Spettroscopia ottica biomedica

Interazione tra fluorofori e fenomeno della FRET

Entrambi i fluorofori presentano un particolare spettro di emissione e di eccitazione, nonché uno Stokes shift, che fa sì che tali molecole, prese singolarmente, vengano preferenzialmente eccitate da una lunghezza d'onda (l'una diversa dall'altra) ed emettano fluorescenza ad una certa lunghezza d'onda (l'una diversa dall'altra).

Tuttavia, nel caso in cui i due fluorofori risultino molto vicini (ad una distanza inferiore ai 10nm), all'eccitazione del donatore corrisponderà un'emissione non da parte dello stesso donatore, ma dell'accettore, a causa di un trasferimento di energia in modo non radiativo, noto come fenomeno della FRET (Forster Resonance Energy Transfer), dal donatore all'accettore. Successivamente, l'accettore ritorna al suo stato elettronico fondamentale per fluorescenza.

L'efficienza della FRET dipende dalla distanza tra i due fluorofori. Di conseguenza, avremo che la fluorescenza dell'accettore sarà tanto più evidente quanto più le due molecole saranno vicine tra loro.

molecole sono vicine (graficamente l'efficienza in rapporto al parametro "distanza tra fluorofori" è descritto da una sigmoide); l'efficienza dipende tuttavia anche dai fattori "integrale di sovrapposizione" (tale fattore misura il grado di sovrapposizione tra lo spettro di emissione del donatore e lo spettro di emissione dell'accettore, ai fini di un'efficiente FRET la sovrapposizione necessita di essere massima), "orientazione reciproca" (questo fattore misura il grado di parallelismo tra i dipoli dei 2 fluorofori coinvolti nella FRET ed è massimo quando questi sono perfettamente paralleli mentre minimo quando sono perpendicolari, ai fini di un'efficiente FRET l'orientazione reciproca deve essere massima), indice di rifrazione del mezzo nella quale avviene il fenomeno (tale indice di rifrazione necessita di essere il più piccolo possibile al fine di un'efficiente FRET) e dalla resa quantica del

donatore (tanto maggiore è questo valore, tanto più efficiente è la FRET).

La FRET è molto utilizzata in diversi ambiti della biologia per lo studio dell'interazione tra molecole (se le molecole coinvolte sono legate rispettivamente a donatore ed accettore, nel caso vi sia un loro legame si osserva emissione dell'accettore a seguito di un'eccitazione del donatore) o per lo studio dei cambiamenti della struttura secondaria e terziaria di una proteina (se la proteina, legata ai 2 fluorofori vicini tra di essi, subisce una denaturazione o un cambiamento conformazionale tale per cui i 2 fluorofori si allontano, non si osserva FRET).

La FRET fu usata ad esempio per lo studio del funzionamento dell'ATP-sintasi; in tale occasione si legò un donatore ad una subunità fissa del complesso enzimatico mentre si legò un accettore ad una subunità mobile (rotante) del complesso e ciò che si osservò fu il

susseguirsi si valori di FRET bassi, medi e alti nel tempo (ciò indica che la subunità mobile effettivamente ruota avvicinando e allontanando nel tempo l'accettore dal donatore).

Capitolo 6 - La microscopia di fluorescenza

Le tecniche che vengono descritte in tale capitolo consistono essenzialmente in tecniche di microscopia che consentono attraverso la fluorescenza di ottenere delle informazioni riguardanti la chimica del campione d'analisi.

La microscopia di fluorescenza convenzionale (microscopia di epifluorescenza)

Questa microscopia coincide essenzialmente con la microscopia ottica convenzionale, ma prevede la trattazione del campione con dei fluorofori così da poterli eccitare ed osservare. La tecnica prevede lo sfruttamento di un anticorpo primario per il riconoscimento dell'antigene di interesse e di un anticorpo secondario marcato (con il fluoroforo) capace di riconoscere l'anticorpo primario in modo da permettere la percezione.

dell’antigene nel campione; il campione posto sul vetrino verrà illuminato da una luce monocromatica (la cui lunghezza d’onda corrisponderà al massimo d’assorbimento del fluoroforo) derivata da un laser o da una sorgente di luce continua su cui viene applicato un apposito filtro così da poter osservare la luce emessa dal fluoroforo.

Questa tecnica permette l’utilizzo di anticorpi primari, secondari e fluorofori diversi così da poter osservare più antigeni in sequenza all’interno del campione (in sequenza in quanto prima potrò osservare la fluorescenza data un fluoroforo legante un antigene, mentre poi cambiando la lunghezza d’onda della sorgente posso eccitare un secondo fluoroforo così da osservarne l’emissione); osservate tutte le diverse fluorescenze si può anche procedere ricreando un’immagine complessiva mediante la sovrapposizione delle diverse fluorescenze.

