Riassunto esame Metodologie Biochimiche e Cellulari, prof. De Fabiani e Prof. Crippa

Metodologie cellulari

Parte 1: Le colture dei batteri

I batteri permettono di produrre quasi tutti i tipi di DNA utilizzabili in laboratorio. Le cellule procariote vengono utilizzate per:

• Produzione di librerie di DNA (genomiche, cromosomiali, a DNA complementare)
• Subclonaggio di cDNA (amplificazione di DNA)
• Produzione di proteine (bioreattori)

I batteri presentano dei vantaggi rispetto alle cellule eucariotiche, come ad esempio l’economicità, sono semplici da utilizzare e crescono rapidamente anche in grosse quantità sia su substrato solido che su substrato liquido. Inoltre, è facile modificare il loro genoma e inserire un genoma esterno di interesse (facilità di trasformazione con vettori contenenti DNA ricombinante).

Presentano però anche degli svantaggi rispetto alle cellule eucariotiche: per la produzione di proteine devo tenere conto che i procarioti non fanno la modifica post-traduzionale. Quindi, non essendo conservate molte modificazioni post-traduzionali, può avvenire la produzione di proteine inattive.

Il batterio più utilizzato è Escherichia coli, gram negativo, ha la membrana plasmatica e la parete cellulare. La maggior parte deriva dal ceppo E.Coli K-12. Il genoma è costituito da un cromosoma circolare di 4 milioni di bp:

• Cresce rapidamente in medium minimale con glucosio (fonte di carbonio ed energia), sali (fonte di azoto, fosforo, metalli pesanti)
• Cresce estremamente bene in medium ricco contenente tutti gli amminoacidi essenziali, precursori di nucleotidi, vitamine ecc.

Terreni di crescita dei batteri

Il medium minimale (M9) contiene: 6 g Na₂HPO₄, 3 g KH₂PO₄, 1 g NH₄Cl, 0.5 g NaCl, 1 ml di 1M MgSO₄ 7H₂O, 10 ml 20% glucosio (o glicerolo).

Il medium ricco Luria Bertani (LB) contiene: 10 g tryptone, 5 g estratti di lievito, 5 g NaCl, 1 ml di 1N NaOH. Oggi compri LB già pronto in polvere da sciogliere in H₂O distillata e lo autoclavi per sterilizzarlo. Questo terreno viene lasciato liquido e messo nelle beute che devono avere una capacità molto più grande per lasciare l'aria necessaria al batterio per duplicarsi. Vengono utilizzati un pezzo di cotone o un tappo con un foro per favorire lo scambio gassoso.

La coltura liquida viene mantenuta a 37°C (Pre-coltura di 24h seguita da coltura rilanciata per circa 16h).

Controllo della crescita batterica: con vetrino di conteggio al microscopio oppure con spettrofotometro: lettura OD600 di una sospensione batterica. OD600 = 1 corrisponde a circa 8x10⁸ cellule/ml.

Crescita dei batteri

I batteri hanno una fase di crescita che comprende tre step successivi: la fase di latenza (lag period, rappresenta il tempo tra l’introduzione del microrganismo nella coltura e il tempo che esso impiega ad iniziare la fase logaritmica), la fase logaritmica cioè il periodo di crescita esponenziale (early, middle, late log phase) e la fase stazionaria di saturazione, più la fase di declino dove il batterio muore.

E. coli si duplica in 20 min (rappresenta la fase stazionaria). Nella fase stazionaria non avviene la duplicazione perché i nutrienti terminano e successivamente muoiono nella fase di declino (consumo di nutrienti essenziali e accumulo di sostanze tossiche).

Per quanto riguarda la crescita su terreno solido, viene aggiunto l’agar che gelifica su piastre petri (medium solidificati con 1.5% di agar). La crescita avviene a 37°C, di solito per selezionare batteri si addizionano antibiotici di resistenza, marker selettivi (termolabili) e additivi vari. La coltura solida permette di separare i batteri in colonie, ad esempio con la miscela di ligazione nelle fasi iniziali della clonazione, mentre quella liquida permette di ottenere molto DNA ad esempio se voglio clonare un plasmide in quanto può contenere anche 1 litro di soluzione.

I batteri vengono conservati a temperature inferiori rispetto agli eucarioti, in provette a –80°C in stock di sospensione batterica in medium ricco contenente il 30% di glicerolo o il 7% di dimetil solfossido (DMSO). Sono sostanze a diversa composizione chimica che hanno in comune elevata solubilità in acqua e tossicità dipendente dalla concentrazione di utilizzo. La loro azione protettiva si esplica in vari modi:

• Con un’azione diretta sulla membrana cellulare
• Si sostituiscono all’acqua e diminuiscono la formazione dei cristalli di ghiaccio
• Abbassano il punto di congelamento della soluzione e permettono una maggiore disidratazione delle cellule durante il congelamento lento

Trasformazione di batteri

La trasformazione è l’inserimento di DNA esogeno all’interno di un procariote. La cellula procariota viene resa “competente” alla trasformazione: la sua membrana viene resa permeabile al fine di permettere l'ingresso di molecole di DNA al suo interno.

