Riassunto esame Immunologia e Immunopatologia

DIFFERENZIAZIONE

Nel midollo osseo, o nel fegato fetale, sono presenti le cellule staminali pluripotenti (HSC) da cui origineranno tutte le cellule circolanti: le

HSC midollari daranno origine ai linfociti B circolanti e ai precursori dei T che, spostandosi al timo, daranno origine alla linea T αβ mentre

le HSC del fegato fetale daranno origine alle B-1 o ai precursori dei linfociti T γδ.

Il processo di differenziazione è dato dall’attivazione di recettori che inducono lo smascheramento del locus per le Ig (nel caso dei linfociti

B) o del locus genetico per la catena β del TCR (per i linfociti T) che, attivati da specifici fattori di trascrizione, daranno vita alle cell

mature. Tra i fattori trascrizionali ricordiamo:

Notch-1 La pt intracellulare della proteina di membrana della famiglia Notch si porta nel nucleo e collabora con il fattore di

 

trascrizione GATA3 per differenziare i linfociti T αβ. Sono presenti altre molecole che regolano lo sviluppo delle singole

componenti del TCR

EBF e E2A Permettono l’espressione del fattore di trascrizione Pax-5 e insieme a questo determinano il differenziamo dei

 

linfociti B perché vengono trascritte le proteine Rag-1 e Rag-2 (surrogate catene leggere – esterne) e Igα e Igβ (trasduzioni del

recettore pre-B).

Le prime fasi della differenziazione sono guidati dalla stimolazione di citochine: nell’uomo IL-7 determina lo sviluppo dei linfociti T

(mutazioni al recettore per IL-7 causano immunodeficienza combinata legata al cromosoma X – mancano linfociti T e cell NK) e viene

sintetizzata dalle cell stromali del midollo osseo e dalle cell epiteliali del timo.

E’ stato dimostrato che IL-7 determina SOLO lo sviluppo sino al riarrangiamento dei geni per l’antigene: la fase proliferativa, invece,

avviene solo nell cell (SELEZIONATE) che avranno completato il processo di riarrangiamento in modo corretto e permetterà di ottenere

cell pre-B o pre-T, prive della capacità di riconoscere l’antigene ma importanti per la sopravvivenza, proliferazione e differenziazione

successiva.

La differenziazione e maturazione del linfocita è anche regolata dalla presenza dei miRNA (micro RNA) che sono RNA endogeni,

processati da un endoribonucleasi in Drosha (miRNA corti a forcina) che è in grado di trasferirsi nel citoplasma dove viene ulteriormente

processata a Dicer che infine, crea miRNA corti che possono associarsi perfettamente (porta a degradazione) o meno perfettamente

(limita la trascrizione) al mRNA cellulare.

MATURAZIONE LINFOCITARIA – RIARRANGIAMENTO GENI

Fase fondamentale della maturazione linfocitaria che è indipendente dalla presenza dell’antigene: da una piccola quota di geni è

possibile, per mezzo del fenomeno di riarrangiamento, produrre un numero enorme di pt variabile di Ig e TCR.

RIARRANGIAMENTO Processo nel quale si osserva il riarrangiamento di segmenti genetici della regione variabile (V), della regione



della diversità (D) e della regione della ricongiunzione (J) nel processo di ricombinazione V(D)J.

Nel periodo germinativo, quando ancora i segmenti non sono riarrangiati, le struttura del genoma è fondamentalmente simile per tutte le

cellule: si osservano sequenze tra loro separate che vengono poi tra loro unite per dare vita al singolo linfocita.

ORGANIZZAZIONE LOCI IG Si distinguono tre loci, uno per la catena pesante (Ig H) e due per le catene

leggere (k e λ) su cromosomi diversi: all’estremità 5’ di ognuno di questi

loci si osservano le sequenze V (per la regione variabile) che sono costituite

da c.ca 300 basi distribuite su uno spazio di c.ca 2000 basi che sono

antecedute dalla sequenza leader, codificante per l’estremità N-terminale

con la sequenza segnale che permette di portare il recettore nel RE, dove la

sequenza viene persa e poi vs la membrana plasmatica.

