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Riassunto schematico di Tecnologie Ricombinanti Appunti scolastici Premium

Appunti di Tecnologie ricombinanti basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof. Tosco dell’università degli Studi di Salerno - Unisa, facoltà di farmacia, Corso di laurea magistrale in chimica e tecnologia farmaceutiche. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Tecnologie ricombinanti docente Prof. A. Tosco

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ESTRATTO DOCUMENTO

Anche il lievito, soprattutto saccaromices cerevisiae, oltre ad essere un modello per descrivere i

processi di funzionamento di una cellula eucariota, perchè è più semplice tenere in coltura rispetto

alle cellule estratte dagli eucarioti superiori.

Si sa bene come manipolarlo e per questi organismi sono stati sviluppati molti più espedienti di

laboratorio per manipolarli geneticamente, quindi saccaromices cerevisiae è stato uno dei primi

lieviti per quali sono stati creati vettori di clonaggio.

Sono stati messi a punto due vettori di clonaggio

I vettori di integrazioni, cioè quei vettori che devono necessariamente integrarsi nel genoma del

lievito, per poter essere replicati, se non si integrano nel DNA genomico, vengono espulsi dalla

cellula e non si replicano insieme al DNA genomico come elementi extracromosomiali.

I vettori a replicazione autonoma possono replicarsi autonomamente, quindi rimanere come

elementi extracromosomiali, essere duplicati insieme o separatamente rispetto al DNA genomico,

e quindi ci possono servire per studi di laboratorio per produrre proteine ricombinanti.

Un vettore di integrazione di lievito si integra per ricombinazione omologa.

La ricombinazione omologa secondo la teoria di Holliday, ha bisogno di avere regioni omologhe di

DNA per incontrarsi, quindi dobbiamo far si che nel nostro vettore ci sia una regione omologa del

DNA genomico.

I marcatori di selezione del lievito, non sono antibiotici, ma sono geni che complementano una

funzione che è stata eliminata nel lievito di laboratorio che stiamo usando.

Tutti i lieviti di laboratorio sono modificati geneticamente e quelli che devono prendere dei vettori

sono modificati in alcuni geni che sono necessari per la biosintesi o di alcuni a.a. o di alcuni

nucleotidi.

Un gene del quale si elimina la funzione è URA3- che serve per la biosintesi dell'uracile.

Se cresco un ceppo che è URA3- su un terreno che è privo di uracile, questo ceppo non riesce a

crescere, quindi se voglio selezionare un lievito che abbia preso o no un plasmide, nel plasmide

devo mettere la funzione per il gene URA 3, e quindi il lievito che avrà preso questo vettore, riesce

a crescere in un terreno senza uracile.

Se vogliamo sfruttare questa cosa doppiamente, inserire la ricombinazione omologa in maniera

tale che non dia fastidio ad altre regioni del genoma, proprio nella regione del gene URA 3-.

Normalmente posso renderlo difettivo eliminando o una piccola porzione del gene o inserendo una

mutazione puntiforme, basta che inserisco un segnale di stop verso l'inizio della regione

codificante e quindi il gene non viene più espresso, ma rimane tutta la regione genica all'interno

del genoma.

Metto nel mio plasmide il gene URA 3, quindi faccio avvenire ricombinazione omologa tra il

plasmide e il DNA genomico del lievito, avendo due effetti.

Nel momento in cui ho selezionato le cellule del lievito che saranno in grado di crescere su uracile,

io sono anche sicuro che avranno inserito il DNA all'interno di quella regione genica, quindi so

anche dov'è andata a finire, e questa non è una cosa da poco, perchè la ricombinazione omologa

non controllata mi può portare a dei problemi.

I vettori autonomi

Sono dei vettori molto simili a quelli batterici, avranno un'origine di replicazione di lievito e sia di

batteri, avranno i marcatori per la resistenza.

A differenza dei batteri, infatti, i lieviti sono molto meno resistenti agli antibiotici e la selezione viene

di sol ito effettuata sfruttando la complementazione di mutazioni auxotrofiche nel ceppo di lievito

ospite.

I primi cromosomi artificiali costruiti in laboratorio, sono i cromosomi di lievito, perchè sono in grado

di contenere pezzi di DNA fino a 2 Mb

Devono contenere, essendo cromosomi artificiali, tutte le regioni necessarie per la duplicazione e

segregazione di un cromosoma.

Telomeri, Centromeri e le Origini di replicazione.

Conterrano un marcatore per essere prodotto in E.coli, quindi la resistenza all'ampicillina,

un origine di replicazione batterica e poi i marcatori per essere duplicati nel lievito stesso e ne

devono contenere due.

Come si costruisce una libreria in YAC?

Prendo questo vettore, ne faccio una bella produzione, lo taglio con BamHI in maniera tale da

avere un vettore lineare, in modo da avere i due telomeri all'estremità.

Poi viene tagliato con un altro enzima che si trova con Eco RI che si trova alla parte opposta

rispetto a BamHI che lascia i telomeri all'estremità, i marker di selezione che saranno Ura3 e trp1

uno su un braccio e uno sull'altro.

Su uno solo dei due c'è la regione centromerica e l'origine di replicazione del lievito

Dopo inserisco tra le due estremità i pezzi di DNA, e seleziono in base alle resistenze.

Se il lievito trp1- e Ura 3- cresce in trp1 e su Ura3 significa che ha preso il cromosoma artificiale,

dopo di che quando si inserisce del DNA esogeno all'interno di questo vettore, si inattiva un gene

di un tRNA soppressore che è stato inserito all'interno del lievito.

tRNA soppressori

E' un tRNA che legge un codone di stop come un a.a.

L’inserzione di DNA esogeno inattiva il gene del tRNA soppressore SUP4.

In questo caso utilizziamo cellule di lievito che sono mutate nel gene ad2( che serve per la via

biosintetica dell'adenina)

Se il gene ad2 è mutato si ha un accumulo nel vacuolo di un intermedio che da una colorazione

rossa alle cellule.

Se il vettore artificiale non è ricombinante, porta il tRNA soppressore che legge la mutazione ad2

ed ad2 diventa funzionale e scompare la colorazione rossa

Se il vettore artificiale è ricombinante,il gene SUP4 non funziona più, non va a complementare la

mutazione di ad2 e ho l'accumulo rosso nel vaculo

Riassumendo

Le cellule di lievito devono crescere su terreno carente di trp1, Ura3 e formare i vacuoli rossi se è

così io ho messo all'interno il cromosoma artificiale ricombinante.

Svantaggi degli YAC

-Sono molto grossi e quindi suscettibili di rottura e di riarrangiamenti

-I cloni di librerie genomiche in YAC contengono spesso regioni provenienti da diverse parti del

genoma

-I cloni tendono ad essere instabili e gli inserti di DNA esogeno spesso vengono persi

-Durante la crescita mitotica c’è una notevole frequenza di perdita dell’intero YAC

-È difficile purificare lo YAC dagli altri cromosomi (PFGE) e le rese sono basse

BAC

I vettori BAC (Bacterial Artificial Chromosome) possono contenere frammenti grandi fino a 300 kb,

Il DNA inserito in BAC è molto stabile, ma sono presenti solo in una o due copie per cellula, quindi

la loro produzione non può essere elevata però a differenza degli yac sono molto stabili e non

danno ricombinazione omologa.

Contengono siti cos e siti lox consentendo la linearizzazione del vettore.

PAC

I vettori PAC (P1 Artificial Chromosome) possono contenere frammenti compresi tra le 75 e le 95

kb.

Grossa dimensione dei frammenti (oggi fino a 150 kb)

Non avvengono riarrangiamenti o delezioni di DNA grazie all’utilizzo di ceppi restrizione-meno

Il DNA si recupera facilmente come plasmide

I PAC e i BAC sono i più usati

Un cromosoma artificiale di lievito ci serve per studiare cromosoma artificiale che vogliamo .

