Spettroscopia ottica biomedica

Appunti di spettroscopia ottica biomedica

Capitolo 1 – Introduzione alla spettroscopia

La misura e lo studio di uno spettro è chiamato spettroscopia. La spettroscopia si prefigge come fine ultimo quello di raccogliere informazioni sulla materia attraverso la comprensione dell’interazione tra radiazione e materia stessa (lo studio del contenuto di una couvet attraverso la sua interazione con un fascio laser è un esempio di spettroscopia) più che quello di cambiare la materia (questo è ciò che succede, ad esempio, in un forno a microonde).

La luce

Storicamente la prima persona che si interessò allo studio della luce (radiazione elettromagnetica) fu Isaac Newton; egli si dedicò alla decomposizione dei colori della luce solare attraverso l’utilizzo di un prisma, una fonte luminosa ed una parete bianca. Si accorse che il raggio di luce passando attraverso il prisma veniva scomposto in componenti di diverso colore proiettate sulla parete bianca. Successivamente alla scoperta dei colori che compongono la luce (i sette colori primari che non possono venir modificati da ulteriori rifrazioni) si accorse che mescolando i raggi colorati generati da un prisma si poteva ottenere per loro fusione il “candore” (nel caso in cui venissero mescolati nella giusta proporzione).

La luce come onda elettromagnetica

Attraverso i suoi esperimenti, Newton iniziò lo studio della luce ma non dette mai una risposta sulla natura della luce; la natura della luce inizialmente si pensò essere quella di un’onda elettromagnetica (teoria elettromagnetica classica di Maxwell) che consiste essenzialmente in una manifestazione di campi magnetici ed elettrici associati. La luce come onda elettromagnetica è costituita da un’onda elettrica ed una magnetica presenti su due piani perpendicolari tra loro.

• Lunghezza d’onda (indicata con λ); la lunghezza d’onda della luce è molto varia e a seconda di questa possiamo distinguere diverse tipologie di luce (la luce visibile possiede una lunghezza d’onda che va dai 400 ai 700nm, le onde radio hanno lunghezze d’onda nell’ordine dei 10⁻⁹ m mentre i raggi gamma possiedono lunghezze d’onda nell’ordine 10⁻¹⁵ m).
• Velocità di propagazione nel vuoto (indicata con c); questa velocità è costante e corrisponde a circa 300.000 km/s.
• Frequenza (indicata con ν); essa viene misurata in Hertz (s⁻¹) e corrisponde al numero di creste dell’onda per unità di secondo ed è calcolabile come c/ λ (dato che c, ossia la velocità della luce nel vuoto, è una costante, è possibile dedurre che la lunghezza d’onda e la frequenza siano inversamente proporzionali).
• Numero d'onda; esso consiste nel numero di oscillazioni di un'onda nell'unità di lunghezza (misurabile in cm⁻¹) e corrisponde quindi al reciproco della lunghezza d'onda (1/ λ).
• Energia (indicata con E); l’energia della luce è data dal prodotto della costante di Planck (indicata con h) e della frequenza secondo la legge di Planck.

Siccome la luce possiede dell’energia (direttamente proporzionale alla frequenza) talvolta essa può venir definita come “energia viaggiante”; essendo l’energia dell’onda direttamente proporzionale alla sua frequenza, i raggi X o γ possiedono un’energia molto elevata (sono molto pericolosi) mentre le onde radio possiedono un’energia molto ridotta (sono poco pericolose). Ad oggi, l’energia posseduta dall’onda rappresentata dalla luce viene sfruttata dai pannelli fotovoltaici.

La luce visibile è data dall’insieme di più onde che nel complesso possono avere lo stesso colore (si parla di luce monocromatica) o colori diversi (si parla di luce policromatica) e i singoli colori sono dati da onde elettromagnetiche con lunghezza d’onda diversa. Le onde che formano la luce possono venir distinte in collimated o non collimated (quest’ultime possono essere divergenti o convergenti) a seconda che esse si propaghino lungo direzioni parallele o non parallele; le onde possono venir distinte anche in coerenti e non coerenti a seconda che le loro creste e valli risultino o meno in fase oppure in polarizzate e non polarizzate a seconda che vibrino o meno tutte sullo stesso piano elettrico (normalmente la luce giunge ai nostri occhi come non polarizzata, tuttavia esistono dei filtri polarizzatori che convertono la luce non polarizzata in polarizzata). La luce può giungere ai nostri occhi, tuttavia, anche come polarizzata a seguito di un evento di riflessione (ad esempio su di una superficie acquosa) in quanto il contatto con una superficie polarizza il fascio luminoso parallelamente alla superficie (le lenti polarizzate hanno lo scopo di minimizzare la quantità di luce polarizzata che raggiunge i nostri occhi).

