Riassunto esame Genomica ed elementi di genetica statistica, prof. Novelletto, libro consigliato Genomi 4, Brown

Sommario

Genomi, trascrittomi e proteomi ................................................................................................... 3

DNA ............................................................................................................................................ 4

RNA e trascrittoma ..................................................................................................................... 8

Proteine e proteoma ................................................................................................................ 12

Studiare il DNA ............................................................................................................................. 16

Enzimi per la manipolazione del DNA ....................................................................................... 17

Reazione a catena della polimerasi .......................................................................................... 23

Clonaggio del DNA .................................................................................................................... 25

Sequenziamento dei genomi ........................................................................................................ 30

Sequenziamento Sanger ........................................................................................................... 30

Sequenziamento NGS ............................................................................................................... 35

Come sequenziare un genoma ................................................................................................. 40

Annotazione del genoma ............................................................................................................. 45

Annotazione del genoma mediante analisi al computer della sequenza di DNA ...................... 45

Annotazione del genoma mediante analisi dei trascritti dei geni............................................. 50

Identificare le funzioni geniche .................................................................................................... 53

Analisi al computer della funzione di un gene .......................................................................... 53

Assegnare una funzione mediante inattivazione o sovraespressione genica ........................... 54

Comprendere la funzione di un gene attraverso studi sul pattern di espressione e sul prodotto

genico ....................................................................................................................................... 56

Catalogazione dei dati degli elementi del DNA ............................................................................ 59

Genoma nucleare eucariotico ...................................................................................................... 61

I genomi nucleari sono contenuti nei cromosomi..................................................................... 61

Come sono organizzati i geni in un genoma nucleare? ............................................................. 66

Organizzazione del genoma umano.............................................................................................. 75

Geni che codificano proteine .................................................................................................... 76

I geni per RNA ........................................................................................................................... 80

DNA ripetitivo ........................................................................................................................... 81

Il DNA mitocondriale ................................................................................................................ 87

Come si accede al genoma ........................................................................................................... 91

All’interno del nucleo ............................................................................................................... 91

Modificazioni del nucleosoma ed espressione del genoma ...................................................... 96

Modificazioni del DNA ed espressione del genoma ................................................................ 100

Analisi di espressione genica ...................................................................................................... 104

1

Ibridazione molecolare ........................................................................................................... 104

Altre tecniche per l’analisi dell’espressione genica ................................................................ 109

Mutazioni e riparazione del DNA ............................................................................................... 113

Cause delle mutazioni............................................................................................................. 115

Meccanismi di riparazione delle mutazioni e altri tipi di danno al DNA ................................. 121

Evoluzione dei genomi ............................................................................................................... 128

Evoluzione di genomi sempre più complessi .......................................................................... 128

Studio del genoma degli ultimi 6 milioni di anni .................................................................... 136

Diversità genomica intraspecifica ............................................................................................... 141

Il progetto 1000 genomi ......................................................................................................... 142

Teoria della coalescenza ......................................................................................................... 144

Caratterizzazione del genotipo e linkage disequilibrium ........................................................ 144

Trasmissione di caratteri quantitativi ..................................................................................... 148

Microbiota intestinale, metaboliti e immunità dell’ospite ......................................................... 158

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Genomi, trascrittomi e proteomi

La genomica è una scienza che studia il contenitore dell’informazione genetica che è per la gran

parte il DNA mentre alcuni virus hanno genomi a RNA.

La genomica è costituita da tutta una serie di sottoclassi:

→

- Genomica comparata studio di funzioni e strutture della genomica confrontando specie

diverse. Come questa immagine che mette a

confronto cariotipi di grandi primati.

- Genomica funzionale

- Genomica strutturale

- Genomica di popolazione

- Epigenetica

- Metagenetica

Questa immagine mette a confronto la grandezza del DNA in base alla classe di organismi:

• I virus hanno il genoma più piccolo. Possiedono un

genoma che va da 30 mila pb fino anche a un milione di pb.

• I batteri invece presentano una dimensione maggiore

rispetto ai virus. Le dimensioni vanno da un milione fino a

decine di milioni.

• 7 8

I funghi hanno dimensioni del genoma da 10 fino 10

• 8

Le piante hanno dimensioni del genoma che va da 10

11

fino a 10

• Gli animali hanno un’ampia gamma di grandezza del

7 11

genoma, da 10 a 10 . In particolare i mammiferi hanno un genoma costituito da qualche

miliardo di basi.

Il genoma umano, similmente ai genomi di tutti gli animali multicellulari, è costituito da due

componenti distinte:

• Il genoma nucleare di 46 cromosomi è raggruppato in 23 molecole lineari ognuna facente

parte di un diverso cromosoma. Questi 23 coppie di cromosomi consistono in 22 autosomi e

due cromosomi sessuali X e Y. In totale il genoma umano nucleare contiene circa 45.500 geni.

• il genoma mitocondriale rappresenta solo una piccolissima porzione di 16.569 pb e 37 geni. Si

trova all’interno di mitocondri.

Nelle cellule vegetali oltre al DNA che si trova nei mitocondri vi è quello che si trova nei cloroplasti.