Un cromosoma artificiale umano

HACs

Un cromosoma con i centromeri, le origini di replicazione e i telomeri ma più complessa.

Posso inserire un gene che inserisco a sua volta in una cellula eucariota e quindi andare a

sostituire una funzione mutata nella cellula eucariota.

Come si producono le proteine ricombinanti?

Nel momento in cui abbiamo un gene che esprime una proteina, dobbiamo trasferirlo in un vettore

ma anche produrre un RNA e una proteina.

Analizzeremo quali caratteristiche sono importanti da inserire in un vettore per far si che diventi un

vettore di espressione e non solo di clonaggio, affinchè quel pezzo di DNA venga espresso.

Esprimiamo in sistemi eterologhi quando prendiamo un gene da un organismo e lo trasferiamo in

un altro organismo diverso dal precedente.

Es.prendo un gene umano e lo metto in E.coli, in Bacillus subtilis, saccaromices cerevisiae, pichia

pastoris, in piante come l'arabdopsis thaliana, la pianta del tabacco o in drosophila melanogaster o

in animali dai quali si può estrarre la nostra proteina dal sangue, dall'urina, dal latte senza

sacrificare l'animale.

Vettori di espressione batterici

Cosa dobbiamo fare per costruire un vettore di espressione?

Dobbiamo ottimizzare l'espressione del gene, nonchè ottimizzare la stabilità del prodotto proteico.

Se vogliamo ottimizzare la trascrizione in E.coli cosa faccio?

Mi serve il promotore ( -10 -35 )

Sequenza consenso (si allineano diversi promotori e si va a vedere la frequenza di una base in

tutte le posizioni, e poi si fa una sequenza con le basi che ricorrono maggiormente in ciascuna

posizione ) es. TATA

Le sequenze consenso corrispondono al miglior legame che il promotore possa fare con la

subunità sigma.

Non tutti i promotori non contengono le sequenze consenso, perchè?

Perché se un promotore è forte, avremo sempre un livello alto di espressione, ma noi non

vogliamo sempre un livello alto di espressione per tutti i promotori

I promotori sono più o meno forti a partire da queste due regioni, e tutto dipende da un'attivazione

o una repressione.

Es. Operone lac

Dobbiamo scegliere nel nostro vettore di espressione un promotore adatto.

Come lo scelgo il promotore a monte di un gene che voglio esprimere in grandi quantità?

Metto un promotore forte in maniera tale che la RNA polimerasi trascriva tanto mRNA.

La verità è un'altra..

E' meglio non fare così, perchè se da subito faccio esprimere ad una cellula batterica tantissima

proteina eterologa, la cellula tanto bene non starà...

La proteina che faccio esprimere nel mio vettore di espressione, potrà diventare anche il 5-10%

delle proteine totali.

Non si sa se la proteina è tossica o meno, soprattutto se la cellula batterica non la esprime.

Quando si mette una coltura batterica a crescere se si parte da una concentrazione di cellule in

fase lag che esprimono subito la proteina,queste muoiono e ottengo poca concentrazione di

proteina.

Quindi faccio in modo che i batteri crescano fino alla fase esponenziale e poi induco l'espressione

della proteina e devo usare un promotore inducibile, cioè un promotore che senza l'induttore non

esprime la proteina, quando ci metto l'induttore la esprime.

Es. promotori batterici dell'operone lac

Se io faccio in modo da mettere l'operone all'interno del promotore, viene legato i repressore, fino

a quando non inserisco una molecola che ci si può legare, quindi le cellule non esprimono la mia

proteina ricombinante.

Quando ho un numero sufficiente di cellule in coltura che mi possano produrre un numero di

proteine ricombinanti, anche se poi stanno male e muoiono, ma nel frattempo l'hanno prodotta.

si utilizza l'operatore lac, in un promotore.

La molecola che si usa per indurre l'espressione è un'analogo del vero substrato del

repressore(isopropiltiogalattoside) che commercialmente è più facile da produrre rispetto

all'allolattosio.

L'isopropiltiogalattoside è in grado di legare il repressore lac e di farlo staccare dall'operatore.

Metto le mie cellule a crescere, aspetto che arrivino in fase esponenziale, induco con

isopropiltiogalattoside, le cellule incominceranno a trascrivere il prodotto genico che è nel mio

vettore di espressione.

Che promotore utilizzo?

A questo punto utilizzo un promotore forte, perchè se ho un repressore che mi blocca la

trascrizione, non ho problemi.

Utilizzo un promotore che è l'unione del promotore dell'operone del triptofano che è un promotore

forte, più l'operatore dell'operone lac, e questo promotore viene detto tac.

Grazie a questo promotore, si è arrivato a produrre anche il 20-30% delle proteine totali.

Se ho bisogno di utilizzare l'operatore all'interno di un vettore, le molecole di repressore lac che mi

produce la cellula non sono sufficienti a saturare tutti i vettori di espressione che ci sono all'interno

della cellula, quindi si utilizzano ceppi che iperesprimono il repressore lac che è nel genoma del

ceppo.

Faccio si che il gene per il repressore lac sia iperespresso.

Se noi vogliamo evitare anche l'espressione basale, dobbiamo utilizzare ulteriori accorgimenti.

Posso utilizzare non più un promotore che riconsce la RNA polimerasi di E.coli, ma un promotore

che venga riconosciuto dalla RNA polimerasi del fago T7.

E.coli non ha la polimerasi del fago t7 a meno che non gliela inserisco io nel genoma, quindi se io

non esprimo la rna polimerasi del fago t7, non ci sarà trascrizione.

Metto il gene dell RNA polimerasi del fago t7 nel genoma di E.coli, sotto il controllo del repressore

lac.

Quando io metto l'induttore, l'operatore è anche a monte dell'rna poimerasi del fago t7.

Quando io metto l'isopropiltiogalattoside, comincia la trascrizione dell'RNA polimerasi che va a

riconoscere il promotore t7 che è monte del mio gene.

Riassumendo

I vecchi sistemi utilizzavano l'ibrido del promotore del trp e l'operatore lac ed erano riconosciuti

dall'rna polimerasi di coli.

Nei nuovi sistemi è stato cambiato ill promotore, non sono più le regioni -10-35, ma sono le regioni

-10-35 riconosciute dall'rna polimerasi del fago t7.

E' stato preso il gene dell rna polimerasi del fago t7 e a questo punto va inserito nella cellula

batterica nella quale voglio che avvenga l'espressione.

Ingegnerizzo prima il ceppo di E.coli, ci metto dentro il gene l'RNA polimerasi del fago t7,

controllata dall'operatore lac.

Quando induco l'espressione con isopropiltiogalattoside, si indurrà l'espressione dell'rna polimerasi

del fago t7, dpodichè una volta prodotta l'rna polimerasi del fago t7, andrà a riconoscere il

promotore che è presente nel mio vettore di espressione presente a monte del mio gene.Solo

allora il gene si esprimerà.

I ceppi che contengono la polimerasi dl fago t7 nel genoma si chiamano te3

Un ulteriore accorgimento per evitare che venga prodotta anche una singola molecola derivante

dalla trascrizione basale, faccio esprimere al mio ceppo di E.coli, il lisozima del fago t7, che si lega

all'RNA polimerasi dello stesso fago e ne impedisce il funzionamento( inibitore naturale dell'RNA

Polimerasi) finchè viene espresso il lisozima, quelle poche molecole di RNA polimerasi che

vengono comunque trascritte come espressione basale, sono bloccate dal lisozima( in bassa

quantità)

Quando l'RNA polimerasi sarà iperespressa, quindi si troverà in grandi quantità, le molecole di

lisozima, non sono più sufficienti per bloccarla e quindi la RNA polimerasi andrà a fare quel che

deve fare, cioè trascrivere i geni sul mio vettore di espressione.