I batteri vengono sfruttati come bioreattori per la produzione di DNA in forma plasmidica per trasformazione. Solo alcune specie batteriche possono acquisire DNA estraneo dall'ambiente, che deve essere a doppia elica, e vengono dette "naturalmente competenti". Le altre specie divengono competenti solo in particolari condizioni fisiologiche, che in laboratorio coincidono con la fase di crescita esponenziale. Molte specie batteriche non naturalmente competenti possono essere trasformate artificialmente in laboratorio. Per fare ciò, bisogna permettere alle molecole di DNA di attraversare la membrana rendendola temporaneamente permeabile. Ciò si può fare mediante metodi chimici (CaCl₂) o fisici (elettroporazione); con quest'ultima si hanno frequenze di trasformazione circa 1000 volte superiori rispetto ai metodi chimici.

Metodo del CaCl₂: preparazione delle cellule competenti

• 1. Inoculare una colonia singola di E. Coli (TOP10 o DH5α) in 10 ml di LB- Crescere o/n a 37°C
• 2. Inoculare 100μl della sospensione ottenuta in 50 ml di LB e crescere a 37°C, seguendo OD600
• 3. Quando OD600 = 0.5 (early log phase), raffreddare in ghiaccio per 5 min, recuperare i batteri della sospensione per centrifugazione
• 4. Risospendere il pellet in 10ml di CaCl₂ freddo (60mM CaCl₂, 15% di glicerolo) e centrifugare
• 5. Risospendere in 500μl di CaCl₂ freddo
• 6. Fare delle aliquote da 100μl e congelare a -80°C (restano competenti per circa tre mesi)

Per quanto riguarda i metodi chimici, non sono ben noti i meccanismi alla base del funzionamento di CaCl₂, ma si pensa che il sale ionizzandosi in soluzione a Ca²⁺ crei un gradiente esterno alla parete dei batteri e leghi i gruppi fosfato del DNA carichi negativamente (il DNA è un polianione). Il DNA ormai neutralizzato e legato agli ioni calcio precipita in soluzione e viene incorporato dalla cellula batterica. Trattamento che modifica la loro parete cellulare per renderli competenti alla trasformazione: mediante la tecnica del CaCl₂ (calcio cloruro), che va a formare dei precipitati intorno alla parete dei batteri che servirà per mascherare le cariche negative del DNA da inserire, facilita la formazione di precipitati di DNA che verranno internalizzati per endocitosi. Il glicerolo aumenta la permeabilità facilitando l'ingresso. Faccio delle aliquote e le conservo stoppando la crescita, e rendendole pronte al momento dello scongelamento. La competenza viene mantenuta per circa 3 mesi.

Trasformazione di cellule competenti

• 1. A 100μl di cellule competenti in CaCl₂ freddo aggiungere circa 10-20 ng di DNA plasmidico
• 2. Incubare in ghiaccio 30 minuti
• 3. Incubare a 42°C per 2 minuti, raffreddare in ghiaccio
• 4. Centrifugare, risospendere il pellet di batteri in 400μl di LB sterile e fare crescere per 1h sotto agitazione (225 rpm) a 37°C
• 5. Centrifugare, risospendere il pellet di batteri in 50μl di LB sterile e piastrare su piastre di agar/LB contenente l’antibiotico per la crescita selettiva (amp, kana,..)
• 6. Incubare o/n a 37°C
• 7. Controllare la formazione di colonie di batteri

La trasformazione prevede il calcio, che è già presente, e il glicerolo, e prevede un’ulteriore modifica alla parete mediante shock termico. Avviene l’incubazione in ghiaccio e poi a 42 gradi, in questo modo il DNA entra. Bisogna calcolare bene la quantità di DNA che entra perché esso è tossico per i batteri quindi bisogna metterne il minimo possibile. I batteri vengono poi rimessi nel ghiaccio e poi passati in terreno solido per la selezione con antibiotico. Successivamente piastro i batteri e seleziono le colonie toccandole e trasferendole in liquido sterile autoclavato (picking). Si fa crescere in agitazione a 37° e successivamente si estrae il DNA di interesse.