L'esperimento di Young

La natura ondulatoria della luce fu confermata dall’esperimento di Young, realizzato da Thomas Young nel 1801; esso permette anche la comprensione dei fenomeni di interferenza che si possono avere in presenza di più onde. Il fenomeno dell'interferenza è un fenomeno dovuto alla sovrapposizione, in un punto dello spazio, di due o più onde e quello che risulta possibile osservare è che l'intensità (o ampiezza) dell'onda risultante in quel punto può essere diversa rispetto alla somma delle intensità associate ad ogni singola onda di partenza (in particolare, essa può variare tra un minimo, in corrispondenza del quale non si osserva alcun fenomeno ondulatorio, ed un massimo che in generale non coincide con la somma delle intensità); in generale si dice che l'interferenza è costruttiva quando l'intensità risultante è maggiore rispetto a quella di ogni singola intensità originaria (si ha nel caso in cui creste delle diverse onde coincidano) e distruttiva in caso contrario (quando le creste non coincidono).

Nell’esperimento di Young avremo una singola sorgente luminosa che illumina una parete presentante due fenditure attraverso cui possono passare dei fasci di luce (le fenditure si comportano esse stesse come sorgenti luminose) che genereranno su di uno schermo retrostante delle bande alternatamente scure e luminose (scure dove si ha interferenza distruttiva e luminose dove si ha interferenza costruttiva).

La luce come particella

La luce oltre a possedere una natura ondulatoria possiede una natura particellare; la natura particellare della luce fu compresa indirettamente a causa dell’effetto fotoelettrico. L’effetto fotoelettrico fu descritto chiaramente per la prima volta da Albert Einstein anche se esso veniva già da tempo sfruttato per la rilevazione della luce mediante fotometro. Secondo tale effetto una superficie metallica se irradiata da una radiazione elettromagnetica (ossia irradiata da fotoni aventi una certa lunghezza d'onda) emette degli elettroni rilevabili.

Dualismo onda particella

Secondo quanto detto in precedenza, la luce consiste sia in un’onda che in una particella dati i risultati dell’esperimento di Young e le deduzioni effettuate sulla base dell’effetto fotoelettrico. La conferma sulla doppia natura della luce fu data dalla stesura di un esperimento di Young modificato in quanto prevedeva lo sfruttamento di fasci corpuscolari di luce; da questo esperimento si osservò che ogni singolo fotone si portava sullo schermo (utilizzato nell’esperimento di Young) delineando le bande di diversa intensità osservabili nel normale esperimento di Young. I fotoni pertanto in questo esperimento colpiscono lo schermo retrostante le fenditure in diversi punti distribuendosi secondo probabilità. Il dualismo onda particella è alla base della meccanica quantistica e la natura della luce “dipende dall’osservatore” (a seconda dello studio effettuato sulla luce questa occorrerà che venga considerata come particella oppure come onda).

La doppia natura della luce è condivisa anche dall’elettrone e dalla materia in generale (oggetti molto pesanti possiedono lunghezze d’onda molto piccole mentre oggetti molto piccoli, come un elettrone, hanno lunghezze d’onda vicine alle dimensioni dell’oggetto); De Broglie chiamò le onde associate alle particelle materiali “onde materiali”. Risulta comunque importante sottolineare che solamente quando le lunghezze d’onda sono confrontabili con le dimensioni dell’oggetto (elettrone ad esempio) ha senso parlare di dualismo onda-particella e quindi in altre parole, ciò ha scarso significato per oggetti di grandi dimensioni in quanto le lunghezze d’onda risultano troppo piccole per essere misurate (per gli oggetti macroscopici sono più adatte le leggi della fisica classica).

