Riassunto schematico di Tecnologie Ricombinanti

Tecnologie ricombinanti

Clonazione e clonaggio

Clonazione  Creazione di individui geneticamente uguali. Clonaggio  Geni manipolati ed introdotti in organismi ospiti.

Enzimi di restrizione

Enzimi di restrizione  Enzimi che tagliano il DNA in punti specifici.

Problemi nella manipolazione

• Proteine: Denaturazione da parte del calore ed enzimi degradativi.
• DNA: Rottura meccanica ed enzimi degradativi (DNasi Eso ed endonucleasi).

Prevenire la DNAsi

Riduciamo la possibilità che le DNAsi agiscano sul DNA abbassando la temperatura a 4°C, rallentiamo l’attività e utilizziamo l’EDTA o Tris-EDTA che chelano i cationi bivalenti, importanti per l’attività delle DNAsi.

Effetti della chelazione

Chelando i cationi bivalenti, se nella stessa miscela si vuole utilizzare una DNA polimerasi, questa non funziona, visto che sono stati sottratti tutti gli ioni Mg²⁺ e Zn²⁺.

Protezione del DNA

Se vogliamo il DNA non denaturato, se togliamo tutti i sali, la struttura a doppia elica non l’abbiamo più, visto che sono necessari i controioni che stabilizzano le cariche negative dei fosfati.

Metodi di rottura cellulare

Le cellule più facili da rompere sono i globuli rossi, per semplice aggiunta di soluzione ipotonica. Nel caso in cui non ho difficoltà a usare solventi organici, posso utilizzare detergenti, come l’SDS, toluene, AcOEt se dopo non ho necessità di avere alcune condizioni, con maggior recupero del materiale, degradando le membrane.

Omogeneizzatori

Sia per colture cellulari sia per tessuti si utilizzano gli omogeneizzatori composti da un cilindro di vetro, con un pistone di vetro. Utilizzerò lo spessore adatto al mio tessuto, arriverò alla rottura cellulare, o tramite omogeneizzatori manuali o tramite omogeneizzatori elettrici.

Mantenere campioni a bassa temperatura

Generalmente cerchiamo sempre e comunque di mantenere i campioni a bassa temperatura, ma l’omogenizzazione porta un aumento di temperatura, quindi bisogna operare in ghiaccio, come il mortaio, che si usa con campioni resistenti (piante, le quali hanno parete molto spesse, soprattutto le foglie, previo congelamento e trattarlo congelato) con biglie o sabbia che mi aiuti a rompere meglio il campione.

French press

Uno dei metodi più forti utilizzati ed in genere si usa per le cellule batteriche. Abbiamo una camera di compressione, un pistone ed una valvola a spillo. Metto i batteri nella camera di compressione, chiudo con la valvola a spillo, esercito una pressione molto elevata, in modo da avere pressioni elevatissime esercitate sul campione, apro piano piano, la differenza di pressione, notevole, tra la camera di compressione e la pressione atmosferica, mi porta alla rottura del mio materiale, l’unico limite è il volume.

Sonicazione

Gli ultrasuoni sono onde sonore con frequenza superiore a quella che possiamo udire, superiore ai 16000 Hz. Si alternano fasi di compressioni e fasi di rarefazione, se quest’onda la applico ad un liquido, all’interno di esso si generano delle bolle, dette bolle di cavitazione. Nella fase di compressione la bolla si riduce e nella fase di rarefazione la bolla si allarga.

La bolla si allarga di più nella fase di rarefazione più di quanto si stringa nella fase di compressione. Nel tempo, le bolle aumentano di volume ed assorbiranno l’energia dell’onda ed ad un certo punto cresceranno in maniera tale da avere un’implosione e liberare tutta l’energia accumulata. Tutto ciò che si trova intorno viene distrutto e se tutto questo lo genero in un campione dove c’è un tessuto da rompere, quando implodono le bolle, l’energia che liberano, rompe le molecole che stanno nell’intorno.

Centrifugazione

Una delle tecniche più utilizzate in laboratori di biochimica applicata e biologia molecolare. Alla fine del processo di centrifugazione, avremo proteine, RNA, lipidi, DNA, e i pezzi di membrana. Dopo la centrifugazione avremo il surnatante e il pellet. Il DNA sarà nel surnatante ma non solo l’acido desossiribonucleico.

Purificazione del DNA

Come allontano l’RNA? Con l’RNAsi (Ribonucleasi DNAsi free). Come allontano le proteine? Proteasi (non molto economica e quando voglio un DNA molto pulito).