I ceppi più utilizzati oggi si chiamano DE3bliss che impediscono qualunque espressione basale del

mio gene del vettore di espressione, ma consentono un'espressione ad alti livelli dopo l'induzione

con isopropiltiogalattoside.

I passaggi successivi sono la terminazione della trascrizione.

Se non metto un terminatore della trascrizione, l'RNA polimerasi mi trascrive tutto il plasmide,

quindi l'efficienza della trascrizione diminuisce.

Quindi avrei una molecola di RNA più lunga di quella che mi serve e quindi potrebbe darmi fastidio

nei passaggi successivi.

Se io voglio un'efficiente trascrizione, e avere l'RNA che mi serve, devo inserire anche un sito di

terminazione della trascrizione.

Se inserisco uno di questi segnali nel vettore ( Rho dipendente e Rho indipendente) io favorisco

l'efficienza della trascrizione.

La traduzione

Come favorisco la traduzione in E.coli e cosa serve a E.coli per iniziare la traduzione?

La sequenza di Shine dalgarno, cioè la sequenza di legame ai ribosomi, che si trova ad una

distanza ben precisa dal'AUG.

Devo fare in modo che la sequenza di Shine dalgarno sia alla giusta distanza dall'AUG(5-9 bp) del

mio gene che sto andando ad inserire nel mio vettore di espressione.

Il mio vettore di espressione sarà fatto dai classici elementi presenti nei vettori di clonaggio( origine

di replicazione e una resistenza all'antibiotico, perchè si deve comunque poter duplicare altrimento

lo perdo e devo comunque avere un marcatore di selezione, perchè se in un vettore non c'è un

marcatore di selezione e non costringo alle cellule ad esprimere il gene per la selezione, esse

mano a mano che vado avanti nella duplicazione, perderanno quel plasmide.

Se ad esempio in un vettore metto la resistenza all'ampicillina, se pesco le cellule senza

ampicillina, le cellule perderanno il vettore, perchè non gli serve più.

Non sono devo metttere il marcatore di selezione, ma devo sempre crescere le cellule in presenza

di antibiotico, in maniera tale che devono essere costrette a duplicare il vettore e a mantenerlo

nelle duplicazioni.

Un'altra cosa alla quale devo fare attenzione è la stabilità del prodotto proteico.

Non tutte le proteine hanno la stessa emivita.

La quantità di proteina che otterrò dipenderà da vari fattori

-Sua stabilità intrinseca

Come posso migliorare l'emivita?

Vado a vedere qual è l'amminoacido iniziale, visto che l'amminoacido iniziale condiziona l'emivita

di una proteina.

Ma l'aminoacido iniziale non è sempre la metionina?

No, perchè in E.coli, la metionina iniziale viene eliminata da peptidasi spefici, quindi non la

ritroviamo più.

Quindi non è il primo, ma il secondo amminoacido deve essere preso come riferimento per vedere

la stabilità del prodotto e dovrei anche modificarlo per rendere il prodotto proteico più stabile.

Anche la composizione al C terminale e non solo quella all'N terminale può influenzare la stabilità

della proteina.

Anche la presenza di sequenze PEST( sequenze ricche di prolina,glutammato, serina, treonina)

Se all'interno di una proteina sono presenti queste sequenze, che normalmente vengono

riconosciute da proteasi di degradazione si fa in modo da modificare queste sequenze per rendere

il prodotto più stabile.

L'uso dei codoni.

Se io per un aa.a ho a disposizione 4 codoni, a volte anche 6 codoni non è detto che l'organismo li

usi tutti, quindi non esprima tutti i tRNA che porta tutti questi codoni, visto che alcuni codoni sono

sottoutilizzati

Su 4 codoni, E.coli potrebbe utilizzare meno uno e più un altro.

Negli eucarioti la situazione è ribaltata.

Prima di utilizzare un organismo ospite, devo studiare il codon usage di un organismo e il codon

usage di un altro.

Se ci si accorge come accade per alcuni codoni utilizzati nei geni umani che sono poco utilizzati in

coli. non ci possiamo aspettare di avere una gran quantità di prodotto proteico, perchè se è poco

utilizzato,il tRNA che riconosce quel codone sarà espresso in quantità molto basse, quindi lo step

limitante della traduzione sarà la presenza del trna.

Sono stati ingenerizzati dei ceppi di coli, ceppi rosetta, che esprimono dei tRNA che sono più

utilizzati dai mammiferi, così si migliora l'efficienza di traduzione e la quantità di prodotto proteico.

O si aggiungono i tRNA o si potrebbe modificare la sequenza ( mutagenesi, procedura molto più

difficile)

Un altro modo per evitare la degradazione delle proteine è eliminare le proteasi di coli

Tutte non si possono eliminare, ma quelle più espresse sono state eliminate e quindi ci sono alcuni

ceppi bliss sono mutati nella proteasi 8( una più espressa in coli.)

Devo arrivare ad ottenere un prodotto funzionale ed attivo.

Devo avere una struttura nativa e non devee essere denaturata.

Cosa può accadere?

Nell'ambiente batterico, il prodotto non potrebbe avere un folding corretto, potrebbe aggregare e

precipitare nei cosiddetti corpi di inclusione.

Si formano in E.coli, precipitati di aggregati proteici lì troviamo la nostra proteina.

Che facciamo?

-devo solubilizzarla usando un detergente

-Agenti caotropici(urea guanidina), se uso l'SDS

devo usare un solubilizzante che dopo può essere allontanato e la proteina deve rinaturarsi, se

uso l'sds, una volta legata all'sds non si rinatura più.

Devo usare un agente che posso allontanare(urea, guanidina)

Come posso allonanarlo?

Con la dialisi

Come posso aiutare la proteina a rifoldare correttamente?

glicerolo, aa che aiutano la rinaturazione, ma non c'è un protocollo standard

Se io so che il folding di questa proteina necessita dell'HSP70, posso utilizzare dei ceppi

commerciali che iperesprimono groel così posso cercare di migliorare il folding, evitando che vada

in corpi di inclusione.

Posso migliorare il folding della proteina riducendo la temperatura di crescita di coli, cioè se lo

faccio crescere più lentamente(temperature troppo alte non fanno bene al folding delle proteine)

soprattutto se non stanno nel loro ambiente ideale.

Se rallento il tutto, posso sperare che la proteina riesca a raggiungere la sua struttura nativa.

Se la proteina ha ponti disolfuro (che si formano nel periplasma) devo far formare ponti disolfuro

corretti, con chaperon, se no la proteina sicuramente andrà a finire nei corpi di inclusione.

PDAeuc

DSDpro

Se prendo il peptide segnale che le indirizza verso il periplasma, e lo metto nel mio vettore di

espressione, a monte della mia sequenza genica, il mio prodotto finale sarà una proteina con un

peptide segnale, che manderà la mia proteina di overespressione nello spazio periplasmatico, che

forma i corretti ponti disolfuro.

Dopo, a valle, si inserisce un sito di proteasi, in modo che il peptide segnale se non viene già

proteolizzato nel periplasma di coli, lo posso eliminare a posteriori, cosi che avrò solo la mia

sequenza PROTEICA

L'obiettivo non è soltanto produrre la proteina, ma quindi bisogna anche allontanare le altre

proteine dell'ospite.

Dobbiamo distinguere due strategie anche se la prima oggi non si usa quasi più

Se noi pensiamo ad una proteina nella sua conformazione nativa pensiamo ad una proteina che

abbia la struttura primaria esattamente identica a quella della proteina di cui stiamo parlando

senza modifica né

aggiunta nè delezione di a.a.

Quando si fanno le proteine ricombinanti bisogna trovare dei compromessi, quindi a volte bisogna

fare a meno di qualche a.a. che è fondamentale per la struttura terziaria, per raggiungere un altro

scopo per raggiungere un prodotto più pulito. Se non voglio cambiare la struttura primaria di una

proteina, io posso farlo e posso esprimere la proteina in un vettore di espressione come quelli che

abbiamo visti.

