Riassunto esame Metodologie biochimiche, Prof. Cappiello Mario, libro consigliato Biochimica, Lehninger

SDS PAGE

SDS presenta zona apolare e testa polare che è solfato, è una molecola anfipatica. Cosa succede se tratto proteina con SDS?

Parte apolare per fattori entropici interagisce con core proteina mentre invece il solfato terrà legami con acqua. Proteina in pratica si denatura! Carica propria viene così a mascherarsi. Tutte le proteine presentino lo stesso rapporto carica/massa, allora la loro migrazione dipenderà esclusivamente dalle proprietà di setaccio molecolare del gel e quindi dalle dimensioni delle proteine.

SDS si lega in maniera costante a tutte proteine e quindi tutte proteine vengono ad avere tutte stessa intensità di carica! Quindi se si sottopone proteine denaturata sua separazione avverrà solo in base a suo peso molecolare ma non dalla sua carica che oramai è mascherata da SDS.

È sufficiente usare SDS per denaturare completamente proteina?

Se ci fossero ponti disolfuro ho bisogno di agente riducente che riduca

ponti disolfuro, sia quelli intracatena che intercatena. Si aggiunge dunque Bmercaptoenatolo. Riduce ponti disolfuro. Betamercaptoetanolo si o no ci dà informazioni strutturali sulla proteina. Perché in funzione della rottura dei ponti disolfuro posso avere o subunità di una proteina o proteina intera. Posso usare SDS per avere idea del grado di purificazione di una certa proteina. Cosa è purificazione?

Processo che mi porta a isolare proteina da tutte le altre proteine del campione di partenza. Nel processo di purificazione lo scopo è allontanare proteine che non ci interessano. Per avere idea del grado di purificazione nel corso del processo è quello di andare a vedere quali proteine sono presenti nel nostro campione di partenza. Dopo ogni stadio di purificazione vado a elettroforesi e man mano che proteine diminuiscono e diminuiranno anche numero delle bande. Se alla fine ottengo un'unica banda probabilmente ho ottenuto la mia

molecolare? 
Se proteina è fatta di un'unica subunità allora si ci darà peso molecolare della proteina ma se invece proteina è costituita da più subunità allora no. Ma se proteina è fatta da 3 subunità uguali? Otterrei sempre la stessa banda. Quello che si trova con elettroforesi quindi non è il peso molecolare della proteina nativa ma delle eventuali subunità di cui la proteina è costituita. Non della proteina nativa! Come faccio a determinare il peso della proteina nativa? 
Ultracentrifugazione permette di farlo. Quindi da una sola elettroforesi in sds non possiamo trarre conclusioni sul peso molecolare della proteina nativa. Non sappiamo quante subunità presenta quindi non possiamo nemmeno dire il peso molecolare. Proteine si separano in base a dimensione... proteine più grandi saranno vicine all'origine mentre più piccole saranno più lontane vicino al fronte in funzione della mobilità.

elettroforetica. Faccio curva di calibrazione con standart con proteine a peso molecolare noto. Insieme al mio campione farò correrestandard che conterrà proteine a peso molecolare noto. Quindi so dove si andranno a localizzare queste proteine a pesomolecolare noto. Determino Rf proteina 1 = distanza dall'origine / distanza dal fronte. Per ogni banda posso determinare rf... se ho 6 proteine nello standard otterrò 6 Rf. Rf può assumere valori compresi fra 0 e 1... zero non entra nel gel perché troppo grande mentre 1 così piccola che viaggia col fronte. Ora costruisco curva di calibrazione e ottengo retta se riporto il logartimo del peso molecolare sulle y in funzione del Rf. Banda 1 ha maggiore logPm e minor Rf, banda 2 ha Pm un po' più piccoli e Rf un po' più grande. Quindi ottengo: Tutte proteine con dimensione maggiore del poro più grande del nostro gel non riusciranno a entrare nel gel e quindi avranno rf pari a zero. Stessa cosa

varrà per chi ha rf = 1 quindi non vengono ostacolate da maglie del gel motivo per cui realmente non si ottiene retta ma sigmoide di cui ci interessa parte lineare!