La materia

Come detto in precedenza, la spettroscopia si interessa di ottenere informazioni dalla materia attraverso lo studio della sua iterazione con la radiazione elettromagnetica (luce). In fisica classica con il termine materia si indica genericamente qualsiasi oggetto che abbia massa e che occupi spazio oppure, alternativamente, la sostanza di cui gli oggetti fisici sono composti, escludendo quindi l'energia. La materia è composta da delle molecole che sono a loro volta costituite da atomi e può ritrovarsi sotto forma di quattro diversi stati a seconda delle sue proprietà meccaniche:

• Solido (con forma e volume definito); in questo stato i costituenti della materia sono legati da forze molto intense che consentono loro soltanto moti di vibrazione e nella maggior parte dei casi le molecole che la costituiscono si distribuiscono secondo un reticolo cristallino o in maniera amorfa.
• Liquido (ha un volume proprio ma non una forma propria); in questo stato le forze tra i componenti della materia sono meno intense ed essi sono liberi di scorrere gli uni sugli altri.
• Gassoso (non ha né volume né forma propria ma la materia si espande fino a occupare tutto lo spazio disponibile); in questo stato le interazioni sono estremamente deboli ed ai costituenti è consentito muoversi indipendentemente.
• Plasma (assomiglia ad un gas non avendo forma propria e può anche espandersi come un gas dal quale si distingue però per la sua ionizzazione); è costituito da un insieme di elettroni e ioni globalmente neutro.

Nella spettroscopia gli stati di interesse per lo studio della materia corrispondono essenzialmente a quello solido e liquido in quanto nell’ambito della biologia la gran parte dei campioni sono di questa tipologia.

La spettroscopia atomica di emissione e di assorbimento

La spettroscopia di emissione atomica è una tecnica spettroscopica di emissione utilizzata in analisi chimica che sfrutta la somministrazione di energia relativamente elevata alla materia così da provocarne la dissociazione in atomi e l'eccitazione di questi ultimi. In base alla lunghezza d'onda emessa è possibile risalire alla specie incognita, dato che gli spettri di ciascuna sostanza sono caratteristici, mentre misurando l'intensità dell'emissione si può effettuare l'analisi quantitativa. Mediante l’utilizzo di questa tecnica è possibile quindi comprendere quali siano i diversi elementi costituenti il campione di analisi ed effettuare una loro quantificazione; ad esempio, attraverso questa tecnica è possibile, andando a conferire energia all’idrogeno contenuto in una lampada, scomporre (mediante un prisma) la luce emessa così da osservare le sue componenti mediante l’analisi dello spettro d’emissione (nel caso dell’idrogeno si ottengono quattro diverse bande ben separate a differenza della luce bianca attraverso cui si ottiene un insieme di colori continui).

Il principio su cui si basa la tecnica consiste nel fatto che ogni elemento possiederà uno spettro di emissione caratteristico, ossia presenterà una o più bande emesse caratteristiche unicamente dell’elemento stesso (ciò permette di determinare precisamente la composizione della materia target). Una tecnica alternativa a quella precedentemente descritta per lo studio della materia consiste nella spettroscopia atomica di assorbimento che risulta tuttavia molto simile a quella precedentemente descritta. In questa tecnica è previsto l’utilizzo di una fonte di luce bianca (policromatica) che viene indirizzata contro il campione di interesse che ne assorbirà una certa lunghezza d’onda ma lascerà filtrare il resto della luce che passando attraverso un prisma verrà scomposta in modo da ottenere uno spettro detto di emissione (lo spettro di emissione di un elemento corrisponderà al reciproco dello spettro di assorbimento, ma entrambi permetteranno di comprendere con quale elemento si ha a che fare).

Un esempio di linee di assorbimento è dato dalle linee di Fraunhofer che rappresentano un insieme di linee spettrali originariamente osservate come linee in assorbimento nello spettro ottico del Sole. Le linee di emissione così come quelle di assorbimento possono venir rappresentate come picchi su di un grafico presentante sull’asse X la lunghezza d’onda della radiazione e sull’asse Y la sua intensità che rappresenta un quantitativo di fotoni. Secondo l’ipotesi di Planck infatti la radiazione elettromagnetica risulta discreta in quanto viene trasmessa in “pacchetti discreti” corrispondenti ai singoli fotoni, quindi le intensità dovranno essere necessariamente rappresentate da un quantitativo intero di fotoni.

