Inibizione enzimatica e Enzimologia, Biochimica

L'albumina è stata anche utilizzata per il trasporto di farmaci (l'albumina è un farmaco di per sé),

come nel caso del tassolo, un importante antitumorale che lega l'albumina; perché? non sarebbe

tollerato dall'epitelio gastrico o esofageo (per os), invece per endovena risulterebbe insolubile,

formando trombi; la soluzione è quindi di coniugarlo all'albumina, che rilascia nel circolo il farmaco:

migliora quindi la farmacocinetica e la farmacodinamica.

Vediamo una seconda struttura, sempre fascio a quattro alfaeliche, la ferritina, un polimero

costituito da 24 subunità, ognuna costituente un dominio strutturale a 4 alfa eliche.

La ferritina è un eteropolimero, perché i geni che codificano per il fascio a 4 alfaeliche della ferritina

sono 2, il gene H e il gene L (molto simili), sono sintetizzati come unica catena polipeptidica che si

riassemblano a formare trimeri e infine un ventiquattromero, 24 subunità che delimitano una cavità

interna, con una forma sferica. Ogni trimero delimita un canale che mette in comunicazione la

cavità interna della ferritina con l'esterno. La ferritina è una proteina sia plasmatica sia

intracellulare. La funzione fisiologica è correlata al deposito del ferro (all'interno della cavità viene

accumulato ossido di ferro). La ferritina di fatto è un enzima, classificato nelle ossidasi, in

particolare è una ferrossidasi trasforma cioè il Fe2+ in Fe3+. La trasformazione, ossigeno-

dipendente, avviene in prossimità della cavità, nel canale, cioè il canale possiede un'attività

ossidasica e il ferro viene depositato nella cavità (circa 5000 Fe3+ nella cavità) e viene bloccato

all'interno; questo ferro rimarrà nella cellula come deposito intracellulare. Nel plasma, invece, ha

un'attività ferrossidasica: il Fe2+ allo stato ridotto è uno ione solubile, sta in soluzione acquosa, ma

ha una pessima stabilità in corrispondenza dell'ossidazione, cioè in presenza di ossigeno

spontaneamente si trasforma in Fe3+; la trasformazione è però di tipo monoelettronico, cioè

strappa un elettrone all'ossigeno e trasforma l'ossigeno in una specie radicalica (la causa più

frequente di formazione di specie radicali dell'ossigeno, dannose perché perossidano i lipidi,

modificano le basi azotate del dna); la ferritina plasmatica

preleva il Fe2+ dal sangue; la reazione di ossidazione produce

però la cosiddetta acqua ossigenata, una specie

altamente reattiva, ma che risulta meno reattiva dei radicali

dell'ossigeno, quindi la ferritina può catalizzare l'ossidazione di

due atomi di ferro alla volta, riducendo una molecola di

ossigeno con produzione di acqua ossigenata. Anche la

ferritina è prodotta dal fegato. E' presente un recettore delle

ferritine in diverse cellule che legano il recettore, la ferritina viene internalizzata e può costituire un

deposito di ferro. Quali sono le funzioni di questo deposito di ferro? Sono numerose ovviamente,

un esempio importante è posto nel metabolismo del ferro: il ferro viene assunto dalla dieta, ma

l’organismo umano possiede una bassissima capacità di assorbimento del ferro (l'intestino è in

grado di assorbire circa un decimo del ferro presente nella dieta). Nell'intestino, il ferro si lega alla

transferrina, proteina plasmatica che trasporta il ferro come Fe2+, protetto dall'ossidazione. una

parte del Fe assorbito viene ceduto alla ferritina (plasmatica o intracellulare); gran parte del ferro

va nel midollo osseo, dove avviene l'ematopoiesi, il maggior utilizzo del Fe nell'organismo è posto

nella sintesi dell'emoglobina; in una piccola percentuale viene utilizzato per la costruzione di altri

enzimi o depositato nella ferritina. Non esiste un meccanismo di secrezione fisiologica del ferro,

viene perso tipicamente da desquamazione della cute, l'assorbimento avviene per circa 1-2 mg/die

mentre la perdita avviene esattamente per 1-2 mg/die, completando l'omeostasi del ferro. Questo

può provocare degli stati carenziali del ferro e danno origine ad una famiglia di anemie, le

cosiddette anemie sideroprive (o sideropeniche), anemie da mancanza di ferro. La mancanza di

ferro sarà data da diminuito assorbimento o aumentata perdita: un diminuito assorbimento sarà

dato a livello dell'intestino, un'enterocolite cronica ad esempio; una aumentata perdita può essere

data da frequenti emorragie interne. E' difficilissimo ristabilire l'omeostasi del Fe, i prodotti dietetici

con Fe sono frequenti, ma l'assorbimento intestinale è molto limitato (negli spinaci ad esempio,

non viene assorbito perché il Fe rimane legato alle fibre e quindi espulso); più facilmente può

essere assorbito se mescolato alle proteine, come ad esempio nella carne rossa, sono presenti dei

peptidi che digeriti possono essere assorbiti in piccoli peptidi che contengono il ferro all'interno.

Combattere gli stati carenziali del Fe è difficile, è importante continuare le terapie da carenza di Fe

anche per mesi. La ferritina è comunque utilizzata anche a scopo diagnostico, è complicato

interpretarne l'importanza diagnostica e non può essere visualizzata con l'elettroforesi.

