Schemi, Anatomia Patologica

ANATOMIA PATOLOGICA.

L'anatomia patologica è una branca specialistica della medicina che studia le malattie umane

mediante esame macroscopico degli organi o microscopico dei tessuti e delle cellule.

L'indagine anatomo-patologica permette di distinguere tra tessuti normali, infiammazione, tumori

(benigni/maligni).

Scopo → studio morfologico delle lesioni indotte dalle malattie: esame macroscopico + esame

istologico + sintomi/lesioni

Giovanni Battista Morgagni introdusse lo studio anatomo-clinico con l'analisi autoptica dei casi

clinici da lui seguiti.

Rudolf Virchow → fondatore della patologia cellulare → la sede di ogni affezione è nelle cellule

Ogni campione o gruppo di campioni prelevati dal medesimo paziente deve essere accompagnato

da una SCHEDA DI RICHIESTA → compilata in maniera leggibile, firmata dal medico curante

Dati della scheda:

Identificazione del paziente (cognome maiuscolo, nome minuscolo)

• Sesso, data e luogo di nascita, indirizzo e n telefonico, professione attuale e pregressa, CF

Identificazione del mittente

• Medico, ospedale, reparto/ambulatorio, n cartella clinica/registro, n telefonico medico

richiedente, destinatario della risposta

Identificazione del campione

• Tipo di prelievo/intervento effettuato, materiale inviato, numero di frammenti da esaminare,

sede del prelievo, indicazioni topografiche=reperi chirurgici, fissativo usato, data prelievo

Dati clinici

• Notizie anamnestiche essenziali, es istologici/citologici precedenti, es

radiologici/laboratorio, terapia in corso, terapia pregressa (radiante, antiblastica, ormonale),

eventuali patogeni rilevanti da indicare anche nel contenitore, diagnosi clinica

Dati di ricezione

• Data e ora ricezione, rilievi sul materiale, n progressivo di registro, firma ricevente

Il materiale non può essere accettato se non accompagnato dalla scheda di richiesta.

Il materiale deve essere inviato INTATTO e per INTERO, senza dissezioni e tagli preliminari che

possono compromettere l'affidabilità dell'esame macro e microscopico e conseguentemente della

diagnosi.

Migliore modalità di invio è allo stato fresco → tmax 15' per piccoli pezzi, 1 h per pezzi voluminosi

Per evitare l'essiccamento tela inumidita con soluzione fisiologica in sacchetti di polietilene a

perdere con chiusura ermetica, sui quali va apposta l'etichetta di identificazione

Essendo a fresco, l'anatomo-patologo potrà eseguire:

Rilievi fotografici

• Prelievi per criopreservazione

• Prelievi per biologia molecolare

• Esami batteriologici

• Colture cellulari

• Citofluorimetria

• Citogenetica

• Citologia per apposizione

•

I più piccoli prelievi bioptici devono essere fissati immediatamente → orientati su carta bibula

Se non possono essere inviati a fresco devono pervenire in fissativo, posto in idoneo contenitore

sulla cui parete va applicata l'etichetta

Regola: il volume del fissativo deve essere 10 volte quello del campione.

Biopsia: prelievo di tessuti da un paziente in cui si sospetta una malattia

Esame macroscopico

• Esame istologico (tipo, grado, diffusione, metastasi, stadio)

• Tipo: m infiammatoria (lieve, moderata severa); m neoplastica (fibrosi, strutture interessate,

grado di differenziazione, TNM)

Processazione:

Fissazione

Impedire autodigestione ed autolisi che altera la composizione chimica e la morfologia dei tessuti;

Bloccare in situ i componenti tissutali in una condizione quanto più simile a quella in vita

Non esiste fissativo che rispetti integralmente i tessuti

La sostanza fissatrice provoca una denaturazione

Lo stesso fissativo ha diverse proprietà a seconda del tessuto

Accettazione

Autotecnico processatore (Disidratazione, Diafanizzazione, Imbibizione di paraffina)

Inclusione in blocchetto di paraffina

Microsezione

Colorazione

Aldeide Formica (HCOH)

Non coagulante, additivo, gas incolore irritante, pungente.

Formolo o formalina è una soluzione acquosa nella quale l'aldeide formica è presente alla

concentrazione di 37-40%

Si utilizza diluita al 10% (HCOH 4%)

1p di formolo – 9 pp di acqua

Potere di penetrazione buono: o,8 mm/h

Fissa e indurisce, consistenza elastica

Non friabile, non discioglie i grassi, non danneggia i componenti ematici, potere di diffusione

superiore agli altri, si mischia bene agli altri, permette tutte le colorazioni, conserva a lungo.

Scioglie il glicogeno e l'acido urico, dopo mesi altera la tingibilità, precipitati formalinici

La paraffina è un miscuglio di idrocarburi saturi ad elevato peso molecolare

Solida a T ambiente, liquida a T 50-60° C

Insolubile in acqua e alcol metilico

Solubile in ag chiarificanti: xilolo, benzolo, cloroformio, limonene

Il tessuto deve quindi essere disidratato → alcool etilico

Quindi, l'alcool deve essere eliminato → ag chiarificanti, detti anche intermedi

Istochimica: disciplina morfologica che ha lo scopo di evidenziare e caratterizzare i componenti dei

tessuti con metodi chimici e chimico-fisici

3 esigenze fondamentali:

1. Deve essere mantenuta rigorosamente la localizzazione della sostanza

2. Evidenziazione della sostanza con metodi assolutamente specifici

3. Allestire preparati adeguati per mo (prodotto di reazione colorato, preparato trasparente alla

luce)

Colorazione.