Estrazione con solventi

Estrazione (Fenolo- Cloroformio- Alcol isoamilico- Idrossichinolina)  Precipitato  Proteine denaturate. Prima saturiamo il Fenolo con una soluzione acquosa tamponata, visto che questa estrazione si fa a pH neutro o basico, perché se no assorbe la mia acqua piena di DNA. Il Cloroformio si aggiunge per essere sicuri che la f.o. si disponga al di sotto. L’Alcol isoamilico si aggiunge per evitare che si formi troppa schiuma. L’Idrossichinolina colora la fase organica così visivamente abbiamo un aiuto in più.

Precipitazione del DNA

Tra la f.a e la f.o. si avrà un’interfaccia che è formata dalle proteine precipitate. La soluzione restante, molto diluita, 4 volte in più, per essere lisate meglio. Normalmente in una procedura di estrazione del DNA, o allontano il tampone o precipito il DNA… Cosa si fa? La seconda cosa ovviamente, in presenza di una soluzione alcolica al 75% (1ml sol. + 3ml EtOH). Prima di metterci l’acqua, devo aggiungere una concentrazione di Acetato di Potassio pH 5.2 e la temperatura deve essere di -20°C, per farlo precipitare.

DNA con concentrazioni basse

Per soluzioni di DNA con concentrazioni non al di sotto di 10 μg/ml il DNA non precipita, ma ha bisogno di un seme (tRNA o glicogeno) dopo di che ovviamente per centrifugata si avrà un precipitato di DNA, che lo vedrò bianco se è sporco di sali, se non è sporco di sali è trasparente.

Centrifugazione e separazione

Tutte le volte che metto un tubo da centrifuga nella mia centrifuga devo ricordarmi che la chiusura dal lato esterno dalla centrifuga, in modo che il pellet si disponga sul lato che conosco. La centrifugazione è una tecnica separativa che ci serve per separare molecole che abbiano densità o dimensioni diverse, e la velocità di sedimentazione di una particella che è sottoposta ad un campo centrifugo.

La velocità dipende dalle dimensioni e dalla densità della particella, quindi particelle più grandi raggiungeranno più velocemente il fondo della provetta. Ogni campo centrifugo deve poter essere riprodotto da altre persone con altre centrifughe. Nelle centrifughe moderne c’è un pulsante che converte da RCF a RPM. Bisogna vedere sempre quale rotore si utilizza. A seconda della velocità che utilizzo, io posso separare gli organelli che sono all’interno della cellula ma anche i complessi molto grandi.

Protocolli e velocità

Se si sta attenti, con protocolli blandi, concentrazione salina opportuna, si può rompere la membrana esterna, ma non rompere le altre membrane degli organelli, però ce li ho comunque tutti insieme. Se voglio separare i vari organelli posso farlo in base alle dimensioni e alla densità. Velocità sedimentazione (1000G) Nucleo (5000G) Mitocondri, Lisosomi e Perossisomi. Ultracentrifuga & vuoto (80 000G) Microsomi (Derivati dal RE e servono per il traffico intracellulare). Ultracentrifuga & vuoto (150 000G) Ribosomi e i grandi complessi molecolari. C’è anche la sedimentazione della membrana plasmatica.

Velocità differenziale

Velocità differenziale  Velocità alla quale sedimentano organelli piuttosto che altri. Surnatante  Tutti gli altri organelli. Bilanciamento della centrifuga  Campioni uno di fronte all’altro, di egual peso, quasi ad occhio. Bilanciamento della ultracentrifuga  Campioni uno di fronte all’altro, previa pesata.

Preparazione di DNA plasmidico

L’estrazione di DNA plasmidico è relativamente facile. I Plasmidi nelle cellule batteriche sono superavvolti, se si crea un nick in un solo filamento, questa struttura si perde. Un Plasmide lineare si crea rompendo entrambi i filamenti nello stesso punto.

DNA plasmidico e cromosomiale

I Plasmidi possono essere denaturati e rinaturati facilmente, se si utilizzano condizioni alcaline, la piccola molecola di DNA circolare, potrà rinaturarsi quando si ha un pH neutro. Per quanto riguarda la molecola di DNA cromosomiale, quando uso condizioni alcaline, va incontro a rottura perché è molto più delicato. Nell’estrazione di DNA Plasmidico, si usa una soluzione fortemente alcalina, con SDS e ioni K⁺.

Quando riporto la soluzione a pH neutro, il DNA plasmidico tenderà a rinaturarsi, l’SDS insieme agli ioni K⁺ forma delle micelle, una rete biancastra, nella quale vengono intrappolate la maggior parte delle proteine. In questo passaggio io elimino anche le proteine. Questa lisi alcalina è ancora in uso.