La struttura quantistica della materia

Una delle manifestazioni della quantizzazione è possibile averla studiando il passaggio di un elettrone di un elemento da uno stato energetico superiore ad uno inferiore, in quanto l’elettrone può passare da un livello superiore a quello inferiore ma non ad un quantitativo di energia intermedio tra i due livelli. Normalmente gli elettroni che costituiscono gli atomi ruotano attorno ad un nucleo all’interno di un’area molto grande di cui una sua parte viene detta orbitale atomico (consiste nell’area attorno al nucleo in cui complessivamente si ha il 90% di probabilità di ritrovare l’elettrone); esistono diverse tipologie (s, p, d) di orbitali, differenti tra loro per il diverso livello di energia a cui sono associate anche se all’interno di ogni tipologia possono sussistere più orbitali. Gli elettroni dei diversi atomi si dispongono all’interno di questi orbitali a partire da quello ad energia più bassa, ossia 1s, secondo il principio di Aufbau e tenendo sempre conto del principio di Pauli secondo cui ogni orbitale può contenere al massimo due elettroni.

L’energia associata al singolo elettrone di un atomo risulta quantizzata in quanto essa dipende da un numero quantico (n) intero positivo, dalla massa dell’elettrone (costante) e dalla costante di Planck (h). Facendo riferimento alla formula, avrò quindi che se un elettrone effettua un passaggio da un numero quantico 3 ad un numero quantico 2 (effettua un salto quantico) perde dell’energia che verrà emessa sotto forma di radiazione elettromagnetica (luce), in quanto posso calcolare una frequenza andando a sottrarre l’energia associata al livello 2 a quella associata al livello 3 tenendo conto della legge di Planck; la frequenza calcolata potrà poi venir trasformata in lunghezza d’onda della luce emessa dall’atomo. Effettuando l’analisi partendo da un atomo di idrogeno otterrò una lunghezza d’onda di 656nm ossia proprio una delle lunghezze d’onda alla quale emette l’idrogeno in seguito ad eccitazione. Le altre tre lunghezze d’onda a cui emette l’idrogeno se eccitato (e di conseguenza le altre linee di emissione) saranno calcolabili mediante l’analisi del passaggio dell’elettrone dai numeri quantici 4, 5 e 6 a 2 (la materia a livello atomico è per tanto un sistema che possiede energie quantizzate in quanto osserviamo le transizioni nette tra stati elettronici).

Energia ed orbitali delle molecole

Gli orbitali possono risultare di due diverse tipologie, ossia atomici o molecolari. Gli orbitali descritti precedentemente corrispondono a degli orbitali atomici, tuttavia gli orbitali possono risultare anche molecolari nel caso in cui non si faccia riferimento a singoli atomi ma a molecole composte da diversi atomi (proteine, zuccheri, etc). Gli orbitali molecolari sono simili a quelli atomici (risultano quantizzati energicamente e le regole per il riempimento degli orbitali molecolari sono le stesse di quelle per il riempimento degli orbitali atomici, ossia principio di Pauli e di Aufbau) ma possiedono alcune differenze in quanto descrivono le caratteristiche degli elettroni che ruotano attorno al nucleo degli atomi che costituiscono la molecola.

Una delle teorie relative al legame chimico nelle molecole è la teoria dell’orbitale molecolare che aiuta a comprendere come sia costituito l’orbitale molecolare. Attraverso questa teoria è possibile studiare i legami all’interno di molecole come ad esempio l’idrogeno (H₂). Nel caso dell’idrogeno avrò due elettroni di partenza (ognuno proveniente da un singolo H) allo stesso livello energetico che potranno dar luogo ad un orbitale molecolare legante (ad energia ovviamente più bassa) o ad un orbitale molecolare antilegante (ad energia superiore) a seconda che le singole funzioni d’onda associate ai due elettroni interferiscano costruttivamente o distruttivamente (se costruttivamente avrò un orbitale molecolare legante con densità elettronica non nulla tra i due nuclei di H).