Riassunto Genetica forense

Test di rilevamento del sangue

FERRIPROTOPORFIRINA-OH organismo. Ione Fe catalizza, in presenza di l'ossidazione della TMBIDROSSIDO ORGANICO (indicatore colorimetrico), associando alla reazione un viraggio cromatico, quindi TMB funge da riducente e l' da ossidante.

IDROPEROSSIDO. Anche questo è un test speditivo, in quanto si ha una risposta rapida ed una facilità di impiego. Un esempio di questo test è il COMBUR TEST, test molto sensibile, rileva la presenza di sangue anche se diluito fino a centomila volte, ma anche qui esistono una serie di composti che possono portare a dei risultati falsi positivi (perossidasi, candeggina, metalli come ferro o rame..).

Test immunocromatici solitamente impiegate anche per la ricerca di sangue occulto in feci o urine nei laboratori. Tra questi abbiamo HEXAGON OBTI, rischio falsi positivi molto basso e specifico per il sangue umano: due linee positività (sangue umano), una linea negatività (sangue non umano o assenza di sangue).

Utilizzo di...

anticorpi monocolonali mobili anti-emoglobina umana coniugati con una sostanza cromogena. Se è presente sangue umano si forma complesso HB-anticorpo che migra lungo la membrana fino ad incontrare una scia reattiva dove sono immobilizzati anticorpi policlonali anti-emoglobina umana. Quindi si avrà la formazione di una linea colorata nell'arco di pochi minuti. Si formerà anche una seconda banda colorata di controllo da anticorpi monoclonali mobili non legati che verranno immobilizzati sulla stria reattiva di anticorpi anti-Ig immobilizzati. Seguirà poi un'analisi istologica per effettuare un controllo sulla provenienza del sangue e sulla sua natura (epistassico, mestruale o rettale). SALIVA La saliva è importante poiché da questa è facilmente rilevare cellule della mucosa buccale. La si può trovare su stoviglie, bottiglie, mozziconi di sigaretta, chewing-gum, impronte di morsicatura, indumenti (passamontagna). A basse lunghezze.d’onda vengono emesse forti luminescenze. Esistono test orientativi per la rilevazione dell’α-amilasi (o ‘ptialina’), enzima presente in diverse isoforme nella saliva con la funzione di idrolizzare i legami glucosidici degli zuccheri. Esistono test colorimetrici e test immunologici. I primi utilizzano microsfere diamido la cui idrolisi produce sottoprodotti con densità ottica osservata con tecniche spettrofotometriche. α-amilasi I secondi più sensibili, utilizzano anticorpi monoclonali anti umana. SPERMA Analisi di questo determinante in caso di sospetta violenza sessuale. Due componenti: - liquido seminale fluido ricco di proteine - spermatozoi gameti maschili, ovvero cellule sessuali ma non sempre - prodotti o in piccole quantità (difetti di nascita, malattie) La principale fonte di ricerca sono le sorgenti luminose forensi poiché lo sperma ha una elevata fluorescenza, maggiore rispetto ad altri fluidi corporei (no saliva) Esistonopoi test orientativi che consistono nella rilevazione della fosfatasi acida prostatica (PAP) o dell'antigene prostatico specifico (PSA) enzimi prostatici in grandi quantità nel liquido seminale color porpora. Possono essere utilizzati anche colorazioni immunoistochimiche che utilizzano anticorpi monoclonali anti-sperma umano test confermativo estremamente specifico. Tra i test confermativi specifici abbiamo test che vanno alla ricerca della PSA detta anche p30, o della (Sg) metodi per la rivelazione rapida SEMENOGELINA che sfruttano anticorpi immobilizzati anti-p30 o anti-Sg rapidi, poco costosi e molto sensibili. Esistono anche analisi microscopiche del sedimento cellulare effettuate tramite la colorazione "Christmas tree", utilizzando due diversi coloranti: il nuclear fast red per colorare i nuclei mentre un colorante verde per i citoplasmi. URINE, FECI E SUDORE Per estrazione DNA con kit specifici FORMAZIONI PILIFERE Le aspettative di successo variano a secondadelle fasi di vita delle stesse edecrescono quanto più queste si avvicinano alla fase terminale del loro ciclo biologico. La vita di formazione biologica può essere distinta in tre fasi: 'ANAGEN, CATAGEN e TELOGEN'. Su indumenti, copricapi, calze di nylon TOUCH DNA Richiede campioni molto piccoli, ad esempio su oggetti se toccati o maneggiati casualmente o dalle impronte. Fase di Prelievo Evitare di toccare la zone dove c'è una traccia con mani nude - Evitare di tossire o starnutire nelle vicinanze della traccia - In presenza di un oggetto facilmente rimovibile si acquisisce l'oggetto, - altrimenti rimuovere la macchia con un cotton fioc inumidito o grattarlo a secco. Le tracce biologiche vanno essiccate e se ciò non è possibile, si congelano e si mantiene la catena del freddo. Tracce come le formazioni pilifere bisogna fissarle su un supporto di carta o cartoncino, facendo attenzione a non interessare le due estremità, porle.