Prendo un vettore con tutte le caratteristiche( promotore, terminazione,RBS..)

Che cosa vado a mettere dentro questo vettore?

Non metto il gene (che comprende una serie di sequenze che non ci servono) non posso

metterlo,ma devo mettere la sequenza codificante.

Come mi procuro la sequenza codificante?

MI procuro la sequenza codificante dall'mRNA.

A partire dall'mRNA posso ottenere tramite l'utilizzo delle trascrittasi inverse, il cDNA e da lì posso

ottenere il mio prodotto di cDNA semplicemente però la regione compresa tra l'AUG e lo stop.

Se metto altro vado ad alterare la distanza del promotore del vettore batterico con l'inizio di

trascrizione o con l'RBS o con l'AUG.

....Devo partire dall'AUG e finire con lo stop.

Una cosa che devo fare è metterla nella giusta cornice di lettura, cioè far in modo che le triplette

vengano lette così come sono lette nella proteina nativa.

I vettori di espressione per proteine native mi vengono in contro fornendomi un sito di clonaggio

che è costituito dall'enzima nco o dall'enzima nde che fornisce l'AUG.

All'interno di nco c'è l'AUG, se io faccio in modo da clonare l'AUG della proteina nel sito nco, io

posso ottenere il mio cDNA nella corretta posizione per esprimere la proteina.

Ho ottenuto il mio prodotto proteico, cioè la mia proteina con la stessa sequenza con la quale la

produce l'organismo dal quale l'ho presa.

La devo purificare, cioè devo allontanare tutte le proteine dell'ospite. Come si può fare?

Si può precipitare con il Salting in o con il Salting out, o per isoelettrofocalizzazione.

Possiamo giocare sulla solubilità delle proteine.

Un sale che si utilizza molto in queste tecniche è il Solfato d'ammonio.

Un'altra tecnica è la precipitazione frazionata, quindi separo alcune proteine da altre, quindi o

prendo il surnatante o il precipitato, ma solo queste tecniche non serviranno.

Successivamente dovrò affinare la purificazione,potrò utilizzare la cromatografia di affinità ( se ne

ho a disposizione l'anticorpo, è la cosa più pulita che mi permette di allontanare parecchie altre

proteine) e dovrò andare avanti con cromatografia a scambio ionico, cromatografia a gel

filtrazione.

Un processo di purificazione di una proteina nativa può essere, un processo molto lungo e

laborioso e potrei non riuscire a separare proteine simili tra di loro.

Se non si può fare la cromatografia di affinità con un anticorpo si può scegliere un ligando diverso.

Aggiungendo alla proteina con un tag, un pezzo in più.

Uno dei tag più utilizzati è la coda di istidine, una serie di istidine, perchè 6 istidine chelano bene i

metalli divalenti per esempio il nichel.

Faccio una cromatografia di affinità per purificare queste proteine su una colonna che possa legare

nichel

Com'è fatto un vettore di espressione che deve contenere un tag?

Quando faccio una proteina di fusione, devo stare attento perchè la mia sequenza codificante sia

nella giusta cornice di lettura con la regione codificante per il tag che sto aggiungendo.

Il tag si può aggiungere all'N-terminale o al C-terminale.

Se conosco la mia proteina, posso scegliere una delle due posizioni.

Se il vettore mi consente di inserire la coda di istidine all'N terminale quindi come tutti i vettori di

espressione dei batteri, ha l'operatore per il legame per il repressore lac, ha il RBS, l'AUG e ha 6

codoni per l'istidina.

Dopo di che c'è un sito di riconoscimento per il fattore 10 che è una proteasi ( perchè dopo che ho

fatto la purificazione potrei voler eliminare il tag, non sempre influente sull'attività della proteina)

In molti vettori tra il tag e il multiplecloneinside è inserito il sito di riconoscimento per la proteasi.

Qui devo scegliere come inserire il mio cDNA per fare in modo che sia in frame( nella giusta

corrnice di lettura) con tutto il resto, perchè sono tutte triplette codificanti per a.a

Dovrò vedere che enzima di restrizione dovrò usare per fare meno danni alla sequenza della mia

proteina

Come si purificano le proteine con code di istidina?

Le proteine con code di istidina si purificano su resine di affinità che sono state derivatizzate con

l'acido nitriloacetico, che è in grado di coordinare il nichel in quattro dei siti di coordinazione, per

cui rimangono altri due siti liberi che possono essere coordinati dalla mia coda di istidine.

Non è detto che questo passaggio sia sufficiente per purificare al 100% la mia proteina, perchè

tutte le proteine che legano metalli, possono legare questa resina e ovviamente in un batterio

come in qualsiasi organismo ci sono proteine che legano cationi divalenti che possono competere

per il legame con la resina con la mia proteina.

La PCR

Mullis non ha inventato niente di nuovo, ma ha messo a punto una sintesi del DNA per sintetizzare

una regione definita.

I COMPONENTI di cui parlava Mullis sono:

Un campione contenente il DNA-BERSAGLIO che si intende amplificare (in teoria è sufficiente una

sola molecola).

Una coppia di corti PRIMER di DNA a singolo filamento.

I quattro DEOSSI-NUCLEOSIDI TRIFOSFATI (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

L'enzima, DNA-POLIMERASI.

Un tampone contenente IONI MAGNESIO, necessari per il funzionamento della

DNA-polimerasi.

Le fasi della reazione di PCR

Si presume che debba conoscere per lo meno le estremità della sequenza che voglio sintetizzare.

Devo disegnare due oligonucleotidi primer che ibridizzino in due regioni sufficientemente distanti

nel DNA che voglio amplificare.

Il primo passaggio è la denaturazione del DNA (90-95°C da 1 a 10 min)

Il secondo passaggio è consentire l'appaiamento dei primer allo stampo, cioè far si che i primer

ibridizzino a ciascun dei due filamenti.

Il terzo passaggio è l'estensione dei filamenti di neosintesi su quelli stampo.

Che molecole di DNA ottengo nei primi cicli e che molecole ottengo da un certo momento in

poi?

Nel primo ciclo ho i due filamenti stampo che si separano e ho gli oligonucleotidi primer che

ibridizzano ciascuno ad uno dei due filamenti.

Alla fine del primo ciclo non ho amplificati ad estremità definite.

Ho un filamento che inizia dal 5' e l'estremità 3' non è definita.

Nel secondo ciclo le molecole amplificate fungeranno da stampo per un'altra sintesi di DNA.

Cosa ottengo?

Ottengo un 5'-3' come era prima, di nuovo ho ibridazione dell'oligonucleotide primer e di di nuovo

ho sintesi di un filamento con estremità non definita.

Soltanto nel terzo ciclo inizio ad avere dei prodotti ad estremità definite.

Andando avanti nella reazione, le copie ad estremità definite aumentano in maniera esponenziale,

quella ad estremità variabile aumentano solo in maniera lineare.

Le estremità lunghe non aumentano, quindi per ogni ciclo, i filamenti interi ne ho sempre una sola

copia, quindi aumentano in maniera lineare nel tempo.

Delle estremità definite aumentano esponenzialmente.

I reagenti

Il magnesio: a concentrazioni troppo basse di magnesio la polimerasi non è attiva, mentre a

concentrazioni troppo alte la reazione perde specificità e vengono sintetizzati prodotti multipli, la

concentrazione giusta deve essere messa a punto

In genere è compresa tra 1 e 5 mM

Il tampone e il sale (Tris e KCl) sono mantenuti costanti

Per evitare evaporazione durante le fasi ad alta temperatura si stratifica olio minerale sulla miscela

di reazione, oppure si utilizzano macchine con il coperchio riscaldato, quindi la concentrazione dei

reagenti non è sempre la stessa.