Il genoma è quindi la base in cui è racchiusa tutta l’informazione per far funzionare un organismo.

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Ognuna delle 10 cellule del corpo umano adulto ha la propria copia o copie del genoma nucleare,

fatta eccezione per quelle poche cellule che, come i globuli rossi del sangue, allo stadio totalmente

differenziato sono prive di nucleo.

La maggior parte delle cellule, dette somatiche, è diploide con 46 cromosomi mentre le cellule

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sessuali o gameti sono aploidi e hanno solo 23 cromosomi. Ogni cellula possiede copie multiple di

genoma mitocondriale.

Il genoma è il magazzino dell’informazione genetica ma da solo sarebbe incapace di trasmettere

questa informazione alla cellula. L’utilizzazione dell’informazione biologica contenuta nel genoma

richiede l’attività coordinata di enzimi e altre proteine, che partecipano ad una serie complessa di

reazioni biochimiche note nell’insieme come espressione genica. Il primo prodotto

dell’espressione genica è il trascrittoma, l’insieme di copie di RNA di geni codificanti proteine

attive, la cui informazione è richiesta dalla cellula in quel momento. Il trascrittoma si forma in

seguito a un processo chiamato trascrizione, in cui i singoli geni vengono copiati in molecole di

RNA. Il secondo prodotto dell’espressione genica è il proteoma che corrisponde all’insieme di

proteine presenti in un organismo, che determina la natura delle reazioni biochimiche che una

cellula è in grado di eseguire. Le proteine che costituiscono il proteoma derivano dalla traduzione

di singole molecole di RNA presenti nel trascrittoma.

La biologia dei sistemi tenta di collegare queste reazioni e processi in una rete che descriva la

funzione globale delle cellule e degli organismi viventi.

DNA

Il DNA è stato scoperto nel 1869 da Miescher ma solo nel 1930 venne dimostrata la sua funzione

come materiale genetico.

Due diversi esperimenti hanno permesso di dimostrare come il DNA sia il materiale genetico:

• esperimento di Griffith (Avery-MacLeod-McCarty): Si sono presi in considerazionei batteri

Streptococcus pneumoniae, che producono la polmonite nell’uomo, e in particolare due ceppi:

un ceppo virulento S (che presenta un rivestimento proteico che prende il nome di capside) e

un ceppo R non virulento rugoso (non possiede il capside di rivestimento). Il ceppo S, anche

chiamato liscio, determinava la morte del topo e si

andava a posizionare a livello della membrana

pericardica.

Se si uccideva il ceppo S con il calore e si iniettava poi

nel topo non si aveva la morte di questo. Se invece si

iniettava il ceppo S morto e insieme il ceppo R non

virulento si vedeva come il topo moriva. Inoltre

analizzando il topo morto si vedeva come in prossimità

della membrana pericardica vi era la presenza del

ceppo S vivo.

Vi doveva quindi essere un principio di trasformazione

che determinava appunto la trasformazione dei batteri

R non virulenti in batteri S virulenti.

Per capire quale fosse il principio trasformante fu ogni

volta eliminato un costituente nel batterio (proteine,

RNA, DNA etc).

Solo quando veniva eliminato il DNA non si verificava la

trasformazione del ceppo non virulento a un ceppo virulento. Quindi era proprio il DNA il

principio trasformante. 4

• Esperimento di Hershey e Chase: l’esperimento venne effettuato utilizzando batteriofagi che

iniettano il loro materiale genetico uccidendo il

batterio e sfruttano i macchinari molecolari dei

batteri per riprodursi.

Presero in considerazione: un’aliquota di batteriofagi

in cui marcarono il DNA con fosforo 32 radioattivo e

un’aliquota di batteriofagi in cui marcarono le

proteine con zolfo 35 radioattivo. Ciò permette la

distinzione di proteine (che hanno zolfo) dal DNA

(che ha fosforo).

Le due aliquote vennero inoculate in una coltura

batterica in modo da far riprodurre i fagi. Dopo aver

aspettato che i fagi attaccassero i batteri, hanno

agitato per centrifugazione per staccare i fagi che

ancora non avevano attaccato i batteri. La

centrifugazione produsse la separazione dei batteri

(di peso maggiore) che andarono sul fondo formando il pellet mentre i batteriofagi solubili nel

brodo di coltura rimasero nel supernatante.

In seguito si è analizzata la radioattività che era presente nel pellet e quella presente nel

supernatante. È stata ritrovato nel pellet una radioattività di fosforo 32 che dimostrava che

all’interno del batteri vi era il DNA fagico, dimostrando come il DNA fosse la sede del materiale

genetico.

Il DNA è un polimero lineare, non ramificato le cui subunità monomeriche sono quattro nucleotidi

chimicamente differenti che possono essere legati insieme in qualsiasi ordine per formare catene

lunghe centinaia, migliaia o anche milioni di unità. Ogni nucleotide è formato da:

• Uno zucchero pentoso che è il 2’-deossiribosio. Deossi perché in posizione C2 è stato sostituito

un OH con l’H.

