Riassunto esame Metodologie Biochimiche e Cellulari, prof. De Fabiani e Prof. Crippa

PCR

La Polimerase Chain Reaction è un metodo che viene utilizzato per amplificare in vitro

una sequenza di DNA (genomico o clonato) compresa tra due oligonucleotidiche

fungono da innesco per una DNA polimerasi termostabile, producendo così in modo

molto specifico la regione di DNA desiderata in grandi quantità.

Nel caso della PCR i substrati son i desossiribonucleotidi trifosfati e il prodotto è

l’amplicone (nuove sequenze di DNA). Conoscendo la sequenza codificante, si possono

disegnare due oligonucleotidi specifici per estrarre l’intera sequenza nucleotidica

codificante a partire da uno stampo adeguato. Nel caso di un gene procariotico o del

lievito, lo stampo può essere il DNA genomico dell’organismo da cui proviene la

proteina, ma nel caso di eucarioti superiori lo stampo deve basarsi sull’RNA

messaggero, perché la dimensione del gene risulta troppo elevata per essere clonato

nel vettore di espressione a causa della grande quantità di introni. La polimerasi

utilizzata per la PCR però è DNA dipendente, perciò devo utilizzare il metodo della RT-

PCR (reverse trascriptase PCR) che consente di retroscrivere l’mRNA in cDNA, che

verrà successivamente utilizzato come stampo.

La reazione è a catena, è un ripetersi di cicli che hanno diversi step, in vitro, che

comprendono la denaturazione del DNA, l’annealing dei primer e la loro estensione,

che porta ad un accumulo

esponenziale del frammento

specifico in studio.

1. Denaturazione del DNA

templato (95 °C), 1 min

2. Appaiamento tra primer e

singolo filamento templato

(35-65 °C), 30 sec

3. Allungamento del primer

(72°C), 2 min

Il tutto ripetuto per 30-40 cicli.

In vitro il sistema è controllabile dall’esterno. In una cellula la temperatura fisiologica è

di 37 gradi. Nella PCR ricorro ad una temperatura di 95 gradi per denaturare il DNA

templato a doppio filamento. Ho bisogno di questa temperatura per rompere i legami

a idrogeno tra le basi dei due filamenti, che sono molto forti. Grazie all’energia termica

vinco l’energia chimica dei legami H. il DNA sarà in sospensione quindi in acqua, a 95

gradi si rischia di far evaporare l’acqua, quindi le provette devono essere sigillate.

Durante la fase di annealing uso una temperatura che va dai 35 ai 65 gradi. Che

bisogno c’è di alzare la temperatura? Per aumentare la specificità: la temperatura di

annealing deve garantire il perfetto appaiamento (100%) tra primers e DNA templato.

Temperature basse potrebbero consentire appaiamenti parziali (quindi amplificazione

di regioni non specifiche). La temperatura di lavoro dipende dal contenuto in GC del

primer.

Per resistere alle temperature di denaturazione utilizzo DNA polimerasi particolari, le

Taq polimerasi, che sono termoresistenti. Taq DNA Polymerase è una DNA polimerasi

termostabile che possiede un’ attività 5 '→ 3' e un’ attività nucleasica 5 '.

Uno degli inconvenienti di Taq dell’ attività di proofreading esonucleassica 3 '-> 5' è

una fedeltà di replicazione relativamente bassa. Alcune DNA polimerasi termostabili

sono state isolate da altri batteri e archaea termofili, come il DNA di Pfu polimerasi, in

possesso di un'attività di correzione di bozze e vengono utilizzate al posto di (o in

combinazione con) Taq per l'amplificazione ad alta fedeltà.

Taq produce prodotti a DNA che hanno sporgenze A (adenina) alle estremità dei 3 '.

Questo può essere utile nella clonazione TA, per cui un vettore di clonazione (come un

plasmide) ha una sporgenza T (timina) 3 'che si integra con la sporgenza A del

prodotto PCR, consentendo così la legatura del prodotto PCR nel plasmide

vettore.

Il ritmo della PCR è di tipo esponenziale,

perché i prodotti diventano a loro volta

stampi per creare altri prodotti. Nella fase

di saturazione diventa limitante la quantità

di primers e desossiribonucleotidi trifosfati.

La DNA polimerasi si ferma e potrebbe

utilizzare la sua attività nucleasica quindi si

arriva in una fase di stallo. Bisogna

considerare l’efficienza della polimerasi,

con un’efficienza del 100% la quantità di

DNA raddoppia. I prodotto del primo ciclo

non è il prodotto che ci interessa (filamento

lungo).

In una reazione tipica, il prodotto di PCR si

raddoppia ad ogni ciclo dell'amplificazione.

Siccome sono necessari parecchi cicli

affinché abbastanza prodotto sia rilevabile, il diagramma della fluorescenza sul

numero dei cicli esibisce un andamento sigmoide.

Nei cicli finali, i substrati di reazione iniziano a scarseggiare, i prodotti di PCR non

raddoppiano e la curva comincia ad appiattirsi. Il punto sulla curva in cui la quantità di

fluorescenza comincia ad aumentare velocemente, solitamente alcuni scarti quadratici

medi sopra la linea di base, è chiamato il ciclo soglia (valore di Ct). Il diagramma di Ct

su DNA stampo è lineare, così un confronto dei valori di Ct fra reazioni multiple

permette di calcolare la concentrazione dell'acido nucleico che si vuole quantificare.