Lisi alcalina: estrazione del DNA plasmidico dai batteri

Il DNA plasmidico viene estratto dai batteri mediante la tecnica di lisi alcalina. L’estrazione si basa sul principio della lisi alcalina di una opportuna quantità di batteri trasformati (cresciuti o/n a 37°C), dalla successiva separazione del DNA plasmidico su una resina e dall’eliminazione delle proteine, RNA, etc. Il DNA alla fine viene lavato, staccato dalla resina e risospeso in H₂O salf.

1. 1. Inoculare 1 colonia singola ottenuta dalla trasformazione dei batteri in 5ml di LB e farla crescere 2h a 37°C
2. 2. Trasferire i 5ml in 500ml di LB sterile contenente ab di selezione e fare crescere o/n a 37°C
3. 3. Pellettare i batteri per centrifugazione (circa 3000 rpm x 30 minuti a 4°C)
4. 4. Risospendere il pellet in un buffer di risospensione (contenete TrisCl, EDTA ed RNAsi)
5. 5. Aggiungere un buffer di lisi (contenente NaOH e SDS) e incubare a RT per 5 minuti
6. 6. Aggiungere un buffer di neutralizzazione (contenente potassio acetato) e incubare in ghiaccio per 20 minuti
7. 7. Centrifugare a 20000g (RCF) a 4 °C per 30 minuti
8. 8. Caricare il surnatante su una colonna contenente una resina a scambio ionico ad alta affinità per gli acidi nucleici
9. 9. Lavare la colonna per 2 volte con buffer con concentrazione salina media
10. 10. Eluire il DNA con un buffer ad alti sali
11. 11. Precipitare il DNA aggiungendo isopropanolo, (aggiungerlo lentamente, si formeranno 2 fasi) miscelare per inversione subito prima di centrifugare, e centrifugare a 15000g a 4 °C per 30 minuti
12. 12. Eliminare con delicatezza il surnatante e lavare il pellet con 5ml EtOH al 70%
13. 13. Centrifugare a 15000g a 4 °C per 10 minuti
14. 14. Eliminare con delicatezza il surnatante e asciugare il pellet all’aria
15. 15. Risospendere il pellet in un opportuno volume di H₂O

Devo ottenere il DNA in sospensione mediante il buffer di risospensione che contiene RNAsi che degrada tutto l'RNA presente. Lo step successivo è la lisi con buffer di lisi che contiene SDS (un detergente che denatura il DNA genomico e rompe le membrane per precipitare) e soda. Ciò che resta in soluzione è il DNA di interesse perché anche le proteine precipitano grazie a potassio e all'acetato contenuti nel buffer di neutralizzazione. Carico DNA sulla colonna affine al DNA lavo bene con soluzione isotonica poi devo recuperarlo quindi lo eluisco con buffer ad alti sali. Poi aggiungo isopropanolo che serve per precipitare il DNA, avviene centrifugazione e lo lavo poi con etanolo che evapora. A questo punto ho DNA puro che posso risospendere in H₂O.

One shot (cellule già rese competenti che posso comprare ma che non posso riutilizzare perché quando duplicano poi non sono più competenti). Questi ceppi vengono modificati ad esempio resi non patogeni o vengono eliminati geni di difesa per l'attacco di virus. Vengono deleti anche altri geni che codificano per le endonucleasi che potrebbero danneggiare il DNA esogeno.

Vettori per la trasformazione dei batteri

Tipi di DNA utilizzabili come vettori:

• Plasmidi naturalmente presenti nei batteri
• Batteriofago lambda o correlati
• Fago filamentosi

Vettori plasmidici

Un plasmide è un DNA circolare, extra cromosomale e autoreplicante, sono naturalmente presenti in molti ceppi di E. Coli. La replicazione può richiedere la produzione di proteine specifiche da parte del plasmide o utilizzare quelle batteriche dell’ospite. Tutti i plasmidi utilizzati in biologia molecolare sono sintetici e per essere dei buoni vettori di clonaggio, devono avere almeno tre proprietà in comune:

• Un’origine di replicazione batterica
• Un marker selettivo
• Un sito di clonaggio per inserire il DNA di interesse

Origine di replicazione batterica

È una sequenza di DNA che contiene il sito di inizio della replicazione (ori); comprende anche i geni che codificano tutti gli mRNA e le proteine necessarie alla replicazione (possibili fattori di trascrizione specifici).

Marker selettivo (amp, kana, tet)

Il marker selettivo deve essere dominante, è un gene che codifica per alcuni enzimi in grado di degradare antibiotici specifici. I marcatori di selezione sono geni che codificano per la resistenza agli antibiotici, servono per sapere se il DNA è stato inserito nel batterio. Ad esempio, l’ampicillina che agisce sulla sintesi della parete del batterio (agisce sulla transpeptidasi). Inserisco geni che codificano per la produzione di enzimi che distruggono l'antibiotico. Altri antibiotici sono tetraciclina e kanamicina che hanno come bersaglio la subunità minore del ribosoma quindi agiscono sulla traduzione.