I tempi di denaturazione e di appaiamento sono in genere di 30 s, quelli di estensione variano a

seconda della lunghezza del frammento da amplificare e della velocità della polimerasi

Il numero di cicli dipende dalla quantità di stampo iniziale e dalla quantità di DNA necessario, ma in

genere variano da 17 a 30.

Le prime PCR, effettuate utilizzando il frammento di Klenow, erano molto inefficienti perché,

essendo termolabile, doveva essere rimpiazzata ad ogni ciclo di amplificazione

Un significativo miglioramento della PCR si deve all’introduzione di un nuovo tipo di polimerasi

termostabile isolata da Thermus acquaticus, un batterio isolato nelle pozze termali.

Questa polimerasi ha un optimum a 72°C e resiste alle alte temperature usate negli step di

denaturazione permettendo l’automatizzazione dell’intera procedura, oltre che un deciso

miglioramento della specificità della reazione.

La Taq polimerasi, tuttavia, è priva di attività proof reading ed incorpora, in media, una base

sbagliata ogni 10000 sintetizzate (1,1 x 10-4).

Anche se questa caratteristica non è rilevante nelle tecniche analitiche può essere un

grosso problema nei clonaggi.

Esistono in commercio DNA polimerasi termostabili con attività di proof reading (Pfu (Pyrococcus

furiosus) con tassi di errore più bassi, fino a 1,6 x 10-6, che andrebbero usate nei clonaggi

molecolari.

Il problema delle contaminazioni è un problema fondamentale nella messa a punto di una reazione

di PCR.

Devo prendere tutte le precauzioni, quindi anche gli aerosol possono essere contaminanti.

Quello che posso fare è utilizzare materiali sterili, e non devono essere mai toccati con le mani.

Inoltre si utilizzano puntali con il filtro che non consente il passaggio del materiale dalla pipetta alla

soluzione.

La decontaminazione di materiale di laboratorio non si può fare in autoclave ma sotto i raggi UV

che formando i dimeri di timina, rendono il DNA presente per sbaglio su una eppendorf, non

amplificabile.

Il DNA genomico contiene al suo interno anche sequenze molto simili tra di loro, quindi per evitare

questo, quando disegno dei primer, essi possano andare ad ibridizzare su sequenze omologhe

all'interno del mio stampo.

Devo giocare sulla temperatura di annealing perchè un ibrido di questo tipo, sarà meno stabile

rispetto all'ibrido in cui il primer appaia con tutte le sue basi.

Aumentando la temperatura di ibridazione, aumento la specificità del prodotto di PCR.

Oggi per evitare che la sintesi da parte della polimerasi inizi anche senza la temperatura di

reazione per la PCR adeguata, visto che può succedere che la reazione possa iniziare a

temperatura ambiente anche se la Taq ha un optimum a 72°C , si usano delle polimerasi op-start

che hanno bisogno di un ciclo a temperatura di 90-95°C per sbloccare la loro attività polimerasica.

Sono bloccate con vari metodi

Inglobate in palline di cera

Bloccate da anticorpi che sono disattivati quando si innalza la temperatura

La AmpliTaq Gold™, una polimerasi modificata chimicamente che rimane inattiva fino a quando la

temperatura non viene portata a 95°C per 5’.

Quando si amplificano DNA antichi c'è molta probabilità di contaminazione visto che i cicli sono

molti in quel caso.

La riuscita o meno della PCR dipende da come abbiamo disegnato gli oligo-dt

Devono essere complementari ai filamenti, in maniera tale che il 3' vada in direzione di

amplificazione.

Deve essere compreso tra i 17 e i 30 nucleotidi, perchè la stabilità dell'ibrido dipende dal contenuto

G:C e dalla lunghezza dell'oligo, nè eccessiva nè troppo bassa.

Dovrò mantenere una Temperatura di 65°C ma sufficientemente alta da non consentire ibridazioni

con sequenze non omologhe, quindi almeno 50-55°C.

Lunghe ripetizioni di un singolo nucleotide dovrebbero essere evitate.

Non devono contenere sequenze che possono formare hairpin.

Non ci deve essere complementarietà tra i due primer.

La Nested PCR è una variante della tecnica di PCR che consiste nell’utilizzo di due coppie di

primer, una esterna che genera un normale prodotto di PCR ed una coppia con primer all’interno

del prodotto amplificato:

Se il prodotto di amplificazione fosse aspecifico la seconda PCR non andrebbe a buon fine.

Alla fine della reazione di PCR come faccio a verificare se l'amplificato era quello giusto?

Faccio una corsa elettroforetica e vado a vedere se il peso molecolare è quello giusto.

POtrei avere che ci sono più bande, cioè che ho amplificato più cose.

A questo punto che faccio?

Riparto e cambio la temperatura di annealing dei primer

Oggi nelle macchine di PCR è possibile lavorare in gradiente di temperatura

Fare contemporaneamente 12 reazioni diverse, mettendo la stessa miscela di reazione, con

temperature di annealing, differenti anche di 0,2 °C.

RT-PCR (Reverse-Transcriptase-PCR)

Perchè retrotrascrivere?

La retrotrascrizione si usa ogni volta che voglio isolare un mRNA per studiarne la sequenza, per

clonarlo in un vettore.

Il DNA è molto più stabile dell'RNA e quindi nel tempo avrò un prodotto che non si degraderà.

Come per tutte le reazioni di sintesi di DNA abbiamo bisogno di un oligo primer

Qui viene utilizzato come oligo primer, un oligo-dt perchè se il presupposto è che voglio i

messaggeri di un organismo eucariote, partendo dall'oligo-dt, sono sicuro di ibridizzare al 3' di tutti

i messaggeri.

Se per esempio voglio analizzare altre molecole di RNA che non sono mRNA, non posso utilizzare

gli oligo-dt, quindi se voglio una retrotrascrizione di tutti gli RNA che ci sono nel campione, senza

distinguere tra messaggeri e non, non utilizzerò gli oligo-dt ma gli oligorandom, cioè una miscela di

oligonucleotidi (esanucleotidi) che sono disegnati in maniera tale che statisticamente ibridizzano su

tutte le sequenze, così ho la possibilità di iniziare la reazione di retrotrascrizione da un qualunque

punto di una qualunque sequenza di RNA.

Quali sono i vantaggi e gli svantaggi di un oligo-dt o di un oligo random

Se voglio per lo meno sperare di avere tutto il cDNA devo usare un oligo-dt perchè se utilizzo un

oligo random, sarò sicuro di ibridizzare all'interno e non ad un'estremità.

Non è detto che se utilizzo un oligo-dt la retrotrascrittasi arrivi fino alla fine.

Se il mio messaggero è molto lungo, può anche essere che la retrotrascrittasi si fermi prima e che

quindi non riuscirò ad ottenere un DNA complementare che è lungo quanto il mio mRNA.

Se voglio statisticamente tutti i miei pezzetti del mio mRNA, mi conviene utilizzare gli oligo-random.

5'RACE

Se ho il pezzo di una sequenza di un gene e mi rendo conto che ho una coding alla quale manca

un AUG vuol dire che mi manca una regione codificante al 5' .

Si basa essenzialmente sulla PCR

Ho il mio mRNA del quale conosco una regione al 3' (coda di poli A) e non conosco la regione al

5'.

Nella regione che conosco posso disegnarmi un oligo gene specifico, quindi un oligo

complementare alla regione di cDNA che conosco.

Quando prendo un mRNA totale e faccio una retrotrascrizione, o con gli oligo-dt o con gli oligo

random, io retrotrascrivo tutto cio che ibridizzerà con quell'oligo che ho usato come primer, quindi

avrò comunque una miscela di cDNA, se uso un oligo gene specifico, che è disegnato sul mio

gene, arricchisco il mio gene.

Questa metodica non è un'amplificazione, ma successivamente si amplifica.

Inizialmente si crea un innesco gene specifico e si aggiunge una coda di poli A.

Le contaminazioni sono sempre in agguato.

Bisogna fare un secondo passaggio della bontà della prima reazione.

