Riassunto schematico di Tecnologie Ricombinanti

BAC

I vettori BAC (Bacterial Artificial Chromosome) possono contenere frammenti grandi fino a 300 kb,

Il DNA inserito in BAC è molto stabile, ma sono presenti solo in una o due copie per cellula, quindi

la loro produzione non può essere elevata però a differenza degli yac sono molto stabili e non

danno ricombinazione omologa.

Contengono siti cos e siti lox consentendo la linearizzazione del vettore.

PAC

I vettori PAC (P1 Artificial Chromosome) possono contenere frammenti compresi tra le 75 e le 95

kb.

Grossa dimensione dei frammenti (oggi fino a 150 kb)

Non avvengono riarrangiamenti o delezioni di DNA grazie all’utilizzo di ceppi restrizione-meno

Il DNA si recupera facilmente come plasmide

I PAC e i BAC sono i più usati

Un cromosoma artificiale di lievito ci serve per studiare cromosoma artificiale che vogliamo .

Un cromosoma artificiale umano

HACs

Un cromosoma con i centromeri, le origini di replicazione e i telomeri ma più complessa.

Posso inserire un gene che inserisco a sua volta in una cellula eucariota e quindi andare a

sostituire una funzione mutata nella cellula eucariota.

Come si producono le proteine ricombinanti?

Nel momento in cui abbiamo un gene che esprime una proteina, dobbiamo trasferirlo in un vettore

ma anche produrre un RNA e una proteina.

Analizzeremo quali caratteristiche sono importanti da inserire in un vettore per far si che diventi un

vettore di espressione e non solo di clonaggio, affinchè quel pezzo di DNA venga espresso.

Esprimiamo in sistemi eterologhi quando prendiamo un gene da un organismo e lo trasferiamo in

un altro organismo diverso dal precedente.

Es.prendo un gene umano e lo metto in E.coli, in Bacillus subtilis, saccaromices cerevisiae, pichia

pastoris, in piante come l'arabdopsis thaliana, la pianta del tabacco o in drosophila melanogaster o

in animali dai quali si può estrarre la nostra proteina dal sangue, dall'urina, dal latte senza

sacrificare l'animale.

Vettori di espressione batterici

Cosa dobbiamo fare per costruire un vettore di espressione?

Dobbiamo ottimizzare l'espressione del gene, nonchè ottimizzare la stabilità del prodotto proteico.

Se vogliamo ottimizzare la trascrizione in E.coli cosa faccio?

Mi serve il promotore ( -10 -35 )

Sequenza consenso (si allineano diversi promotori e si va a vedere la frequenza di una base in

tutte le posizioni, e poi si fa una sequenza con le basi che ricorrono maggiormente in ciascuna

posizione ) es. TATA

Le sequenze consenso corrispondono al miglior legame che il promotore possa fare con la

subunità sigma.

Non tutti i promotori non contengono le sequenze consenso, perchè?

Perché se un promotore è forte, avremo sempre un livello alto di espressione, ma noi non

vogliamo sempre un livello alto di espressione per tutti i promotori

I promotori sono più o meno forti a partire da queste due regioni, e tutto dipende da un'attivazione

o una repressione.

Es. Operone lac

Dobbiamo scegliere nel nostro vettore di espressione un promotore adatto.

Come lo scelgo il promotore a monte di un gene che voglio esprimere in grandi quantità?

Metto un promotore forte in maniera tale che la RNA polimerasi trascriva tanto mRNA.

La verità è un'altra..

E' meglio non fare così, perchè se da subito faccio esprimere ad una cellula batterica tantissima

proteina eterologa, la cellula tanto bene non starà...

La proteina che faccio esprimere nel mio vettore di espressione, potrà diventare anche il 5-10%

delle proteine totali.

Non si sa se la proteina è tossica o meno, soprattutto se la cellula batterica non la esprime.

Quando si mette una coltura batterica a crescere se si parte da una concentrazione di cellule in

fase lag che esprimono subito la proteina,queste muoiono e ottengo poca concentrazione di

proteina.

Quindi faccio in modo che i batteri crescano fino alla fase esponenziale e poi induco l'espressione

della proteina e devo usare un promotore inducibile, cioè un promotore che senza l'induttore non

esprime la proteina, quando ci metto l'induttore la esprime.

Es. promotori batterici dell'operone lac

Se io faccio in modo da mettere l'operone all'interno del promotore, viene legato i repressore, fino

a quando non inserisco una molecola che ci si può legare, quindi le cellule non esprimono la mia

proteina ricombinante.

Quando ho un numero sufficiente di cellule in coltura che mi possano produrre un numero di

proteine ricombinanti, anche se poi stanno male e muoiono, ma nel frattempo l'hanno prodotta.

si utilizza l'operatore lac, in un promotore.

La molecola che si usa per indurre l'espressione è un'analogo del vero substrato del

repressore(isopropiltiogalattoside) che commercialmente è più facile da produrre rispetto

all'allolattosio.

L'isopropiltiogalattoside è in grado di legare il repressore lac e di farlo staccare dall'operatore.

Metto le mie cellule a crescere, aspetto che arrivino in fase esponenziale, induco con

isopropiltiogalattoside, le cellule incominceranno a trascrivere il prodotto genico che è nel mio

vettore di espressione.

Che promotore utilizzo?

A questo punto utilizzo un promotore forte, perchè se ho un repressore che mi blocca la

trascrizione, non ho problemi.

Utilizzo un promotore che è l'unione del promotore dell'operone del triptofano che è un promotore

forte, più l'operatore dell'operone lac, e questo promotore viene detto tac.