• Io prendo le cellule batteriche con all’interno i plasmidi e la prima soluzione che utilizzo è la soluzione di risospensione, dove prendo i batteri e li risospendo in un po’ di tampone TE  Tris + EDTA.
• Poi si usa una soluzione con NaOH, SDS e RNAsi (enzima molto resistente, che non denatura facilmente).
• Quindi con NaOH e SDS io liso le cellule, denaturo il DNA sia plasmidico sia cromosomico e neutralizzo con Acetato di K, lo porto anche a pH leggermente acido in modo che si forma una rete biancastra che dovrò allontanare con la centrifugazione.
• Nel sopranatante non c’è l’RNA ma c’è il DNA plasmidico e qualche altra impurità. Il DNA cromosomiale è rimasto nella rete biancastra perché è molto grande. Il DNA è molto diluito quindi devo precipitarlo con EtOH & Acetato di K 0,3 M (che già avevo messo prima).

Purificazione con gradiente di densità

Dobbiamo purificare il nostro campione dal DNA cromosomiale e posso fare una centrifugazione in gradiente di densità, le molecole più dense le troveremo più sotto, mentre quelle meno dense le troveremo più sopra. Prima si usava il Cs, poi si usava il bromuro di etidio che si allontanava con un tubicino da dialisi. Ora ci si affida ad un kit di purificazione che si avvale di una colonna cromatografica. Devo poter legare il DNA ad un supporto solido, per esempio resine a scambio ionico (DEA) e si legherà ad uno scambiatore positivo.

• Matrici silicee alle quali si lega il DNA denaturato che funzionano con agenti caotropici.
• Gel Filtration che separa in base alle dimensioni.
• Metodi di ultrafiltrazione che separano in base alle dimensioni.

Conservazione del DNA cromosomiale

Il DNA cromosomiale è molto fragile e bisogna evitare una rottura meccanica. Bisogna evitare congelamento e scongelamento. Si conserva a 4°C. Quando preleviamo DNA cromosomiale dobbiamo evitare di usare puntali molto stretti come la P20 o P10. Uno dei metodi per rompere il DNA cromosomiale è farlo passare per un ago di una siringa. Devo prendere volumi più grandi, o si taglia la punta quando ho necessità di avere i cromosomi più integri possibili.

Estrazione dell'RNA

Come si estrae l’RNA? Il primo problema è che se ho una soluzione leggermente alcalina, l’RNA si idrolizza, visto che l’OH in posizione 2’ si deprotona e attacca il fosfato, creando un fosfato ciclico. La soluzione è maneggiare l’RNA in ambiente tamponato.

Problemi con le ribonucleasi

Le RNAsi resistono anche al trattamento con autoclave e sono presenti dappertutto. Quando la plasticheria per lavorare l’RNA arriva in laboratorio dall’industria, la quale assicura previa nostra richiesta che sia DNA e/o RNA free, si deve versare attentamente in contenitori più piccoli, evitando di toccare con mano la busta sterile e prelevare direttamente quello che ci serve da lì.

Quando invece la vetreria e i tamponi che potrebbero essere contaminati con RNAsi, come si fa? Si usa un inibitore delle RNAsi, il dietipirocarbonato! Il Dietilpirocarbonato, inibitore covalente, reagisce con le istidine di tutte le proteine (non solo dell’RNAsi) e siccome che nell’RNAsi c’è un’istidina nel sito attivo la inattiva irreversibilmente. Si mette in agitazione su una piastra magnetica agitante per un paio di ore. Tutte le tracce che avrò di RNAsi si saranno inattivate, anche se quel tampone siccome devo utilizzarlo nelle reazioni successive e non posso correre il rischio di inattivare tutte le proteine nella mia procedura. Bisogna inattivare il Dietilpirocarbonato (DEPC) in autoclave, tutta la vetreria. L’esigenza primaria è non far degradare la mia molecola, quindi utilizzerò tutti i metodi per evitare che l’RNA si degradi.

Inattivazione delle RNAsi intracellulari

L’RNAsi esiste anche nella cellula, e quando rompo la cellula, le stesse RNAsi intracellulari sono un problema. All’atto della rottura della membrana cellulare, inattivo e denaturo tutti gli enzimi, utilizzando un tampone contenente il fenolo e un agente fortemente caotropico: la guanidina isotiocianato. In un primo momento ho il mio pellet, lo risospendo in fenolo-guanidina, ci aggiungo il cloroformio per appesantire la fase organica ed estraggo… Cosa estraggo?

Nella fase organica ci vanno le proteine denaturate che si trovano anche all’interfaccia. Nella fase acquosa si trova il DNA e l’RNA. Il Fenolo doveva essere saturo di una soluzione tamponante a pH 7-8 per estrarre il DNA. Il Fenolo deve essere saturo di una soluzione tamponante a pH 5 per estrarre l’RNA. Per sicurezza, posso usare una DNAsi (RNAsi free) ed una proteasi (RNAsi free). Se estraggo dell’RNA da una cellula, avremo l’mRNA, rRNA, microRNA, tRNA, snRNA.