Il controllo per una PCR, specifica per un gene di mio interesse, è una PCR con i primer annidati,

cioè con primer più interni a quelli che ho utilizzato per essere sicuro che ho amplificato il pezzo

giusto.

In questo caso ne faccio solo uno di primer annidato.

3' RACE

E' più semplice perchè non ho bisogno di aggiungere la coda omopolimerica, perchè ce l'ho

naturale.

MI manca un'informazione al 3' del mio mRNA, vuol dire che conosco la sequenza al 5' e mi

manca l'informazione alla coda di poli A.

In questo caso utilizzo l'oligo dt per fare la retrotrascrizione perchè è l'unico che mi da la sicurezza

di retrotrascrivere questa regione.

Primo passaggio di retrotrascrizione

Oligo-dt come oligo primer

Secondo passaggio di amplificazione

Oligo gene specifico disegnato sulla regione al 5' che conosco.

Per la verifica, mi disegno un oligo un po' più interno al primo, e faccio il secondo gruppo di

amplificazione con il primer annidato.

Se devo amplificare un gene, in un organismo dove non è stato ancora clonato da che

informazione parto?

Si fa un allineamento di sequenze proteiche con organismi quanto più vicini possibili

evolutivamente, si identificano le regioni conservate.

FAccio tutte le possibili combinazioni, cioè sintetizzo tutti oligonucleotidi degenerati, cioè ho una

miscela di oligonucleotidi.

Non posso utilizzare condizioni di alta stringenza, quando riesco ad avere un prodotto più o meno

specifici.

La prima cosa più banale è quando vogliamo creare il nostro vettore di espressione

Il primer per funzionare ha bisogno di un innesco stampo perfettamente appaiato al 3', quindi

posso disegnare un oligonucleotide primer, sufficientemente lungo da avere un sufficiente numero

di nucleotidi appaiati esattamente al mio stampo e quindi da assicurarmi l'amplificazione, più un

altro numero di nucleotidi che non si appaiano ed includere questi nucleotidi nel mio prodotto di

amplificazione.

Mutagenesi sito puntiforme tramite overlap extension.

Tramite PCR si riesce a vedere se la mutazione di un solo a.a.la proteina è o non è più funzionale.

Malattie geniche

Malattie dovute a mutazioni somatiche

Malattie genetiche

Malattie trasmesse geneticamente

Per diagnosticare la Leucemia mieloide cronica, dovuta a mutazioni dei geni bcr e abl, si crea un

primer e lo si fa ibridizzare e se è presente amplificato significa che c'è la mutazione.

Il DNA fingerprinting

Il DNA fingerprinting significa associare un campione di DNA ad un singolo organismo, visto che

ogni persona ha regioni specifiche di DNA.

Il nostro DNA è fatto per una piccola parte di DNA codificante ma in gran parte da sequenze

ripetute( più lunga è la sequenza ripetute, più basso è il numero di ripetizioni)

DNA Microsatellite

DNA minisatellite

Se ho queste sequenze che si ripetono in un numero variabile di ripetizioni, se taglio il DNA su quel

locus genico, se ho 10 ripetizioni e prendo un enzima di restrizione a monte e uno a valle di quel

locus, conosco la sequenza, conosco il VNTR, so quante basi è lungo.

Se prendo quel VNTR, taglio a monte e taglio a valle, nel mio caso avrò un frammento di una certa

lunghezza, nel suo caso un frammento diverso.

Posso andare ad analizzare la lunghezza dei frammenti , avrò un polimorfismo di lunghezza di

frammenti di restrizione.

Posso ottenere frammenti con digestioni enzimatiche, che avranno una lunghezza diversa.

Se analizzo diversi di questi VNTR, più analizzo, più la probabilità di errore diminuisce perchè può

anche capitare che in un locus avrò lo stesso numero di ripetizioni.

Se taglio il DNA poi faccio un elettroforesi per avere un’informazione di tipo qualitativo

Quando non posso fare il DNA fingerprinting visto che ho poco DNA posso utilizzare la PCR,

utilizzando il DNA microsatellite, visto che i polimorfismi per un locus sono diversi.

Altre applicazioni della PCR:

Per l’analisi quantitativa di acido nucleico ed è possibile quantizzare il DNA sia il RNA con una

reazione di retrotrascrizione perché è utile quantizzare l’RNA quando voglio andare a valutare i

livelli di uno specifico trascritto in genere in condizoni in paragoi tra di loro. Esempio prendo un

campione di un tessuto sano ed un campione di un tessuto malato voglio vedere se è variata

l’espressione di questo gene.

In generale voglio vedere le variazioni di espressione genica a livello trascrizionale.

Il controllo della trascrizione puo’ avvenire a vari livelli ma quello piu’ utilizzato è all’inizio della

trascrizione ma non solo ci sono anche altri step come dopo la trascrizione o inizio traduzione o

dopo.

Quando vado ad analizzare i livelli trascrizionali di un trascritto sto soltanto guardando i primi livelli

dell’espressione genica cioè tutto cio’ che riguarda l’aumento di un mRNA.

Se voglio andare a vedere un controllo POST-trascrizionale e che non vada ad influenzare i livelli

di trascritto una metodica come la real time non serve ,devo andare a visualizzare i livelli della

proteina o l’attività stessa della proteina.

Non è detto che se variano i livelli di trascritto varino anche i livelli di proteina attiva; quando si fa

una analisi si deve essere consapevole dei limiti di una tecnica.

Abbiamo visto una metodica con la quale analizzare un trascritto specifico :

Northen Blotting- trasferire su filtro ed andare con una sonda specifica ,mi consente di analizzare

la quantità di uno specifico trascritto consentendomi anche di valutare il PM e quindi di visualizzare

eventuali trascritti multipli di un gene (splicing alternativo)

Le modifiche della PCR possono essere utilizzata per una analisi quantitativa di un trascritto

PCR Semi-quantitativa

Prendo i miei reagenti li metto nel tubo ,lo strumento della macchina programmabile che mi

amplifica per n volte lo strumento salirà e scenderà con la temperatura consentendo

denaturazione,ibridazione ed elongazione. Potrei prendere il prodotto della PCR e su un gel di

agarosio e valutare l’intensità della banda Se io ho tot copie nel campione di controllo e 10 per n

nel campione malato che sto analizzando,per esempio.

Quando vado ad amplificare dovrei avere piu’ prodotto ed il principio è vero ma puo’ in una PCR

classica dove analizzo solo la fine della PCR puo’ succedere che se non c’è differenza tra i due

campioni non vedo differenze perché la reazione non ha un andamento esponenziali in una

provetta ,dovrei materiali infinito da somministrare alla Taq !!!!

I dnTp sono instabili , quando i prodotti di PCR sono tanti ,essi competono anche con con se stessi

dopo un certo tempo e ri-ibridizzeranno tra di loro nell’annealing.

Si arriva in una fase di stato stazionario dove c’è una saturazione dove non è piu’ possibile

distinguere campioni che partivano da concentrazioni di stampi diversi.

L’unica differenza la posso vedere quando la concentrazione dei due campioni è enorme.

Le due reazioni nel maggior parte dei casi raggiungeranno la stessa fase stazionaria e non posso

analizzare piu’ la PCR in questa fase ma devo analizzarla nei primi cicli della fase esponenziale,

devo fare tante reazioni di PCR fermandole a cicli diversi . L’amplificato sarà comunque poco da

essere visualizzato in gel di agarosio con bromuro di etidio (perché il limite di sensibilità è 10 ng di

DNA) se non sono ancora arrivato a quel limite ma se il DNA C’è posso fare un Southern : se

trasferisco su un filtro e utilizzo una sonda radiattiva riesco ad analizzare quantità anche molto

piccole su filtro di DNA e quindi dovrei prelevare cicli a sufficientemente basi di 5,10 o 15 di

amplificato i campioni fare un Southern blot ed una ibridizazione del mio amplificato ed andare a

vedere le eventuali differenze che ci possono essere tra i 2 campioni,cosa abbastanza complessa.