Coloranti acidi → carica negativa, citoplasma

Coloranti basici → carica positiva, nuclei

Naturali animali: carminio della cocciniglia; vegetali: ematossilina; artificiali: eosina

Ematossilina → colora il nucleo in blu-nero

Eosina → colora in fucsia-rosa il citoplasma e il connettivo

L'analisi istomorfologica è fondamentale ed insostituibile nella diagnostica di base.

1. Non sempre è in grado di fornire informazioni adeguate sull'esatta natura e origine della

lesione.

2. Evidenzia solo indirettamente e parzialmente alcuni parametri biologici utili nella

diagnostica oncologica (es caratteri della proliferazione neoplastica, responsività ai farmaci)

L'esigenza di formulare diagnosi sempre più “specifiche” di ottenere una quantità maggiore di

informazioni → da prelievi bioptici → all'introduzione di nuove tecniche

Immunoistochimica: insieme di tecniche e metodi atti ad evidenziare morfologicamente la

localizzazione di uno o più antigeni su preparati istologici e citologici, mediante l'impiego di

anticorpi, sfruttando la peculiarità delle reazioni immunologiche.

Antigeni: proteine, lipoproteine e glicoproteine in grado di evocare una risposta immune da parte

del sistema immunitario. In ogni antigene si riconoscono uno o più determinanti antigenici o

epitopi, ma ciascun anticorpo si lega solo ad uno di questi

Anticorpi (immunoglobuline): molecole glicoproteiche, prodotte dalle plasmacellule, in grado di

legarsi in modo specifico ai determinanti antigenici, classificati in base alle caratteristiche di

migrazione elettroforetica, che dipendono dal peso molecolare.

Campionamento del materiale istologico e citologico: la corretta preparazione dei campioni da

sottoporre ad indagini di immunoistochimica è fondamentale per ottenere risultati attendibili (No

necrosi, no emorragie, no elettro o crio-resezione).

Trattamento del materiale istologico: Fissazione, Disidratazione, chiarificazione, inclusione, taglio e

allestimento dei preparati, idratazione dei preparati, ripristino dell'antigenicità.

Fissazione: la qualità della fissazione dei campioni bioptici è alla base per poter effettuare una

reazione immunoistochimica adeguata.

Scopo della fissazione: conservare il tessuto indefinitamente nel tempo (prevenire l'autolisi);

mantenere struttura e antigenicità simili a quelle fisiologiche.

Presupposto della reazione di iummunoistochimica è che l'anticorpo specifico si leghi al relativo

antigene.

L'antigene deve avere due caratteristiche:

Conservabilità: deve essere insolubile nei liquidi utilizzati per le procedure isto-citologiche,

• altrimenti viene perso

Accessibilità: le normali procedure isto-citologiche possono rendere l'antigene inaccessibile

• all'anticorpo o solo parzialmente, in modo riattivabile, o in modo definitivo..

In seguito alla fissazione si generano dei legami crociati fra il liquido fissativo ed i gruppi attivi

delle proteine (-NH2, -COOH), tali legami conducono all'occultamento/mascheramento degli

antigeni.

Caratteristiche delle reazioni immunoistochimiche.

Sensibilità: è la più piccola quantità di un antigene che può essere evidenziato con una tecnica

immunoistochimica (pos/pos + falsi negativi)

Specificità: è la capacità di una reazione immunoistochimica di colorare solo ed esclusivamente il

sito dell'antigene ricercato (neg/ neg + falsi positivi)

Risoluzione: è l'idoneità di un metodo immunoistochimico di consentire l'esatta visualizzazione

topografica dell'antigene ricercato, capacità di distinguere prodotti di reazione localizzati in sedi

vicine.

Principali tecniche applicate in immunoistochimica: immunofluorescenza, immunoenzimatica,

tecnica dei complessi immuni, tecnica avidina-biotina.

Immunofluorescenza: si basa sull'impiego di anticorpi primari specifici direttamente o

indirettamente coniugati con il fluorocromo. I traccianti fluorescenti (fluorocromi) più utilizzati

sono l'isotiocianato di fluoresceina, tetrametilrodamina.

Tecnica dei complessi immuni: il preparato viene incubato con l'antisiero primario, con l'antisiero

secondario ed infine, con il complesso immune preformato in vitro. Quest'ultimo è costitutito da

anticorpi diretti contro l'enzima (perossidasi o fosfatasi alcalina) legati al corrispondente enzima

con legame immunologico.

Tecnica ABC: a tre stadi:

1. Anticorpo primario non marcato

2. Anticorpo secondario coniugato con Biotina

3. Complesso Streptavidina-Enzima Biotilinato

Il substrato cromogeno rivela l'attività enzimatica, mediante la formazione di un precipitato

colorato, laddove è avvenuta la reazione Antigene-Anticorpo.

Tecnica del destrano: a due stadi:

1. Anticorpo primario

2. Molecola di destrano (polimero idrosolubile), marcato con numerose molecole di enzima, al

quale sono stati coniugati gli anticorpi secondari.

Substrati cromogeni: sostanze utilizzate per la rilevazione dell'attività enzimatica degli enzimi

utilizzati come marcatori nelle tecniche immunoenzimatiche. Per la rilevazione della perossidasi, i

cromogeni più utilizzati sono la diaminobenzidina, l'aminoetilcarbazolo.

Per la rilevazione della fosfatasi alcalina, vengono utilizzati i sali di naftolo in associazione ai sali di

azonio oppure il nitro blu-terazolio.

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