Quello che mi serve di più è l’mRNA (5%) rRNA (80%) rispetto all’RNA totale. Quindi bisogna isolarli tramite la coda di poli A, che gli mRNA Istonici (t_½ più bassa) non hanno. In una cellula ci sono 10 tipi di mRNA diversi con caratteristiche diverse. Tramite la fosforilazione della coda della polimerasi, vengono richiamati fattori di allungamento. La coda di poli A, apporta maggiore stabilità all’mRNA, si coordinano principalmente con il fattore eFG, per aiutare la traduzione. Sfrutto l’appaiamento che la coda di poli A può fare con un oligo dT. Se immobilizzo una sequenza dT su un supporto solido posso fare una cromatografia di affinità.

Condizioni di ibridazione

Per stabilizzare un legame tra due filamenti di acido nucleico  Utilizzo dei Sali. I Sali stabiliscono interazione tra due filamenti. Se io utilizzo elevate concentrazioni saline  Favorisco l’appaiamento tra due filamenti anche non perfettamente complementari. Se abbasso il sale, favorisco la denaturazione.

Cromatografia di affinità

Per fare una cromatografia di affinità lego a sale medio alto 0,5 M NaCl, devo favorire l’ibridazione specifica (però piuttosto che perdermi qualcosa, preferisco legare qualcosa in più), successivamente lavando ad una concentrazione di 150mM NaCl, lavando gli RNA che non ibridavano perfettamente con gli oligodt che ho immobilizzato sulla mia colonna. Per eluire gli mRNA, semplicemente elimino il sale, eliminando il sale, gli mRNA si staccano. Le varie concentrazioni di sale servono per far appaiare, per aumentare la stringenza, per eluire.

Valutazione della qualità e quantità

Alla fine di ogni procedura di estrazione, ho due necessità: Stabilire la qualità dell’estrazione e la quantità dell’acido nucleico che ho tirato. Per fare un’analisi qualitativa del campione si utilizza l’elettroforesi (separare molecole cariche sottoposte ad un campo elettrico, che dipende dalla carica della particella, del coefficiente frizionale, della dimensione dei pori e dall’intensità del campo elettrico).

Gli acidi nucleici sono particelle cariche ed abbiamo un gruppo fosfato ogni nucleotide. Quindi il rapporto carica/massa è sempre lo stesso, quindi se non mettiamo un setaccio molecolare, cioè qualcosa che separi le particelle secondo le loro dimensioni, le particelle migrerebbero tutte con la stessa velocità, quindi devo utilizzare un gel che avrà dei pori di dimensioni variabili nel quale far avvenire la separazione che a questo punto avverrà secondo le dimensioni. Le molecole più grandi verranno ritardate, quindi migreranno più lentamente, le molecole più piccole migreranno più velocemente.

Tamponi e migrazione

Una cosa che influenza la migrazione, è il tampone. A seconda del tampone che utilizzo, posso avere differenti migrazioni della stessa molecola, quindi devo cercare di utilizzare se voglio paragonare delle procedure, sempre lo stesso tampone. Nei laboratori di biologia molecolare, sono utilizzati i TAE (Tris acetato EDTA) e TBE (Tris borato EDTA) ed in base al tampone, gli acidi nucleici avranno mobilità differente. Se vario l’intensità del campo elettrico, posso fare più in fretta, finire l’elettroforesi in un tempo più basso. Io potrei in certi casi aumentare la differenza di potenziale, stando attento a non esagerare, perché il campione può surriscaldarsi e potrei perdere la risoluzione se corre più velocemente. Una corsa troppo lenta, nemmeno va bene, perché i campioni diffondono, quindi alla fine della corsa, ho delle bande slargate che non mi consentono la separazione ottimale. Con la pratica si migliorano i risultati.

Elettroforesi su gel

In cosa posso far avvenire l’elettroforesi? Acrilammide per l’elettroforesi delle proteine & Agarosio. Si avrà una reazione radicalica tra Acrilammide e bis-acrilammide. L’iniziatore radicalico è l’Anione persolfato. La bis-acrilammide mi consente di far avvenire la reazione dai due lati per cross-linkare catene diverse di acrilamide e se non l’avessi non otterrei le maglie del gel. Più bis-acrilammide metto nella mia soluzione, più strette saranno le maglie, visto che fa da ponte tra due catene di acrilamide. Il rapporto tra acrilamide e bis-acrilammide deve essere diverso per avere la quantità delle maglie. Posso variare la quantità variante.