Grazie a questo promotore, si è arrivato a produrre anche il 20-30% delle proteine totali.

Se ho bisogno di utilizzare l'operatore all'interno di un vettore, le molecole di repressore lac che mi

produce la cellula non sono sufficienti a saturare tutti i vettori di espressione che ci sono all'interno

della cellula, quindi si utilizzano ceppi che iperesprimono il repressore lac che è nel genoma del

ceppo.

Faccio si che il gene per il repressore lac sia iperespresso.

Se noi vogliamo evitare anche l'espressione basale, dobbiamo utilizzare ulteriori accorgimenti.

Posso utilizzare non più un promotore che riconsce la RNA polimerasi di E.coli, ma un promotore

che venga riconosciuto dalla RNA polimerasi del fago T7.

E.coli non ha la polimerasi del fago t7 a meno che non gliela inserisco io nel genoma, quindi se io

non esprimo la rna polimerasi del fago t7, non ci sarà trascrizione.

Metto il gene dell RNA polimerasi del fago t7 nel genoma di E.coli, sotto il controllo del repressore

lac.

Quando io metto l'induttore, l'operatore è anche a monte dell'rna poimerasi del fago t7.

Quando io metto l'isopropiltiogalattoside, comincia la trascrizione dell'RNA polimerasi che va a

riconoscere il promotore t7 che è monte del mio gene.

Riassumendo

I vecchi sistemi utilizzavano l'ibrido del promotore del trp e l'operatore lac ed erano riconosciuti

dall'rna polimerasi di coli.

Nei nuovi sistemi è stato cambiato ill promotore, non sono più le regioni -10-35, ma sono le regioni

-10-35 riconosciute dall'rna polimerasi del fago t7.

E' stato preso il gene dell rna polimerasi del fago t7 e a questo punto va inserito nella cellula

batterica nella quale voglio che avvenga l'espressione.

Ingegnerizzo prima il ceppo di E.coli, ci metto dentro il gene l'RNA polimerasi del fago t7,

controllata dall'operatore lac.

Quando induco l'espressione con isopropiltiogalattoside, si indurrà l'espressione dell'rna polimerasi

del fago t7, dpodichè una volta prodotta l'rna polimerasi del fago t7, andrà a riconoscere il

promotore che è presente nel mio vettore di espressione presente a monte del mio gene.Solo

allora il gene si esprimerà.

I ceppi che contengono la polimerasi dl fago t7 nel genoma si chiamano te3

Un ulteriore accorgimento per evitare che venga prodotta anche una singola molecola derivante

dalla trascrizione basale, faccio esprimere al mio ceppo di E.coli, il lisozima del fago t7, che si lega

all'RNA polimerasi dello stesso fago e ne impedisce il funzionamento( inibitore naturale dell'RNA

Polimerasi) finchè viene espresso il lisozima, quelle poche molecole di RNA polimerasi che

vengono comunque trascritte come espressione basale, sono bloccate dal lisozima( in bassa

quantità)

Quando l'RNA polimerasi sarà iperespressa, quindi si troverà in grandi quantità, le molecole di

lisozima, non sono più sufficienti per bloccarla e quindi la RNA polimerasi andrà a fare quel che

deve fare, cioè trascrivere i geni sul mio vettore di espressione.

I ceppi più utilizzati oggi si chiamano DE3bliss che impediscono qualunque espressione basale del

mio gene del vettore di espressione, ma consentono un'espressione ad alti livelli dopo l'induzione

con isopropiltiogalattoside.

I passaggi successivi sono la terminazione della trascrizione.

Se non metto un terminatore della trascrizione, l'RNA polimerasi mi trascrive tutto il plasmide,

quindi l'efficienza della trascrizione diminuisce.

Quindi avrei una molecola di RNA più lunga di quella che mi serve e quindi potrebbe darmi fastidio

nei passaggi successivi.

Se io voglio un'efficiente trascrizione, e avere l'RNA che mi serve, devo inserire anche un sito di

terminazione della trascrizione.

Se inserisco uno di questi segnali nel vettore ( Rho dipendente e Rho indipendente) io favorisco

l'efficienza della trascrizione.

La traduzione

Come favorisco la traduzione in E.coli e cosa serve a E.coli per iniziare la traduzione?

La sequenza di Shine dalgarno, cioè la sequenza di legame ai ribosomi, che si trova ad una

distanza ben precisa dal'AUG.

Devo fare in modo che la sequenza di Shine dalgarno sia alla giusta distanza dall'AUG(5-9 bp) del

mio gene che sto andando ad inserire nel mio vettore di espressione.

Il mio vettore di espressione sarà fatto dai classici elementi presenti nei vettori di clonaggio( origine

di replicazione e una resistenza all'antibiotico, perchè si deve comunque poter duplicare altrimento

lo perdo e devo comunque avere un marcatore di selezione, perchè se in un vettore non c'è un

marcatore di selezione e non costringo alle cellule ad esprimere il gene per la selezione, esse

mano a mano che vado avanti nella duplicazione, perderanno quel plasmide.

Se ad esempio in un vettore metto la resistenza all'ampicillina, se pesco le cellule senza

ampicillina, le cellule perderanno il vettore, perchè non gli serve più.

Non sono devo metttere il marcatore di selezione, ma devo sempre crescere le cellule in presenza

di antibiotico, in maniera tale che devono essere costrette a duplicare il vettore e a mantenerlo

nelle duplicazioni.

Un'altra cosa alla quale devo fare attenzio