• al C1 del deossiribosio è legata una base

azotata. Le basi di DNA sono 4: adenina,

guanina, citosina, timina. L’adenina e la

guanina prendono il nome di purine mentre la

citosina e la timina prendono il nome di

pirimidine. La differenza è che le purine sono

costituite da due anelli mentre le pirimidine da uno solo.

• al C5 è legato un trifosfato. 5

Una molecola composta solamente dallo zucchero e dalla base prende il nome di nucleoside;

l’aggiunta del fosfato lo converte in nucleotide. Solo i nucleotidi trifosfato agiscono come substrati

per la sintesi di DNA.

Lo zucchero e il fosfato si legano per la polimerizzazione in filamenti con un legame fosfodiesterico

tra il primo fosfato e il 3’OH con liberazione di un gruppo pirofosfato. Questa è una reazione

endotermica in quanto richiede energia. Questo tipo di legame porta ad avere le due estremità

chimicamente distinte e ciò significa che il polinucleotide ha una direzione chimica espressa come

5’→3’ o 3’→5’. Tutti gli enzimi DNA polimerasi naturali sono in grado di realizzare esclusivamente

una sintesi 5’→3’, cosa che complica notevolmente il processo di replicazione del doppio

filamento di DNA.

La struttura del DNA è stata determinata da Watson e Crick. Per ottenere tale struttura si sono

basati su quattro tipi d’informazione:

1. I dati biofisici, come ad esempio la densità del DNA in una fibra;

2. Il rapporto tra le basi, scoperto da Chargaff, per cui il rapporto di adenina-guanina e citosina-

timina è 1 nelle molecole di DNA, suggerendo l’appaiamento tra le basi.

3. I profili di diffrazione di Rosalind Franklin che, sfruttando la diffrazione ai raggi X del DNA

cristallizzato, si accorse che questo avesse una struttura elicoidale a raggio fisso. Essendo a

raggio fisso ci doveva essere una contrapposizione tra una purina ed una pirimidina. Ci sono

quindi legami complementari tra citosina-guanina e adenina-timina.

4. La costruzione di modelli in scala delle possibili strutture del DNA, che è stata l’unica vera

tecnica che Watson e Crick hanno effettivamente sviluppato in prima persona e che ha

permesso di verificare la posizione relativa dei diversi atomi per permettere i legami a

idrogeno tra le basi.

La citosina e la guanina si legano mediante 3 legami idrogeno mentre timina e adenina con 2

legami idrogeno. Si formava un incastro perfetto che

formava un tubo a raggio costante.

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La doppia elica è quindi formata da due

filamenti di DNA uniti da legami zucchero-

fosfato che esponevano all’interno dell’elica le

basi azotate che si appaiano in maniera

complementare a formare la doppia elica con

precisa complementarietà.

La doppia elica ha un andamento destrorso e i

due filamenti corrono in direzioni antiparallele.

L’elica è stabilizzata da due tipi di interazioni

chimiche: l’appaiamento di basi tramite legami

a idrogeno; l’impilamento delle basi dato da

interazioni idrofobiche tra coppie di basi

adiacenti. Sia l’appaiamento che l’impilamento

delle basi sono importanti per mantenere insieme i due polinucleotidi, ma l’appaiamento ha

maggiore importanza per le sue implicazioni biologiche. Infatti la replicazione del DNA può

generare copie perfette della molecola parentale semplicemente usando i filamenti pre-esistenti

per dettare le sequenze dei nuovi filamenti. Si tratta di una sintesi di DNA templato dipendente e il

sistema è usato da tutte le DNA polimerasi cellulari.

La doppia elica descritta da Watson e Crick è detta forma B del DNA. Le sue caratteristiche

dimensionali sono: un

diametro costante di 2,37

nm, un’altezza di 0,34 nm

per coppia di basi, ed un

periodo, cioè la distanza che

intercorre tra le basi dopo un

giro completo di elica, di 3,4

nm che corrisponde a dieci

coppie di basi per giro. Si ritiene che il DNA nelle cellule viventi si trovi principalmente in

conformazione B.

Ora si sa che le molecole di DNA non sono uniformi in

struttura e ciò è dovuto al fatto che ciascun nucleotide

nell’elica è dotato di una flessibilità che gli permette di

assumere forme molecolari lievementi differenti.

La conformazione A è tipica di DNA esposto a diverse

umidità relative. Presenta un’elica destrorsa con diverse

caratteristiche dimensionali.

La conformazione Z invece a differenza delle altre due è

sinistrorsa. Lo scheletro zucchero-fosfato adotta

un’irregolare conformazione a zig-zag e la doppia elica è

più snella. Questa forma ricorre in regioni della doppia

elica contenenti ripetizioni del motivo GC.

La forma B del DNA non ha una superficie uniforme: al

contrario, due solchi si avvolgono a spirale per tutta la

lunghezza dell’elica. Uno di questi solchi è relativamente

ampio e profondo ed è chiamato solco maggiore, l’altro è stretto e meno profondo ed è chiamato

solco minore. Anche il DNA A ha due solchi, ma in questa conformazione il solco maggiore è

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ancora più profondo mentre il solco minore è meno profondo e più ampio. Il DNA Z è ancora

diverso