provette (l'acetato di

piombo viene trasformato dall'idrogeno solforato in solfuro di

piombo, nero).

Sali

Hanno tre funzioni fondamentali: fornire i metalli

necessari alla crescita microbica (Mg, Mn, Fe, Ca, Zn, Cu),

fornire un'azione tampone al terreno (KH PO e K HPO ) e

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mantenere una adeguata osmolarità al mezzo di coltura (con il

NaCl).

Agenti selettivi

Gli agenti selettivi consentono l'isolamento di una specie

batterica inibendo le altre. I primi agenti selettivi

utilizzati in microbiologia sono stati i coloranti, che ancora

oggi vengono inseriti in molte preparazioni. I più noti sono il

cristalvioletto e il verde brillante, impiegati in alcuni

terreni per enterobatteri. Tra le sostanze di origine biologica

vanno ricordati i sali biliari che trovano impiego nei terreni

per l'isolamento dei patogeni intestinali, avendo la capacità

di inibire la crescita dei Gram negativi. Altri agenti

selettivi sono gli antibiotici, che permettono di selezionare

in maniera mirata le specie microbiche da isolare. Infine, i

sali organici e inorganici: tra gli altri vanno citati il

cloruro di sodio (che ad alte concentrazioni inibisce sia la

flora Gram negativa che quella Gram positiva, eccezion fatta

per gli stafilococchi), la sodio azide (che consente

l'isolamento selettivo di streptococchi e di enterococchi), il

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sodio selenito, il sodio citrato, il sodio tellurito e il

trifenil tetrazolio cloruro.

Agenti solidificanti

L'agar-agar è l'ingrediente fondamentale per la

preparazione della quasi totalità dei terreni solidi. Fu

introdotto alla fine del 1800 da un medico tedesco (Walther

Hesse) e il suo utilizzo venne poi perfezionato da Robert Koch.

Gelidum

È una sostanza estratta dalle alghe rosse del genere ,

frequenti nei mari tropicali, e ha una struttura

polisaccaridica contenente agarosio (70%) e agaropectina (30%).

L'agar disciolto a caldo (temperature superiori a 80°C) in un

liquido, nella proporzione dell'1-2%, ne provoca la

gelificazione durante il raffreddamento.

agar solubilizzato gel

→

Liquido + agar → 80°C-45°C <45°C

L'agar solubilizzato ha la caratteristica di fondere a 100°C e,

raffreddandosi, di solidificare (quando la temperatura è

inferiore a 45°C). Allo stato solido forma una massa gelatinosa

polimerizzata che non viene utilizzata dai batteri a scopo

nutritivo. L'agar non è tossico per i batteri e solo pochissimi

possiedono enzimi (esoenzimi) in grado di attaccarlo

(depolimerizzarlo), liquefacendo il terreno. La superficie di

un terreno gelificato con l'1-2% di agar è sufficientemente

solida da consentire di operarvi agevolmente, e con umidità

tale da consentire la crescita dei batteri ma da non

permetterne il movimento (nel caso di batteri provvisti di

Proteus spp

flagelli, anche se certi germi, quali ., riescono a

migrare anche in agar all'1-2%). Vi sono alcuni terreni per la

valutazione della mobilità che contengono minori concentrazioni

di agar (0,2-0,5%). Il reticolo tridimensionale del gel lascia

passare le macromolecole ma, in genere, non permette che

batteri seminati in superficie riescano ad approfondarsi tra le

maglie. La caratteristica dell'agar di rimanere liquido (o

meglio "la caratteristica del liquido in cui l'agar è disciolto

di non trasformarsi in gel") fino a temperature di 45°C e

quella dei batteri di sopportare brevi esposizioni a queste

temperature (45-50°C) è alla base di un metodo di semina

cosiddetto "agar batteri" (detto anche "semina per inclusione"

o "per incorporazione" o "per dispersione"). Si tratta di

disperdere i batteri nel terreno ancora liquido. In conseguenza

della gelificazione che accompagna il raffreddamento, i singoli

batteri restano inglobati nelle maglie del gel dove possono

moltiplicarsi senza possibilità di diffusione. Questo tipo di

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coltura è utilizzato per l'enumerazione dei batteri presenti

negli alimenti.

Ingredienti aggiuntivi

Per migliorare le caratteristiche di fertilità dei terreni

di coltura e per la coltivazione di microrganismi esigenti si

aggiungono, dopo sterilizzazione in autoclave e raffreddamento

a 45-50°C, diversi ingredienti. Il sangue e il siero sono

quelli più comunemente impiegati, ma in rapporto al tipo di

ricerca da eseguire si ricorre anche all'emoglobina,

all'albumina, al rosso d'uovo e a uova intere. 5

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Classificazione dei terreni di coltura

In rapporto allo stato fisico

I terreni di coltura si distinguono in liquidi e solidi,

differenziandosi esclusivamente per lo stato fisico.

Terreni liquidi- Il più diffuso era il brodo di carne. Si

tratta di un terreno utile per la pratica corrente in quanto

consente lo sviluppo di quasi tutti i batteri, la sua

composizione esatta non è nota, né ripetibile (oggi è

sostituito dai vari brodi nutritivi a formulazione nota).

Anche il latte e l'acqua peptonata sono utili in certe

occasioni (diluizioni, prearricchimento, crescita di batteri

lattici).

Terreni solidi- I più antichi sono il siero di sangue coagulato

e la patata (patata glicerinata per i micobatteri). Oggi si

ricorre all'aggiunta dell'agar. I terreni solidi sono

indispensabili per l'isolamento di colture batteriche pure.

In rapporto alla costituzione chimica

Terreni minimi: servono alla coltivazione di stipiti auxotrofi

per determinate sostanze. Si tratta di terreni in cui il

fattore limitante la crescita batterica è aggiunto in

quantità minime. (Es. Minimal Glucose Medium per gli stipiti

auxotrofi per l'istidina del "Test di Ames").

Terreni comuni o normali: servono alla coltivazione di batteri

senza particolari esigenze nutritive (Es. "brodo normale", o

"brodo semplice"; "brodo normale solidificato con agar" o

"agar semplice"). Di uso comune sono il "brodo nutritivo" e

l'"agar nutritivo". Contengono peptoni, (0,5%); estratto di

carne, NaCl e tampone fosfato (pH ~ 7,0).

Terreni sintetici: la costituzione è nota in quanto i singoli

costituenti (organici e inorganici) sono stati aggiunti

nelle quantità volute. Si utilizzano quando si conoscono

tutti i fattori di crescita del germe in esame. Si possono

quindi allestire dei terreni che contengono soltanto le

sostanze di cui il germe necessit