A seguire, si trova la sequenza D (SOLO PER Ig H) che codifica per la

regione variabile di Ig H e dopo questa, in tutti i loci, le sequenze J che

codificano per le pt distali della regione variabile.

Dopo le sequenze V(D)J, per le regioni V delle catene pesanti, e le sequenze VJ, per le regioni V delle catene variabili (D e J e le parti

intermedie, inoltre, codificano per il segmento ipervariabile CDR3 mentre il segmento J-C codifica per CDR1 e CDR2) si osservano le

regioni C, che codificano per i segmenti C dell’Ig: per Ig-k (catena leggera) è presente solo C , per Ig-λ si osservano 4 geni mentre per

K

Ig-H si osservano 9 geni (per i 9 isotipi) ognuno dei quali è costituito da 6 esoni di cui 4 per la parte N-terminale (della regione C) e 2

per la parte C-terminale.

Le sequenze NON CODIFICANTI sono importanti per la ricombinazione e in esse sono presenti anche diversi promotori.

ORGANIZZAZIONE LOCI per TCR I loci α (contiene all’interno il locus δ), β e γ sono su tre

cromosomi diversi: i loci β e γ contengono anche la seqeunza D.

All’estremità 5’ sono presenti le sequenze V con il segmento

leader mentre all’estremità 3’ sono presenti le sequenze C (2per

β e γ e uno per α e δ): ogni C è composto da 4 esoni codificanti

per il dominio Ig extracellulare e per la pt intracellulare.

In α e γ la regione –V è codificata dagli esoni V+J mentre per le

catene β e δ dagli esoni V(D)J.

RICOMBINAZIONE V(D)J

L’organizzazione vista sopra è uguale per tutte le cellule, non dà vita a mRNA maturi e, solo in alcune, dà origine al fenomeno di

ricombinazione V(D)J nel quale si osserva la scelta di un gene V, una sequenza J (ed eventualmente una D) che vengono tra loro

riarrangiate a formare un esone solo che viene poi raggiunto da specifici enzimi che daranno, inzialmente, vita ad un RNA prematuro

(esone V(D)J + introne + sequenza C) che per mezzo di splicing diverrà un mRNA (esone V(D)J + sequenza C) che va incontro ai

fenomeni di trascrizione.

Ricombinazione catene leggere Ig + catene α e γ TCR La ricombinazione avviene in una sola fase perché non è presente il



segmento D

Ricombinazione Ig H + catene β e δ TCR La ricombinazione avviene in due fasi: dapprima si osserva la congiunzione D+J e



solo in seguito DJ+ V.

Il processo di ricombinazione avviene in quanto, nei vari loci, sono presenti le RSS (Recombination signal Sequences): queste si

localizzano a valle 3’ di V e a monte 5’ di J (e ad entrambi i lati di D) e sono costituite da un epatamero -6 nucleotidi- altamente

conservato ed un nonamero -9 nucleotidi- separati da sequenze spaziatrici di 12 o 23 nucleotidi (1o 2 passi di elica di DNA).

Riarrangiamento DELEZIONE – Si osserva taglio al 3’ di V e all’estremità 5’ di J: il segmento tagliato viene riosso e si

ricongiungono le due sequenze ora adiacenti V+J

Riarrangiamento per INVERSIONE (50% delle catene leggere K Ig)– Alcuni geni V sono posti secondo lo stesso orientamento dei

J e questo fa sì che le RSS non siano in corrispondenza tra loro: è necessario, pertanto, invertire l’orientamento del DNA

intermedio tra V e J, cosicchè le RSS si vengano a localizzare al 3’ di J. In questo processo non avviene delezione delle RSS ma

queste si localizzano a valle.