PCR Competitiva

Posso prendere una coppia di primer che amplifichi il mio target ma anche un DNA competitore

(vedere slide per schema) e quindi mi devo essere costruito apposta in maniera tale che i due

primer possano ibridizzare su DNA COMPLEMENTARE.

Se ho del DNA competitore a concentrazione nota ,se questo, a concentrazioni crescenti avro’

amplificati screscenti se io diluisco a mano a mano il mio campione avrà concentrazione uguale al

mio competitore quindi avrò una quantità di amplificato simile per entrambi i DNA . E’ il mio

campione ad essere diluito non il DNA competitore che è nella stessa quantità questo vuol dire che

è quella la mia concentrazione al mio stampo .

Avro’ una banda piu’ intensa del mio campione rispetto al DNA competitore se è di piu’ .

Lo stampo in quantità maggiore verrà sottratto piu’ oligo all’equilibrio ottenendo piu’ amplificato.

Lo svantaggio è che devo analizzare il mio RNA costruendo un DNA competitore e poi devo fare

anche diluizioni su gel ed ecco perché la metodica è stata abbandonata.

Real Time PCR

Dove posso analizzare ciclo per ciclo il mio prodotto di amplificazione ,senza passare per una

analisi di elettroforesi analizzando nella soluzione di amplificazione il mio amplificato. I sistemi di

Real-Time PCR si basano sulla rilevazione e quantificazione di un reporter fluorescente per

monitorare ciclo per ciclo la PCR nel mio tubo per PCR .I fluorofori sono rilevati e sono processati

di campioni tutto insieme. Tutte le righe colorate della curva sono campioni che partivano da

quantità di stampo diversi ed hanno cominciato l’inizio

della loro fase esponenziale in processi diversi.

L’intensità del segnale prodotto dal fluoroforo è proporzionale alla quantità del prodotto di PCR.

Il fluoroforo piu’ utilizzato è il SYBR green perché è una molecola fluorescente che si intercala

nella doppia elica indipendentemente dalla sequenza, è un fluoroforo aspecifico che va bene per

tutte le reazioni di PCR Esso non si intercala alla doppia elica nella fase di denaturazione al DNA,

ma nella fase ibridazione il primer si lega allo stampo ed anche le molecole di fluoroforo ,a mano a

mano che la sintesi procede un numero maggiore di fluorofori quando ibridizzo si legano al DNA.

Quando è corretto rivelare la fluorescenza? Essa si rileva nella fase finale della sintesi . Ho i miei

cicli per programmare ed alla fine del minuto di erogazione imposto alla macchina di fare una

lettura di fluorescenza , ed alla fine di ogni ciclo di amplificazione avro’ una lettura di fluorescenza.

FRET

La Fluorescence Resonance Energy Transfer (trasferimento di energia per risonanza dovuta a

fluorescenza)

permette di individuare e caratterizzare con estrema precisione la distanza tradue molecole. Il

meccanismo sfrutta la presenza di due molecole fluorescenti nella mia soluzione ,dette donatore e

accettore. Il donatore può essere eccitato ad una specificalunghezza d’onda. Tale molecola emette

energia che, a sua volta, può essere trasmessa all’accettore, in grado di conseguenza di emettere

una fluorescenza visualizzabile dall'operatore. Tale processo avviene in modo ottimale solo se le

molecole sono a distanza ragionevolmente ristretta.

Una molecola fluorescente viene eccitata a livello energetico piu’ alto, decade ad un livello

intermedio e poi emette luce ad una lunghezza d’onda superiore a quella alla quale aveva

assorbito (energia piu’ bassa)

Ci sono le lunghezze di onda in questo grafico di eccitazione ed emissione del donatore e di

eccitazione e di emissione dell’accettore. Posso avere FRET quando l’emissione del donatore si

sovrappone all’eccitazione con quello dell’accettore. Se queste due non avessero avuto una

regione di sovrapposizione non avrei avuto fluorescenza per risonanza .Questa FRET consente di

vedere due fluorofori abbastanza vicini nello spazio, ammesso che ho un donatore con eccitazione

compatibile con l’accettore devono essere sufficientemente vicini allora l’accettore puo’ assorbire

l’energia dal donatore. Se io programmo lo strumento ad una lunghezza d’onda programmabile

solo per il donatore perché devo evitare di eccitare l’accettore,questo deve essere eccitato solo dal

donatore.Devo mettermi,poi, ad una lunghezza d’onda intorno ad una certa lambda per rilevare

SOLO l’accettore : se ho un segnale c’è stata FRET

SONDE di IBRIDAZIONE: sonde specifiche per la Real time. Il SYBR green è un colorante

aspecifico che lega tutti i tipi di DNA doublestrand. E’ abbastanza economico ma ibridandosi non

consente di vedere le amplificazioni aspecifiche e non posso sottrarlo al segnale di fluorescenza.

Sonde Fret

Due sonde oligonucleotidiche per l’amplificazione sequenza-specifiche ho bisogno di altri 2

oligonucleotidi INTERNI per il mio frammento da amplificare ,gli oligo interni devono ibridizzare

sullo stesso filamento e sono fatti in maniera tale da avere un fluoroforo accettore al 5’ ed un

fluoroforo donatore al 3’ dell’altro oligo. Quando sono liberi in soluzione non c’è risonanza di

fluorescenza perché non sono sufficientemente vicini. Quando i due oligo sono legati allo stampo i

2 fluorofori sono abbastanza vicini per dare FRET ed ho segnale di fluorescenza.

Denaturazione

Non viene rilevata fluorescenza: il colorantedonatore è eccitato dalla sorgente ed emette energia in

grado di eccitare l’accettore solo se la distanza fra i due è pari a 1-5 nucleotidi

Annealing: gli oligo sono ibridati allo stampo e nella fase di elongazione la polimerasi li spiazza e

non sono piu’ ibridizzati, si stacceranno dallo stampo e si possono allontanare. La rivelazione la

vado a fare non alla fine dell’elongazione ma alla fine dell’annealing perché abbiamo detto che

ogni amplificato funge da stampo per il successivo quindi piu’ oligo ibridizzate con i prodotti

dell’amplificato del ciclo precedent Viene registrata la massima fluorescenza

Sonde TaqMan Uno dei metodi più usati è il metodo TaqMan® basato sull’uso di un terzo primer

specifico per la regione amplificata ma modificato in modo da avere un fluorocromo al 5’ come

reporter (R) e un quencher (Q) al 3’. Ad ogni ciclo di amplificazione l’attività 5’-3’ esonucleasica

della polimerasi degraderà il primer modificato rilasciando il fluorocromo che, allontanato dal

quencher, emetterà fluorescenza

Per costruire una libreria, non posso partire dal genoma intero ma devo spezzettarlo in

tanti piccoli frammenti e clonarlo all'interno di un vettore di clonaggio e cercare di avere più

possibile tutti i pezzi di DNA che corrispondono all'intero genoma.

Prima scelgo come voglio frammentare e poi scelgo il vettore.

Esso può essere frammentato in vari modi:

1)Meccanicamente con un ago da siringa o con la sonicazione

2)Digestione parziale con enzimi di restrizione, andando al di sotto della sua capacità

catalitica quindi faccio la digestione per tempi più brevi o mettendo una quantità di enzima

che mi servirebbe per digerire tutto il DNA, esso in alcuni siti taglierà ed in altri no.

Per esempio se volessimo frazionare un genoma batterico di ~ 4 x 106 bp con un enzima

di restrizione con un sito di riconoscimento di 6 bp, per esempio Eco RI, che taglia in

media

ogni 4 x 103 bp, ci basterebbero 4 x 106 / 4 x 103 = ~ 1000 cloni per avere una libreria

rappresentativa.