Resistenza alla ampicillina

I batteri posseggono, oltre alla membrana cellulare degli organismi pluricellulari, una parete cellulare esterna rigida che previene la rottura osmotica nei medium ipotonici. La parete cellulare batterica deve allargarsi e duplicarsi nel corso della crescita e divisione cellulare. Sintesi di nuovo materiale della parete. I derivati della penicillina (ampicillina) agiscono inibendo la biosintesi ex novo della parete batterica rendendo il batterio vulnerabile alla rottura osmotica. Inibiscono l’enzima responsabile della transpeptidazione perché il loro anello beta-lattamico simula la struttura della Dalanilalanina (sito di legame per gli enzimi di transpeptidazione). Le TRANSPEPTIDASI sono un complesso di proteine denominate proteine leganti la penicillina (PBP). Componenti del peptidoglicano.

Lo Staphylococcus aureus produce PENICILLASI che rompono le penicilline inattivandole e causano resistenza agli antibiotici. Tutte le cellule che codificano per delle penicillasi distruggono l’ampicillina e possono fare la parete cellulare.

Resistenza alla tetraciclina e kanamicina

Azione a livello ribosomiale: ribosoma batterico è 70S ed è costituito da due subunità (30S e 50S). La tetraciclina ha come bersaglio la subunità 30S, inibisce il legame dell’aminoacil-tRNA al sito A del ribosoma. Anche la kanamicina ha come bersaglio la subunità minore del ribosoma, ma inibisce il legame del primo aminoacido al complesso di iniziazione.

Si possono formare star colonies che sono piccole colonie vicino a quelle più grosse che sono un falso positivo perché sfruttano l’eliminazione dell'antibiotico fatto dalle colonie vicine resistenti ma in realtà non hanno il DNA di interesse.

Sito di clonaggio

È un sito di taglio per un enzima di restrizione specifico che può essere utilizzato per inserire DNA esterno, senza interferire con le funzioni basali del plasmide.

Inserimento del DNA all’interno del plasmide. È presente un sito di taglio nel plasmide, taglio con bamH1 e con lo stesso enzima di restrizione taglio anche il DNA di interesse, poi avviene la ligazione. Il DNA di interesse è stato inserito e ha perso la resistenza alla tetraciclina. Utilizzo della tecnica de replica plating per determinare le colonie che hanno ligato l'insert di interesse.

Per questa tecnica, si parte da una capsula iniziale (la piastra primaria) contenente il terreno e un certo numero di colonie cellulari che devono essere studiate; sulla piastra viene appoggiato delicatamente un disco coperto da uno strato di velluto sterile, una membrana di nitrocellulosa o un filtro di carta, in modo da farvi aderire qualche cellula per ciascuna colonia. Il panno o filtro viene poi premuto su altre piastre sterili (le piastre secondarie): in questo modo le cellule si depositano sul terreno e, dopo il periodo di incubazione, genereranno colonie così come erano disposte nella piastra primaria.

Per esempio, se si vuole isolare colonie che sono sensibili all'antibiotico ampicillina si piastrano colonie in piastre secondarie Amp+ (cioè con ampicillina). Le colonie sensibili moriranno ma potranno comunque essere identificate sulla piastra primaria. Queste colonie possono quindi essere prelevate (pickate) dalla piastra primaria e analizzate separatamente.

Operone LAC (tecnica BIANCO O BLU)

Un altro sistema usato per il clonaggio è quello dell'operone LAC che codifica per i geni della via del metabolismo del lattosio. Quando il batterio cresce in presenza di glucosio la trascrizione dell’operone LAC è bloccata dal repressore lac (prodotto da un gene vicinale lacI) che impedisce il legame della RNA polimerasi al promotore LAC. In presenza di lattosio (o componenti correlati) il repressore lac non può più legare il promotore LAC e la trascrizione può iniziare, originando un singolo mRNA che codifica per lacZ, lacY, lacA.

Due di questi geni sono essenziali per la crescita in lattosio. Lac Y codifica per una permeasi necessaria per l’ingresso del lattosio nella cellula. Lac Z codifica per la b-galattosidasi che trasforma il lattosio in glucosio e galattosio. Lac A codifica per la tiogalattoside transacetilasi.

Utilizzo del gene lac Z

La b-galattosidasi può essere separata in due subunità, che possono essere sintetizzate separatamente. Quando si uniscono danno origine ad una proteina funzionale: Alpha complementazione.

E. Coli DH5α f80dlacZD15 produce il frammento w della b-galattosidasi, dà α-complementazione Delta (lacZYA-argF) eliminati i geni lacZ (frammento α), lacY, lacA.