Schema, riassunto biologia molecolare

MODELLO A TROMBONE CON TRIMERO DELLAPOLIMERASIDNA

polimerasi III ooloenzima3 DNA polimerasi core (2 per ilfilamento lento e due per il veloce)DNA polimerasi IIItrombone DNA elicasi 1 Proteina per ogni polimerasi$core (3). Sono ponti proteiciflessibiliaModello DNA primasi 1 Complesso pentamerico checostituisce il caricatore dellasliding clamp. [Il caricatore si legaad una molecola di ATP assumentoduna conformazione aperta eproteine SSB permettendo l'associazione con lasliding clamp. Quando idrolizzal'ATP chiude l'anello della slidingclamp e si dissocia].

- Il modello a trombone fa parte del replisoma.

- La sintesi dei due filamenti, il veloce e il lento, deve procedere in modo sincrono. Motivo per cui si formaun'ansa sul filamento lento, che a causa dei continui cicli di primer-pol-sliding clamp non riesce a mantenerela velocità del suo reciproco.

- Le due polimerasi core sul filamento lento si alternano, la seconda può iniziare la sua anche quando la

primanon ha ancora finito di sintetizzare il proprio frammento.- Prima viene sintetizzato il primer, poi caricata la sliding clamp e a seguire la polimerasi core libera. Il caricatore della sliding clamp continua a spostarla sul nuovo frammento da sintetizzare di ciclo in ciclo.- .La sliding clamp ospita al suo interno i due filamenti (vecchio e in formazione) e un film di molecole d’acqua

REPLICONE PROCARIOTAOriC in E.Coli è replicatore. Lega iniziatore DnaA in 5 punti(DnaA è formato da 5 subunità 3 a bassa affinità e 2 ad alta leganti ATP), possiede 3 sequenze DUE ricche di A-T e la sequenza OriC. Quando le zone di DnaA ad alta affinità legato ATP cambiano conformazione. Le 5 subunità formano un oligomero elicoidale sul DNA. DNA si superavvolge positivamente sull'oligomero. Superavvolgimento negativo di compensazione in corrispondenza delle sequenze DUE ricche di A-T. Il replisoma si poggia sul disavvolgimento all'interno del sito di

1. Origine replicazione.
2. La DnaA svolge la propria funzione ATPasicadistaccandosi e svolgendo l'oligomero.
3. Reclutamento di DnaC (caricatore dell'elicasi) e DnaB(elicasi) con caricamento di DnaB sul filamento. La dissociazione di DnaC da DnaB la attiva.
4. Reclutamento dell'oloenzima replicativo.
5. Terminazione e formazione dei concatameri.
6. Reclutamento di topoisomerasi II per svolgimento dei concatameri.

ORIGINE DELLA REPLICAZIONE EUCARIOTA

COMPLESSI PRE-RC PRE-REPLICATIVI O PRE-REPLICATION COMPLEX

Complesso ORC - Origin Replication Complex (esamerico) recluta il fattore Cdc6 che lo fa aderire alle corrette sequenze di inizio. Viene reclutata elicasi. Due elicasi formano il complesso Mcm2-7 (formazione testa-testa). Cdt1 media l'adesione del complesso a ORC. Quando il complesso elicasi è localizzato la replicazione è licensed. (Fase G1 della replicazione). Attivazione del complesso elicasi ad opera delle chinasi CDK e DDK (la prima è ciclina dipendente mentre la seconda è DDK dipendente).

Dbf4, le prime regolano la replicazione e vengono attivate grazie all'accumolo di cicline durante le fasi del ciclo cellulare).

TRASCRIZIONE NEI

Legame dell'enzima RNA a 5 subunità sul promotore.

PROCARIOTI

La pol cambia conformazione con la creazione del complesso binario (chiuso). Promoter: Unwinding dei due filamenti DNA per ricavare stampo, da -10 a +1. codificante.

Formazione del complesso aperto e inizia la trascrizione (il processo diventa irreversibile e la pol non si dissocia più). Non viene trascritto.

Il TSS Transcription Stant Site (+1) dove inizia la trascrizione è sempre una pirimidina (A o G) sul gene.

Sequenze strettamente conservate generalmente con posizione fissa. In E.Coli a -10 e -35 pb. A -10 ATATTA e a -35 TTGACA recognition site. Il primer a -35 è il binding site della pol mentre la regione -10 è sede di formazione del complesso binario DNA-RNA.

pol.- Le varianti promotori nei procarioti sono:

• Formazione del legame fosofodiestere tra i primi due • Elemento UP (upstream) = associato a geni moltoribonucleotidi. Il primo ribonucleotide ha 3 Pi, ciò lo trascritti.differenzia come estremità in 5'.
• Elemento -10 esteso
• Elemento a valle -10

Con la formazione del trascritto si crea il complesso - I promotori -10 vengono riconosciuti dallaternario DNA-RNA-pol. subunità della polimerasi. L'elemento UP da! #.

Formazione dei canali della polimerasi NT (non template) eT (template). Il DNA deve passare davanti e dietro !2come se fosse un cuneo, in questo modo tiene separati ifilamenti.