Otterrò f che è il numero minimo di cloni teoricamente necessario per costruire una libreria

rappresentativa f = dimensione del genoma

dimensione del frammento

In pratica perciò al posto di f viene usato un parametro probabilistico detto N, visto che noi

ci avviciniamo ad ottenere una massima rappresentatività della libreria, e quindi

calcoliamo un a probabilità N che indica il numero di cloni indipendenti necessari per avere

una ragionevole probabilità di rappresentare ogni clone della libreria.

La seguente formula, proposta da Clarke e Carbon, può stimare con ragionevole

approssimazione il numero di cloni indipendenti che la nostra libreria deve contenere per

avere una probabilità P di contenere il clone di nostro interesse :

N = ln (1-P)

ln (1-1)

f

Dove P è la probabilità di avere un dato clone tra tutti i cloni e f è la frazione del genoma

rappresentato da un inserto medio (dimensione del genoma/inserto)

E’ ovvio che per costruire una libreria rappresentativa da un genoma di grosse dimensioni

cercheremo di clonare inserti di grosse dimensioni per diminuire il numero di cloni

necessari a rappresentare interamente il genoma. Questa aspettativa condiziona la scelta

del vettore che verrà scelto in funzione di questi parametri.

Se scegliessi un numero minore di cloni, creando una libreria in Cosmidi o in BAC, avrei

frammenti molto più grandi che per un genoma batterico dove la densità genica è molto

elevata, cioè non ci sono sequenze non codificanti o ce ne sono poche e non ho neanche

sequenze di DNA che potrebbero farmi pensare che un gene sia su decine di migliaia di

basi.

Si potrebbe fare una libreria in Cosmide o in BAC ma dovrei effettuare una subclonazione

e non conviene.

Per un genoma batterico userò o un plasmide o un Fago.

Ci sono possibilità, creando frammenti più piccoli, di perdere qualche informazione, ma il

problema si pone anche per frammenti troppo grandi, perchè se ho un pezzo di 2000bp

non ho risolto comunque niente, visto che devo suddividerli ancora in sottolibrerie.

Se passo ad un organismo più grande la libreria plasmidica e la fagica la scarto a priori,

perchè dovrei screenare milioni di cloni.

In questo caso si usano i Cosmidi, i BAC, gli YAC che possono contenere 2000kb ma

questa opzione viene scartata in genere per l'instabilità, la difficoltà nel maneggiare i

cromosomi artificiali di lievito e infine l'ultimo grande problema è il riarrangiamento, cioè si

venivano a trovare vicino regioni che in realtà non lo erano.

La prima cosa che faccio è frammentare il DNA, legarlo e clonarlo nel vettore che ho

scelto.

Cosa mi aspetto?

Da una libreria in plasmide di un batterio mi aspetto 4600 cloni diversi.

Prendo la ligasi, la trasformo nei batteri e piastro su tante piastre diverse andando a

contare i cloni della libreria o effettuo diluizioni.

Il numero di cloni che derivano dalla prima trasformazione sono i cloni indipendenti della

libreria, cioè che contengono tutti pezzi di DNA diverso.Dopo di che questa libreria è

instabile, può perdere il titolo e l'amplificazione è un'operazione molto delicata.

Librerie di cDNA

Poichè i genomi degli organismi eucariotici sono molto grandi, ma solo 1,5% sono

sequenze geniche, a volte può essere conveniente utilizzare librerie a cDNA:

Come costruisco una libreria di cDNA?

Partendo dall'RNA so già che questa sequenza è stata trascritta.

Dall'RNA mi produco il cDNA tramite la trascrittasi inversa, degrado l'mRNA (aumentando

il pH o mettendo l'RNAsi H)

I cDNA tendono a fare una struttura a forcina e spesso nelle librerie veniva utilizzata

direttamente la DNA polimerasi senza altro primer per avere il secondo filamento di DNA,

quindi una DNA polimerasi che allunga il 3', sintetizzando il filamento complementare,

successivamente la forcina si taglia con S1 che riconosce questa struttura.

Così si ottengono i vari pezzi di cDNA che devono essere clonati in un vettore di

clonaggio.

Qual è il problema di una libreria fatta così?

Se parto dagli oligo dT non sono sicuro di arrivare alla fine.

Sono sicuro di avere tutti i messaggeri che hanno una coda di poliA, ma non sono sicuro

di avere tutti i 5' del messaggero.

Potrei fare una libreria partendo dal cDNA costruito con oligo random, che possono

appaiarsi in qualunque punto dell'mRNA ed avrò più frammenti dello stesso cDNA che

partono da punti diversi.

Così ho più probabilità anche con la sovrapposizione di più cloni di coprire tutta la

sequenza del cDNA.

Da queste librerie e dagli screening fatti su queste librerie nascono le banche

nucleotidiche di EST, sequenze espresse, isolate in librerie di cDNA

Screening di una libreria tramite ibridazione.

Io cerco qualcosa ma devo avere un minimo di informazione nucleotidica, perchè devo

costruirmi una sonda.

Se conosco un pezzo della sonda che sto cercando posso costruirne una complementare

a quel pezzo.

Se non la conosco, voglio cercare un gene in un organismo nel quale non è stato ancora

identificato, ma quel gene si conosce in tanti altri organismi.

Vado a prendermi le regioni più conservate da un allineamento di sequenze note e mi

costruisco una sonda degenere su quella regione.

Ho tante colonie singole su una piastra, uso una membrana di nylon a forma di cerchio,

perfettamente sovrapponibile con la piastra, viene adagiata sulle colonie, parzialmente, in

modo che esse siano passate sul filtro.

A questo punto lo tratto con una soluzione alcalina in modo da denaturare e fissare il DNA

sul filtro, in maniera che nelle successive procedure non venga perso.

Esso viene trattato proprio come una membrana di southern o di northern, cioè la ibrido

con una sonda anche marcata radioattivamente.

Successivamente, dopo varie operazioni, espongo il mio filtro alla lastra radiografica e

ottengo dei segnali, posizionando la lastra sulla piastra, risalgo alle colonie che ha

ibridizzato con la mia sonda.

Dopo di che, metto a crescere i miei batteri ed effettuo un estrazione di DNA.

Il sequenziamento mi dirà se quei cloni sono dei reali positivi e se mi danno tutta

l'informazione.

Prendo la mia sequenza, vedo se essa codifica per la proteina che sto cercando e vedo se

ho tutta l'informazione.Se così non è, torno sulla libreria, mi costruisco un'altra sonda in

un'altra regione, più vicina alla regione che mi manca.

Screening di una libreria di espressione.

Se costruisco una libreria di cDNA e metto questi frammenti in un vettore di espressione,

posso fare anche esprimere il prodotto proteico, ovviamente non tutti i cloni daranno un

prodotto codificante perchè dipende come si è clonato il cDNA lì.

Se non è in frame non viene la proteina.

Posso sperare di avere un buon numero di cloni che esprimano almeno un pezzo di

proteina.

Lo screening delle librerie di espressione per esempio si faceva con screening

immmunologici, cioè si rivela con un anticorpo ( lo tratto come un western blot) e se uno di

questi cloni ha espresso la mia proteina, questa verrà riconosciuta dall'anticorpo.

Se non so la proteina come faccio ad avere l'anticorpo?

Ovviamente faccio un anticorpo contro un epitopo conservato in quella classe di proteine

che sto cercando. E' più specifico ma è più difficile che riesca.

Si può andare a screenare non con l'anticorpo, ma con la sequenza di DNA che quel

fattore di trascrizione deve riconoscere.

Ovviamente, questa volta il doppio strand di DNA che non deve essere complementare a

niente, deve essere riconosciuto dalla proteina espressa dai cloni.


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in chimica e tecnologia farmaceutiche
SSD:
Università: Salerno - Unisa
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher juanniello di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Tecnologie ricombinanti e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Salerno - Unisa o del prof Tosco Alessandra.

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