Affinchè il processo di ricombinazione sia regolato si noti la “REGOLA 12/23”: secondo questa regola la ricombinazione avviene solo tra

due segmenti nei quali uno è seguito da uno spaziatore di 12 (1 passo di elica) e uno è seguito da uno spaziatore di 23 nucleotidi (2

passi di elica): questo è fondamentale nella ricombinazione che prevede la presenza di D in quanto il segmento V e quello J sono seguiti

da due spaziatori 23 e, pertanto, è necessario, dapprima che si venga a creare un segmento JD e solo successivamente viene associato

(quando è “presente” la regola 23) il segmento V.

*Nel processo di ricombinazione viene spesso avvicinata la sequenza promotore 5’ di V ad un enhancer 3’ di J: questo spiega la

massima trascrizione ad alta velocità dei geni V ma soprattutto permette l’inclusione non controllata di nucleotidi estranei nell’esone

codificante ed è la causa di alcuni tumori linfoidi.

Il processo di ricombinazione si svolge su più fasi e sono coinvolti DSBR, enzimi presenti SOLO nella fase maturativa dei linfociti:

1. SINAPSI – Le parti del cromosoma sono resi accessibili (cromatina aperta) e segmenti e RSS si pongono i in contatto formando

strutture ad anello (vedi pg. 183 Abbas)

2. TAGLIO – Per reazione enzimatica sono operati tagli tra RSS e sequenze codificanti da parte delle proteine Rag-1 e Rag-2:

queste proteine si associano in un tetrameto detto ricombinasi dove Rag-2 è necessaria all’attivazione di Rag-1 che, a sua volta,

riconosce la regione posta tra sequenza codificante +RSS (eptamero) ed esegue il taglio generando, nelle due estremità delle

sequenze codificanti una struttura a forcina detta hairpin.

Le due hairpin si trovano, dunque, giustapposte, e le parti RSS si trovano tra loro giustapposte e non subiscono ulteriore

processazione.

3. PROCESSAMENTO – Le estremità hairpin vengono aperte per azione dell’endonucleasi artemis e si vengono a formare due

diverse catene nucleotidi con diversa lunghezza: la TdT (desossinucleotidiltransferasi terminale) ha il compito di riallineare le

due catene aggiungendo nucleotidi a caso (detti poi NUCLEOTIDI P).

Altri nucleotidi casuali vengono poi aggiunti tra le due estremità (detti NUCLEOTIDI N), ovvero tra le sequenza J e V che

corrispondono alle sequenza che codifica per la regione ipervariabile CD3 (questo è l’evento che genera la max variabilità).

4. UNIONE – Le proteine Ku70 e Ku80 ricongiungono le terminazioni e richiamano l’enzima DNA-PK che “ripara” la doppia elica

generando un esone codificante. Si ha un esone che codifica per RNA immaturo che viene poliadenilato in 3’ e poi va incontro a

splicing per ottenere mRNA maturo che viene quindi trascritto.

Tra i processi che generano la massima variabilità cellulare ricordiamo la associazione CAUSALE tra i diversi geni presenti in V e le

sequenze J (e D quando presenti) che possono dare origine a c.ca 1000 associazioni diverse ma, soprattutto, il fenomeno di aggiunta dei

nucleotidi P e N (10 possibili recettori a partire dal singolo linfocita in maturazione).

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*In base alla variabilità si diagnostica la presenza di tumori: un tumore è dato dall’espansione di un singolo clone linfocitario che

presenterà UN solo tipo di recettore, pertanto, l’analisi PCR, ci permette di valutare se il recettore presenta, nella regione ipervariabile,

sequenze diverse (normale espansione linfociti) o la stessa sequenza (neoplasia da clone).

PUNTI di CONTROLLO della MATURAZIONE

1. PRE-RECETTORI – Il riarrangiamento dei geni permette di creare i pre-rece