Microscopia di fluorescenza

Questa variante della microscopia di fluorescenza classica ha il pregio di permettere l'ottenimento di un'immagine maggiormente nitida (migliore risoluzione). Nella microscopia di fluorescenza confocale, a differenza della classica, non tutta la luce derivata dai diversi piani illuminati del campione raggiunge l'occhio dell'osservatore; la luce che raggiunge l'osservatore è solo quella del piano confocale (il piano a fuoco) e pertanto l'osservatore vedrà solamente la luce proveniente da una sezione del campione. A livello strumentale la differenza di questa microscopia rispetto alla precedente consiste nella presenza di un "pinhole" (ossia un foro) su di una superficie che non permette il passaggio della luce; tale superficie viene posizionata prima del detector e permette solamente alla luce derivante dal piano focale di raggiungere nella sua interezza il detector (la luce proveniente da altri piani non riesce a passare tutta).

attraverso il pinhole, quindi la gran parte di essa viene schermata). Dato che luci a lunghezze d'onda diverse avranno punti focali diversi, più monocromatica è la luce utilizzata per l'eccitazione del fluoroforo, maggiore sarà la nitidezza dell'immagine ottenuta (è pertanto solitamente utilizzato un laser per l'eccitazione del fluoroforo). La microscopia di fluorescenza a due fotoni (microscopia 2PEF) si basa essenzialmente sull'eccitazione del fluoroforo non attraverso un singolo fotone ad una determinata lunghezza d'onda, ma attraverso due fotoni a lunghezza d'onda doppia (fotoni meno energetici). In quanto se tali fotoni vengono assorbiti contemporaneamente dalla molecola di fluoroforo (ciò accade con poca probabilità), questa comunque passa dallo stato S0 a S1 per poi poter emettere una fluorescenza. Dato che la probabilità che il singolo fluoroforo assorba contemporaneamente due fotoni è molto bassa, la microscopia 2PEF permette di ottenere immagini con una risoluzione spaziale migliore rispetto alla microscopia a fluorescenza convenzionale.è molto bassa, avremo che non tutti i fluorofori presenti nel campione emetteranno fluorescenza se illuminati dalla luce monocromatica utilizzata; emetteranno fluorescenza solamente quei fluorofori del campione che si trovano nella posizione del campione dove la concentrazione di fotoni è sufficientemente elevata da permettere alla molecola di assorbire contemporaneamente due fotoni (essenzialmente solo i fluorofori che si trovano a livello del piano focale saranno capaci di assorbire due fotoni contemporaneamente e di emettere fluorescenza). Siccome solamente i fluorofori a livello del piano focale potranno assorbire contemporaneamente due fotoni ed emettere fluorescenza, tale microscopia è intrinsecamente confocale (permette di ottenere delle immagini con una nitidezza anche superiore alla microscopia di fluorescenza confocale) e dato che permette l'utilizzo di luce a lunghezza d'onda superiore rispetto a quella necessaria per l'eccitazione del.fluoroforo (eccitazione a singolo fotone) è dotata di un minor rischio di difotodegradazione del campione (minor rischio di rovinare il campione). La microscopia FRET Questa microscopia consiste essenzialmente in una microscopia di fluorescenza classica o confocale che tuttavia prevede l'utilizzo di un campione trattato con il fluoroforo donatore e il fluoroforo accettore; il campione viene pertanto sottoposto a una microscopia di fluorescenza in modo da capire se è avvenuto o meno il fenomeno della FRET. La microscopia FLIM Questa microscopia sfrutta la proprietà dei fluorofori nota come "tempo di vita di fluorescenza" come mezzo di contrasto per evidenziare le diverse porzioni del campione d'analisi (nel caso si utilizzino più fluorofori o si studi la fluorescenza intrinseca del campione); per effettuare l'analisi sono richiesti degli strumenti piuttosto costosi in quanto devono essere provvisti di detector che rilevano il.

cambiamento dell'intensità di fluorescenza del fluoroforo in decine di nanosecondi. Questa tecnica permette di osservare le diverse porzioni (o zone) di un campione in quanto il tempo di vita di un fluoroforo è influenzato dal suo intorno chimico e quindi dall'ambiente circostante che può variare all'interno di un campione.

Il limite di diffrazione e la risoluzione spaziale. Andando ad effettuare l'osservazione di una singola molecola di fluoroforo attraverso un'indagine molto accurata, contro-intuitivamente a quanto ci si potrebbe aspettare non si osserva un unico punto fluorescente ma si osserva attorno ad esso anche una serie di cerchi di luce concentrici di intensità decrescente (questo viene detto pattern di Airy) in quanto la luce non è solamente una particella ma è anche un'onda. Il pattern di Airy è dovuto essenzialmente al fatto che la sorgente luminosa utilizzata per l'analisi emette dei fotoni in

tutte ledirezioni che incontreranno un obbiettivo everranno variamente deviati; alcuni dei fotoniviaggiando si incontrano generando un’interferenzacostruttiva (in quanto le loro onde risulteranno infase) mentre altri un’interferenza distruttiva edessenzialmente il punto luminoso centrale delfluoroforo così come i cerchi luminosi concentrici 37saranno i punti in cui l’interferenza delle onde è costruttiva (massimamente costruttiva nel punto centrale)mentre i cerchi non luminosi sono i punti in cui l’interferenza delle onde è massimamente distruttiva.L’”apertura numerica” è quella caratteristica dell’obbiettivo che impatta molto sul pattern di Airy (tantomaggiore è il valore di apertura numerica tanto meglio riesco a discriminare i fluorofori, ma tuttavia tantomeglio distinguo i cerchi concentrici attorno al singolo fluoroforo); questa caratteristica è calcolabile come:Data la formula

dell’apertura numerica (NA), avremo che maggiore sarà l’angolo tra la sorgente e le estremità dell’o.