All'interno di un involucro in modo tale da evitare lo sfregamento delle stesse con le pareti.

Confezionamento, conservazione e trasporto

• Utilizzo di buste di carta, se acid-free meglio
• Impiego di diseccanti
• Evitare promiscuità
• Sigilli di sicurezza (catena di custodia)
• Protezione operatore (es. da bordi taglienti, punte..)
• Trasportati con cura
• I campioni vanno conservati a +4°C (breve tempo), a -20°C (lungo tempo) oppure a -80°C. Le tracce biologiche si conservano meglio se essiccate e poste in ambiente freddo; condizioni che riducono il tasso di crescita batterica e la degradazione del DNA

Laboratori genetica forense

• Ampi e non affollati per evitare errori o contaminazioni, ben illuminati e ventilati, con controlli di routine sul funzionamento di tutte le apparecchiature (centrifughe, microscopi, incubatori..)
• Aree distinte per evitare la contaminazione:
• Area accettazione campioni analisi reperti (descrizione e foto)
• Area estrazione del

DNA viene raddoppiato. La PCR (Polymerase Chain Reaction) è una tecnica che permette di amplificare specifiche regioni del DNA. La reazione avviene in tre fasi: denaturazione, annealing e allungamento. Durante la denaturazione, il DNA a doppio filamento si separa in due filamenti singoli. Durante l'annealing, i primer si legano ai filamenti singoli del DNA. Durante l'allungamento, la DNA polimerasi sintetizza un nuovo filamento di DNA complementare a ciascun filamento singolo. Questo processo viene ripetuto per un numero di cicli definito, aumentando esponenzialmente il numero di copie del DNA target. Elettroforesi del DNA ed elaborazione dati Dopo l'amplificazione del DNA, è necessario separare i frammenti di DNA ottenuti in base alla loro dimensione. Questo viene fatto tramite l'elettroforesi, una tecnica che sfrutta il passaggio di una corrente elettrica attraverso un gel di agarosio o poliacrilammide. I frammenti di DNA migrano attraverso il gel in base alla loro dimensione, creando una banda di DNA separata. Successivamente, i dati ottenuti vengono elaborati per determinare la dimensione dei frammenti di DNA e analizzare i risultati. Le fasi del 'Test del DNA' Il test del DNA comprende diverse fasi, tra cui l'estrazione del DNA, la quantificazione del DNA, la PCR, l'elettroforesi, la tipizzazione del campione e l'analisi probabilistica. Durante l'estrazione del DNA, il DNA viene isolato da una fonte biologica, come la saliva o il sangue intero. Successivamente, il DNA viene quantificato per determinare la sua concentrazione. La PCR viene utilizzata per amplificare specifiche regioni del DNA. Successivamente, i frammenti di DNA amplificati vengono separati tramite elettroforesi e i dati ottenuti vengono elaborati. Infine, viene eseguita la tipizzazione del campione, che consiste nella comparazione del genotipo del campione con quello di altri reperti analizzati. L'analisi probabilistica, basata sul teorema di Bayes, viene utilizzata per valutare la probabilità che il campione analizzato corrisponda a un determinato individuo. Estrazione DNA mediante colonnine Per l'estrazione del DNA, viene utilizzato un kit commerciale che permette di ottenere rapidamente il DNA da una fonte biologica, come la saliva o il sangue intero. La procedura prevede una breve incubazione del campione in un buffer di lisi contenente la proteina K, che digerisce le proteine presenti nel campione. Successivamente, il campione viene passato attraverso colonnine composte da una membrana di gel di silice. Il DNA presente nel campione viene assorbito sulla membrana dopo una breve centrifugazione. Successivamente, le proteine digerite e altri contaminanti vengono rimossi mediante l'utilizzo di buffer di lavaggio. Infine, il DNA viene eluito dalle colonnine, ottenendo così il DNA estratto pronto per ulteriori analisi. In conclusione, il test del DNA comprende diverse fasi, tra cui l'estrazione del DNA, la quantificazione del DNA, la PCR, l'elettroforesi, la tipizzazione del campione e l'analisi probabilistica. L'estrazione del DNA può essere effettuata utilizzando un kit commerciale che permette di ottenere rapidamente il DNA da una fonte biologica. La PCR è una tecnica che permette di amplificare specifiche regioni del DNA. L'elettroforesi viene utilizzata per separare i frammenti di DNA in base alla loro dimensione. Infine, l'analisi probabilistica viene utilizzata per valutare la probabilità che il campione analizzato corrisponda a un determinato individuo.DNA raddoppia, se non intervenissero fattori limitanti, già dopo 20 cicli da una molecola di DNA se ne dovrebbero generare 1.000.000. Multiplex PCR