La pendenza di questa linea fornisce inoltre una misura dell'efficienza della PCR. Alcuni

strumenti permettono agli utenti di generare delle curve di melting che seguono il

completamento della PCR. Le curve di melting forniscono un'indicazione della purezza

del prodotto di reazione e rivelano la presenza di dimeri degli inneschi.

La detection avviene con coloranti fluorescenti oppure con sonde o primers

fluorescenti.

Intercalating dyes come SYBR GREEN. Nelle tre fasi l’emissione dell

 afluorescenza avviene SOLO nela fase di extention.

Fluorescent PCR primer- and probe-based chemistries

 Hydrolisys (TaqMan) probes

 Molecular beacons

 Dual hybridization probes

 Eclipse probes

 Amplifluor assays

 Scorpions PCR primers

 LUX PCR primers

 QZyme PCR primers



Intercalating dyes

Sono meno costose rispetto alle sonde di ibridazione. Si tratta di una strategia basata

sulla colorazione a fluorescenza, che permette di vedere l’amplificazione totale.

Le sonde utilizzate per la real time PCR emettono fluorescenza solo quando si

intercalano nella doppia elica. L’etidio bromuro è 25 volte più fluorescente quando

legato al dsSNA. La sonda più utilizzata è il SYBR GREEN, emette una fluorescenza

verde ed è più sensibile e meno tossica del bromuro di etidio, è 200 volte più

fluorescente quando legata al dsDNA.

The hydrolysis (TaqMan) probe method

Mentre le intercalting dyes non sono specifiche, altre tecniche si basano sull’utilizzo di

oligonucleotidi marcati. La tecnologia TaqMan utilizza un oligonucleotide che appaia

all’interno della regione bersaglio amplificata in PCR ed è marcato con un reporter

fluorescente (per esempio la fluorescina) ad un’estremità e un quencher (per esempio

la rodamina) all’altra estremità. Le due sonde sono vicine finché l’oligonucleotide non

appaia il DNA (e quindi si ha quenching della fluorescenza del reporter per via di

FRET)., a quel punto l’attività 5’->3’ esonucleasica della Taq idrolizza l’oligonucleotide

liberando il reporter fluorescente.

Il primer si appaia al templato, il reporter si appaia all’estremità 3’. L’energia viene

assorbita e inattivata dalla vicinanza tra il quencher e il reporter. Il reporter fa

registrare la fluorescenza, mentre il quencher attenua (quando i due sono vicini non ho

emissione di fluorescenza, il quencher e’ troppo vicino al reporter, ma se agisce la taq

polimerasi essa degrada la sonda, allontanando la porzione che contiene il reporter da

quella che contiene il quencher e si ha l’emissione del segnale). L’attività

nucleasica 5’

delle polimerasi

termostabili usate

nella PCR

tagliano le sonde

di idrolisi durante

lo step di

estensione

dell’amplicone,

che separa il

reporter

fluoroforo ® dal

quencher (Q). la

fluorescenza

emessa quando

eccitata da una

luce esterna (hv)

è proporzionale

alla quantità di

prodotto formato

durante ogni ciclo

di PCR.

Esistono anche

delle sonde con

un doppio

quencher, le quali

permettono un

aumento della

sensitività del

saggio.

Analisi dei risultati

Per quantificare i risultati ottenuti dalla real- time PCR vengono utilizzate due

strategie:

1. Il metodo della curva standard

2. Il modello della soglia comparativa Il metodo della curva

standard

In questo metodo viene

costruita una curva standard

di un RNA a concentrazione nota. Questa curva è poi utilizzata come una referenza

standard per estrapolare informazioni quantitative per mRNA targets con

concentrazioni ignote.

Sebbene RNA standard possano essere usati, la loro stabilità può essere una fonte di

variabilità nelle

analisi finali. Inoltre, l'uso di RNA standard comporterebbe la sintesi di cDNA

plasmidico che deve essere trascritto in vitro nell’ RNA standard e quantificato con

precisione, un processo che richiede tempo. Tuttavia, l'uso di RNA standard

quantificato aiuterà a generare dati di numeri di copie assolute.

Oltre all'RNA, è possibile utilizzare altri campioni di acido nucleico per costruire la

curva standard, compreso dsDNA plasmidico purificato, ssDNA generato in vitro o

qualsiasi campione di cDNA che

esprime il gene bersaglio. Le misure spettrofotometriche a 260 nm possono essere

utilizzate per

valutare la concentrazione di questi DNA, che possono quindi essere convertiti in un

valore numerico di copia basato sul peso molecolare del campione utilizzato. i plasmidi

di cDNA sono i

standard preferiti per la quantificazione della curva standard. Tuttavia, poiché i

plasmidi di cDNA

non controllano per le variazioni nell'efficienza della fase di trascrizione inversa,

questo metodo

fornirà solo informazioni sui cambiamenti relativi nell'espressione di mRNA. Questo, e

la variazione

introdotta a causa di input variabili di RNA, può essere corretto da un housekeeping

gene.

Il modello della soglia comparativa

Ct (treshold cycle), cioè il ciclo soglia, rappresenta l’intersezione tra una curva di

amplificazione e una linea soglia. È una misura relativa della concentrazione del

bersaglio (target) nella reazione di PCR.

Esiste una correlazione tra Treshold ecycle e quantità di templato.

Questo approccio comporta il confronto dei valori Ct dei campioni di interesse con un

controllo o calibratore come un camp