Le proteine trattate con B-mercaptoetanolo e SDS si comportano come se avessero tutte la stessa forma e un uguale rapporto carica/massa. La loro mobilità sarà influenzata dalla loro dimensione: più piccola è la proteina, più velocemente si muoverà attraverso le maglie del gel di poliacrilammide.

Pertanto se una proteina di peso molecolare sconosciuto viene sottoposta a SDS-PAGE insieme con più proteine di peso molecolare noto, si può risalire al peso molecolare della proteina incognita dalla curva di calibrazione. Ma ricorda: quello che si trova con elettroforesi quindi non è peso molecolare della proteina nativa ma delle eventuali subunità di cui proteina è costituita. Non della proteina nativa!

ISOELECTROFOCUSING: Separa proteine sulla base del punto isoelettrico.

cui applichiamo differenza di potenziale su gel?

All'anodo abbiamo ioni positivi mentre al catodo avremo ioni negativi. Ioni h+ vanno al catodo(-) e ioni OH- verso anodo(+) e si crea gradiente in cui sono rappresentati tutti i vari pH da 3 a 10: pH acido in corrispondenza del polo positivo e basico in corrispondenza del polo negativo. Non sarebbe gradiente stabile perché tenderebbe a dissiparsi molto rapidamente! Si usa quindi tampone... c'è da trovare modo di tamponare i vari pH presenti lungo la striscia di gel. Come si fa a tamponare il gradiente che si è formato? Si usano le anfoline che devono tamponare un intervallo di pH abbastanza ampio quindi cosa dovranno presentare? Curva di titolazione degli amminoacidi, in corrispondenza dei pk di dissociazione. Posso avere concentrazione di OH- che varia ma il pH non cambia! Quando il loro pk è vicino al pH, un gruppo funziona bene da tampone circa fra 1,5 unità di pH sotto e 1,5 unità di pH sopra. Quindi

Anfoline dovranno avere gruppi con pK sidissociazione diversi per coprire tutto intervallo di pH.

Campione con nostre proteine viene depositato su nostro gel e si procede a separazione.

Nel punto in cui noi abbiamo applicato proteine troviamo un certo pH magari 6,5. Qui ci saranno proteine cariche positivamente, negativamente o addirittura con carica nulla. In funzione del loro punto isoelettrico saranno positive o negative. Quindi ora migrano in funzione della loro carica netta in funzione del loro punto isoelettrico. Proteine camminano finché non trovano loro punto isoelettrico, qui si fermano per carica nulla e non sono più soggette a campo elettrico.

In linea teorica non è importante punto in cui carico il mio campione ma in pratica dobbiamo fare considerazione della denaturazione delle proteine legato al pH! Se carico proteine in un punto del gradiente in cui pH è o troppo elevato o troppo basso rischio di denaturare proteine e precipiterebbero nel gel e non si

Un cilindro di gel viene depositato su una lastra di gel. A questo punto si procede alla seconda separazione, che è una normale SDS PAGE. Alla fine, le proteine si separano in base al loro P.I. e poi in base alle dimensioni. Questa tecnica ci permette di visualizzare tutte le proteine presenti in un estratto cellulare.

Consideriamo una malattia caratterizzata da un difetto in una certa proteina, che magari viene prodotta in quantità ridotta. Facendo elettroforesi bidimensionale su un soggetto sano o su un soggetto affetto, vedremmo l'assenza di uno spot. Dovremmo quindi vedere un'alterazione nel proteoma. Il problema è che queste alterazioni non sono visibili a occhio nudo, infatti si fa uso di software per visualizzare gli spot, la cui intensità risulta alterata rispetto al controllo. Il software confronta le macchie e identifica quelle con intensità maggiore o minore. Con questa tecnica è possibile analizzare il proteoma di un campione.

Finora abbiamo dato per scontato le macchie sul gel, ma perché? Perché utilizziamo dei coloranti.