• Possono essere amplificati nella stessa reazione fino a 24 marcatori genetici
• A partire da 1 ng di DNA.
• Si usano fluorocromi diversi per distinguere gli alleli degli STR i cui range di peso molecolare si sovrappongono

La tipizzazione degli alleli degli STR viene effettuata comparando il campione ad un ladder allelico (ladder allelico: l'insieme delle varianti alleliche ad un locus maggiormente rappresentative a livello mondiale). Per generare un profilo STR:

1. Amplificazione mediante PCR multiplex
2. Amplificare tramite PCR contemporaneamente più microsatelliti (multiplex), utilizzando primers fiancheggianti ciascun locus.

Per ottenere buoni risultati i primers devono essere scelti con attenzione:

• Le temperature di annealing dei vari primers devono essere simili
• Devono essere valutate e minimizzate le possibili

interazioni tra primers,anche appartenenti a coppie diverse (esempio complementarietà al 3')
Una valutazione sperimentale della concentrazione ottimale dei singoli- primers è sempre necessaria quando si mette a punto una nuova multiplex, così come una titolazione dei vari componenti della PCR.
Problemi in ambito forense durante l'amplificazione mediante PCR multiplex
PRESENZA DI INIBITORI: I reperti biologici possono essere mescolati con inibitori della PCR di tipo organico ed inorganico che non sempre vengono eliminati efficacemente negli step di purificazione del DNA.- Ulteriore purificazione, BSA, diluzione
CONTAMINAZIONE IN LABORATORIO O IN FASE DI REPERTAZIONE: a causa della sua elevata sensibilità, la PCR presenta un forte problema legato alla contaminazione, in misura tanto maggiore quanto più il DNA in esame è scarso e/o degradato.- Utilizzazione di guanti monouso e mascherine (in lab e in repertazione)- Strumentazione e spazi

- Utilizzazione di puntali monouso con filtro
- Irradiazione con UV dell'area dedicata alla preparazione della PCR
- Creazione di un database di profili genetici del personale dellaboratorio

1. Sequenziamento mediante elettroforesi capillare
   1. Prodotto PCR fluorescente viene denaturato con formammide e posto nel campionatore
   2. Si applica voltaggio elettrico Il prodotto PCR viene elettroiniettato nel capillare
   3. Il DNA migra nel polimero contenuto nel capillare; tanto più velocemente quanto minore è la grandezza del frammento
   4. Quando il frammento arriva in corrispondenza di una finestra nel capillare, una sorgente laser eccita il fluorocromo legato al prodotto PCR
   5. Il fluorocromo eccitato dal laser emette luce nel visibile, in un determinato intervallo di lunghezze d'onda e con una intensità che è proporzionale alla quantità di molecole di fluorocromo eccitate
   6. La luce emessa viene filtrata per determinati range di

Lunghezza d'onda convertita in un segnale elettrico che viene misurato in RFUs (Relative Fluorescence Units).

I segnali elettrici vengono tradotti nei tipici picchi colorati degli elettroferogrammi.

Il software GENESCAN divide i dati grezzi in un elettroferogramma separato per ogni colore:

• Blue
• Green
• Yellow
• Red

Il software GENOTYPER identifica i differenti loci e per ciascuno di essi riconosce gli alleli facendo riferimento ad uno standard di peso molecolare e ad un ladder allelico.

Il Ladder è l'insieme degli alleli di un locus.