L'ultimo esempio di proteina plasmatica è la proteina più dosata nelle analisi, la proteina C reattiva,

per la quale vengono effettuate circa settecentomila dosaggi al giorno nel mondo. La proteina C

reattiva (o pCr) è in realtà la cosiddetta pentraxina e il suo dosaggio è importante perché

appartiene a quelle settanta proteine che sono

sempre presenti nel plasma. Mentre l'albumina e la

ferritina generalmente sono costanti, la proteina C

reattiva può variare di concentrazione di 50-100

volte, è una proteina che è presente in sede di

infiammazioni acute ed ha valore diagnostico in

questo modo, cioè se si eleva la proteina c reattiva

nel plasma è presente un'infiammazione acuta in atto (pCr, da non confonfere con la Polymerase

Chain Reaction). E' una proteina, pentraxina, perché è un pentamero. La subunità costitutiva è una

proteina tutta beta, con due pavimenti beta e una piccola alfa elica a chiudere, due pavimenti posti

uno sopra l'altro. E' un omopentamero (cinque subunità identiche), formando una struttura

chiamata di tipo toroidale (un toro).

La pCr viene dosata come indice molto attendibile di infiammazione. La funzione era anche

sconosciuta, ora nota: la pentraxina è la risposta fisiologica immunitaria chiamata immunità innata,

o acquisita, quella che riconosce il non-self in qualsiasi momento ancora prima di venire a contatto

con esso, una memoria evoluzionistica immunitaria fissata nell'organismo; l'immunità innata

riconosce dei composti chimici non-self senza passare dal meccanismo di riconoscimento

dell'MHC; a questa risposta appartengono residui chimici rilasciati da batteri o cellule morte e

questi composti sono riconosciuti proprio dalla pCr. La pentraxina è in grado di attivare il

complemento, andando ad attivare la frazione c1q del complemento. E' come se fosse un sistema

immunitario primitivo, possono però riconoscere solo alcune piccole sostanze: sono in grado di

riconoscere i cosiddetti PRRs (Pattern Recognition Receptors) che sono i DAMPs (Damage

Associated Molecular Patterns) e PAMPs (Pathogen Associated Molecular Patterns): ad esempio

delle proteine del flagello batterico sono esattamente dei PAMPs, hanno una sequenza

amminoacidica riconosciuta dalla pentraxina e si lega; anche alcuni fosfolipidi batterici vengono

riconosciute dalla pentraxina e ad essi si lega; le cellule che vanno in necrosi rilasciano delle

vescicole endocitotiche che hanno una composizione lipidica particolare, la pentraxina è in grado

di riconoscerle e legarle. La pentraxina riconosce alcuni elementi chimici determinati, ai quali si

lega, attivando tutto il sistema del complemento, che poi insieme alla pentraxina va ad attivare la

lisi batterica (sistema a cascata, c1 interruttore, la pentraxina lega il c1 del complemento e lega il

pamps/damps portando insieme i due elementi, quindi il c1 del complemento senza pentraxina non

funziona). Appena la pentraxina inizia a legarsi, viene aumentata la secrezione fino a

concentrazioni 20-30-100 volte superiori; per questo è l'indice di un'infiammazione acuta in atto.

Allo stesso modo, come termina l'infiammazione, anche la pentraxina scende nel plasma. La

proteina C reattiva ha anche un importante per valutare altri processi patologici, come la necrosi, è

infatti importante per valutare la presenza di piccole necrosi in atto, ad esempio stati precoci pre-

infarto del miocardio (studi clinici sono in atto)

Enzimologia : Inibizione enzimatica

Continuiamo l'enzimologia con la parte che riguarda l'inibizione enzimatica. Nella cinetica

enzimatica bisogna ricordare che gli enzimi sono catalizzatori, il loro comportamento può essere

descritto in maniera esaustiva dall'equazione di Michaelis-Menten in cui la velocità osservata,

parametro importante, è espresso in funzione di due costanti tipiche per ogni enzima, la Km e la

Vmax, Km l'affinità dell'enzima per il substrato, la Vmax è l'efficienza catalitica dell'enzima.

L'equazione di Michaelis-Menten può razionalizzare meccanismi enzimatici anche molto

complessi, come meccanismi a più substrati sequenziali, a concentrazioni di uno dei due substrati

elevate e costanti, si utilizza la Km e Vmax dell'altro substrato, considerato variabile. Anche per

due substrati per singolo sito attivo, quindi primo substrato prodotto, poi secondo substrato e

prodotto, il cosiddetto meccanismo ping pong; anche in questo caso si può applicare l'equazione

con delle assunzioni, mantenendo cioè costante un substrato e un prodotto e ricavando la km e la

Vmax per un singolo substrato.

L'attività enzimatica viene definita (parametri Vmax e Km) a una temperatura, pH e condizioni del

mezzo definiti oltre che dalla presenza di effettori, cioè sostanze che possono avere effetto

sull'attività enzimatica. L'attività enzimatica nella cellula viene regolata dall'attività metabolica

stessa, perché con il metabolismo si fornisce o meno substrato all'enzima; può essere regolata

dalla presenza o meno dell'enzima, dalla repressione e induzione genica, enzimi che vengono

sintetizzati nella cellula solo su necessità; quando esauriscono la propria funzione, l'enzima viene

degradato attraverso la via ubiquitina-proteasoma. Tutte le attività enzimatiche dipendono dalla

temperatura, c'è un optimum di temperatura e come avviene in tu