Schema riassuntivo delle tecniche "ELISA"

ELISA

venerdì 13 aprile 2018    08:52

Tecniche immunoenzimatiche, nelle quali il complesso antigene/anticorpo è legato ad un supporto di polistirene. Ovvero delle piastre composte da piccoli pozzetti. In questi pozzetti le soluzioni non vengono mai a contatto.

Il cromoforo formato, varia in base alla quantità, tant'è che viene definito un metodo quantitativo.

Il cromoforo formato, viene misurato tramite appositi spettrofotometri, che permettono di misurare l'assorbanza dei diversi campioni.

ELISA DIRETTO

Definiti come ELISA nei quali l'antigene viene fissato al pozzetto. In pratica l'antigene viene adsorbito dal polistirene (sandwich)

ELISA INDIRETTO

La proteina che viene adsorbita dal pozzetto è l'antigene

ELISA COMPETITIVO

La quantità di colore è inversamente proporzionale alla presenza di analita.

ELISA NON COMPETITIVO

L'intensità di colore formata è direttamente proporzionale alla presenza dell'analita in questione

ELISA DIRETTO NON COMPETITIVO (sandwich)

• Il primo passaggio è la preparazione della piastra: dobbiamo fare adsorbire la molecola di interesse (anticorpo specifico in questo caso).
• Come nel DOT BLOT, bisogna saturare la piastra con una proteina inerte -> blocking
• Si immette il campione: in questa fase si crea il complesso antigene-anticorpo, legato al pozzetto. Ovviamente in difetto rispetto all'anticorpo legato alla piastra.
• Lavaggio del pozzetto
• Introduzione dell'anticorpo primario, specifico per l'antigene che si vuole quantificare
• Lavaggio dell'anticorpo in eccesso
• Introduzione dell'anticorpo secondario: coniugato ad un enzima, che si lega alla regione costante dell'anticorpo primario.

Se è quindi arrivati in una situazione in cui in un pozzetto contenente poco antigene contiene poco enzima e viceversa tanto enzima in un pozzetto con molto antigene.

• Viene inserita una quantità uguale di substrato in ogni pozzetto, dando il via alla reazione cromatica

In questo modo, in tutti i pozzetti si tende ad un certo colore, ma con una velocità diversa data dalla quantità di enzima legato ai complessi. Fermando la reazione ad un dato tempo, l'assorbanza dei pozzetti sarà proporzionale alla quantità di analita.

Una certa quantità di pozzetti dovrà essere dedicata a soluzioni standard con quantità note di analita, per costruire una curva di taratura.

Si noti che questo metodo è l'ideale per proteine di grosse dimensioni, quindi con più epitopi disponibili al legame con gli anticorpi (ogni antigene deve legare 2 anticorpi).

ELISA INDIRETTO COMPETITIVO (antigene legato al pozzetto)

La molecola da quantificare è lo stesso antigene che si trova anche legato al pozzetto.

• Coating con antigene di interesse
• Blocking con proteina inerte
• Inserimento del campione (che a sua volta contiene l'antigene da quantificare). L'analita non potrà legare il pozzetto, quindi rimane libero in soluzione
• Contemporaneamente si aggiunge l'anticorpo primario, specifico per legare sia l'antigene del campione (libero in soluzione) sia quello legato al pozzetto. Il suo legame dipende dalla competizione: con elevato antigene in soluzione si lega a questo, con poco antigene in soluzione, si lega a quello del pozzetto.
• Lavaggio: si eliminano tutti i complessi antigene-anticorpo che non erano legati al pozzetto.
• In questo modo ritroveremo tanto anticorpo primario dove c'era poco antigene libero, viceversa poco anticorpo dove c'era tanto antigene nel campione (ricordiamo che è indiretto).
• Inserimento di anticorpo secondario con enzima

ELISA

venerdì 13 aprile 2018 08:52

Tecniche immunoenzimatiche, nelle quali il complesso antigene/anticorpo è legato ad un supporto di polistirene. Ovvero delle piastre composte da piccoli pozzetti.

In questi pozzetti le soluzioni non vengono mai a contatto.

Il cromoforo formato, varia in base alla quantità, tant’è che viene definito un metodo quantitativo.

Il cromoforo formato, viene misurato tramite appositi spettrofotometri, che permettono di misurare l’assorbanza dei diversi campioni.

ELISA DIRETTO

Definiti come ELISA nei quali l’anticorpo viene fissato al pozzetto. In pratica l’anticorpo viene adsorbito dal polistirene (sandwich)

ELISA INDIRETTO

La proteina che viene adsorbita dal pozzetto è l’antigene

ELISA COMPETITIVO

La quantità di colore è inversamente proporzionale alla presenza di analita.

ELISA NON COMPETITIVO

L’intensità di colore formata è direttamente proporzionale alla presenza dell’analita in questione

ELISA DIRETTO NON COMPETITIVO (sandwich)

• Il primo passaggio è la preparazione della piastra: dobbiamo fare adsorbire la molecola di interesse (anticorpo specifico in questo caso). --> coating
• Come nel DOT BLOT, bisogna saturare la piastra con una proteina inerte --> blocking
• Si immette il campione: in questa fase si crea il complesso antigene-anticorpo, legato al pozzetto. Ovviamente in difetto rispetto all’anticorpo legato alla piastra.
• Lavaggio del pozzetto
• Introduzione dell’anticorpo primario, specifico per l’antigene che si vuole quantificare
• Lavaggio dell’anticorpo in eccesso
• Introduzione dell’anticorpo secondario: coniugato ad un enzima, che si lega alla regione costante dell’anticorpo primario.

Se si è quindi arrivati in una situazione in cui in un pozzetto contenente poco antigene contiene poco enzima e viceversa tanto enzima in un pozzetto con molto antigene.

• Viene inserita una quantità uguale di substrato in ogni pozzetto, dando il via alla reazione cromatica

In questo modo, in tutti i pozzetti si tende ad un certo colore, ma con una velocità diversa data dalla quantità di enzima legato ai complessi. Fermando la reazione ad un dato tempo, l’assorbanza dei pozzetti sarà proporzionale alla quantità di analita.

Una certa quantità di pozzetti dovrà essere dedicata a soluzioni standard con quantità note di analita, per costruire una curva di taratura.

Si noti che questo metodo è l’ideale per proteine di grosse dimensioni, quindi con più epitopi disponibili al legame con gli anticorpi (ogni antigene deve legare 2 anticorpi).

ELISA INDIRETTO COMPETITIVO (antigene legato al pozzetto)

La molecola da quantificare è lo stesso antigene che si trova anche legato al pozzetto.

• Coating con antigene di interesse
• Blocking con proteina inerte
• Inserimento del campione (che a sua volta contiene l’antigene da quantificare). L’analita non potrà legare il pozzetto, quindi rimane libero in soluzione
• Contemporaneamente si aggiunge l’anticorpo primario, specifico per legare sia l’antigene del campione (libero in soluzione) sia quello legato al pozzetto. Il suo legame dipende dalla competizione: con elevato antigene in soluzione si lega a questo, con poco antigene in soluzione, si lega a quello del pozzetto.
• Lavaggio: si eliminano tutti i complessi antigene-anticorpo che non erano legati al pozzetto.
• In questo modo ritroveremo tanto anticorpo primario dove c’era poco antigene libero, viceversa poco anticorpo dove c’era tanto antigene nel campione (si ricorda che è indiretto).
• Inserimento di anticorpo secondario con enzima