Dopo pochi nucleotidi si dissocia dallo stampo!70 Allungamento:permettendo di procedere con l'elongation (evasione del - I nucleotidi vengono selezionati perpromotore). Il core si muove lungo lo stampo insieme alla discriminazione cinetica. Se il legame è sbagliato labolla trascrizionale (18

nucleotidi) . Si esce dalla fase di reazione è enormemente rallentata e la RNA pol va ininizio. idrolasi rimuovendolo.[L'mRNA permette rimane associato al DNA per circa 10 - Nei batteri la trascrizione avvienenucleotidi formando una elica ibrida] contemporaneamente alla traduzione.Con l'uscita dei filamenti DNA dalla polimerasi i due siritrovano e formano la helix.Non si creano superavvolgimenti perchè viene svolto unnucleotide a monte ma viene riavvolto subito a valle dellapol. Terminazione:- dipendente. è una proteina esamerica come% %l'elicasi. Ogni sub associa ATP e donandole attivitàelicasica. Lega il trascritto nascente e lo distacca dal DNA,oscillando ciclicamente tra conf. aperta e chiusa. Haun'affinità maggiore per il trascritto rispetto al DNA- indipendendente. Si basa su un segnale di%terminazione, una sequenza di 30-30 nucleotidi conmolte G-C. Si forma struttura a forcina. L'RNA si spiralizzaSi entra nella fase

di terminazione con il distacco della pol. e l'elica compete con la regione etero-ibridizzazione. È un processo che può essere dipendente o " Quando viene trascritto UUU che forma il legame più indipendente. debole l'RNA tende a dissociare. Lo stallo della pol fa dissociare il filamento (uscita hairpin). Distacco del filamento RNA.

TRASCRIZIONE

Riconoscimento dei promotori da parte di fattori generali della trascrizione GTF o General Transcription Factors (6, dall'A all'H). I GTF vengono assemblati sul promotore. EUCARIOTI (RNA-polimerasi II)

Promotori:

- Generalmente sono formati da una zona centrale e alcuni elementi, upstream e downstream sequence con un intervallo di 80 pb comprendente l'inizio di trascrizione TSS. Formazione del complesso PIC Pre-Iniziation Complex: Costituiscono il promotore minimale o core promoter.

- Ulteriori sequenze di regolazione che si sommano al TF2D (comprende subunità TBP TATA Binding Protein

promotore minimale: e 13 proteine associate TAF 1-13) lega la TATA box e • Sequenze di attivazione a monte AUS Upstream Activatinggenera una distorsione dell'elica. [Riconoscimento con Sequence.#zone foglietto ].Inoltre lega INR. • Elementi prossimali (entro centinaia di pb a monte del- TF2H lega TF2D. core promoter).- TF2B entra in complesso legandosi a TF2A (che • Elementi distali, con poche variazioni. A certestabilizza B e D) e TF2D di cui lega TBP. TF2B lega BRE. concentrazioni formano gli enhancer, silencer e insulatorL a polimerasi viene messa in posizione. (possono anche trovarsi vicino al core promoter però). Questiultimi elementi si trovano a monte del gene e vengono legati- TF2F lega pol II. Entrambi vengono reclutati dal da Activator/Repressor regolando l'espressione del complessocomplesso basale trascrizionale.-TF2E viene reclutato.-TF2H viene reclutato da TF2E. Ha attività elicasica - Elementi rappresentativi del core

promoter: nella regione del promotore e chinasica sul dominio • Iniziatore INR. Il TSS è generalmente centrato su una A o acarbossiterminale della pol, CTD (sui residui di serina). volte una G. Molti promotori hanno sequenze riconducibili a L'attivazione della pol la sposta a valle del promoter. consensus YYCAYYYYY detta INR. In questa sequenza A è +1 e Y*il dominio non fosfor di CTD interagisce con TBP e è una pirimidina. TAF2. • TATA box circa -25. È una sequenza consenso. • Elemento BRE o B Reconizing Element, nelle prossimità amonte della TATA. • Elemento DPE + o Downstream Core Promoter, +30 a valle del gene. • Elemento DCE o Downstream Promoter Element, a valle del gene. TRASCRIZIONE E TRADUZIONE NON AVVENGONO MAI CONTEMPORANEAMENTE. LA TRASCRIZIONE È UN PROCESSO Allontanamento dei fattori del PIC. NUCLEARE MENTRE LA TRADUZIONE È UN PROCESSO La pol sosta a circa +50 in uno stato sospeso (poised). CITOSOLICO. Reclutati

fattori di allungamento tra cui FACT. prima e dopo la trascrizione i FACT che sono fattori specifici di allungamento disavvolgono e riavvolgono la cromatina sfacendo e riformando la collana di perle. per ogni gene i fattori di regolazione sono numerosi e hanno un effetto sinergico additivo che serve a regolare più finemente l'espressione.

Complesso del mediatore:

• Aggiunge un grado di regolazione all'espressione. Si lega al activator, che ha già legato l'enhancer in cis, e al complesso trascrizionale basale. Funge da co-attivatore in trans, un po' come un ponte. Legando il complesso su TSS attiva la trascrizione.
• Reclutamento dei fattori di terminazione. Trascrizione della sequenza terminatrice AAUAAA seguita dalla sequenza ricca in GU. Tra le due viene reclutata una endonucleasi che taglia il trascritto.

Alcuni activator si legano a una HAT Histone AceteilAggiunta della coda poliA da parte della poliA-polimerasi Transferasi, che rimaneggia le

code degli istoni rilassando oin 3'(fino 200A) superavvolgendo la cromatina (controllo superiore).

MODIFICHE POST-TRADUZIONALI

Eucarioti (pre-mRNA o RNA eteronucleareo trascritto primario) [la coda CTD della Procarioti (RNA maturo)pol è formata da 7 amminoacidi ripetuti,la serina in 2 e quella in 5 controllano iprocessi post-trascrizionali]

CAP 5' [fosfor. serina in 5] = necessario per latraduzione. Avviene a circa +40 dall'inziazione constep consecutivi:

• RNA trifosfatasi, modifica il primo nucleotide (A)eliminando l'ultimo Pi.
• Guaniltransferasi , condensa una G sull'A. si crea unponte a 3 fosfati tra P$ della G e P# della A.
• Metiltransferasi,