Riassunto esame Genomica ed elementi di genetica statistica, prof. Novelletto, libro consigliato Genomi 4, Brown

Meccanismi di riparazione delle mutazioni e altri tipi di danno al DNA

È essenziale che la cellula abbia sistemi efficienti di riparazione: senza di questi un genoma non sarebbe in grado di mantenere le funzioni cellulari essenziali per più di qualche ora prima che geni chiave vengano inattivati da danni al DNA. Analogamente, le cellule accumulerebbero errori di replicazione a una velocità tale che i loro genomi non sarebbero più funzionali dopo poche divisioni cellulari.

La maggior parte delle cellule possiede quattro categorie di sistemi di riparazione del DNA:

1. Sistemi di riparazione diretta che agiscono direttamente sui nucleotidi danneggiati, riconvertendo ciascuno alla propria struttura originale.
2. Riparazione per escissione (excision repair) che comporta l'escissione del tratto di polinucleotide contenente un sito danneggiato, seguita dalla nuova sintesi della sequenza nucleotidica corretta da parte di una DNA polimerasi.
3. Riparazione di mismatch che

corregge errori di replicazione, anche in questo caso mediante escissione di un tratto di DNA a singolo filamento che contiene il nucleotide errato, riparando poi lo spazio vuoto che si viene a creare.

4. Riparazione delle rotture a singolo o a doppio filamento.

Sono poche le forme di danno al DNA che possono essere riparate in maniera diretta. Queste includono i nick che possono essere riparati dalla DNA ligasi nel caso di una rottura di un legame fosfodiesterico senza danno ai gruppi 5’-fosfato e 3’-idrossile dei gruppi adiacenti. Questo è spesso il caso dei nick che derivano dagli effetti delle radiazioni ionizzanti.

Alcune forme di danno da alchilazione sono direttamente reversibili ad opera di enzimi che trasferiscono un gruppo alchilico da un nucleotide alle proprie catene polipeptidiche. In E. coli l’enzima Ada rimuove i gruppi alchilici legati all’ossigeno nelle posizioni 4 e 6 rispettivamente della timina e della guanina, e può anche riparare legami.

fosfodiestericiche abbiano subito alchilazione. Questo trasferimento èirreversibile quindi l'enzima Ada è un enzima suicida che diventainattivo dopo aver svolto la sua funzione. La versione metilata diAda agisce come fattore di trascrizione del regulone ada il qualeinclude geni per l'enzima Ada stesso e per altre tre proteinecoinvolte nella riparazione di danni. Anche gli eucarioti hannoenzimi di riparazione delle alchilazioni come MGMT (O6-metilguanina-DNA-metiltransferasi) che rimuove solamente gruppialchilici dalla posizione 6 della guanina. Negli eucarioti tuttavia questi enzimi non regolano latrascrizione e una volta alchilati vanno incontro a degradazione.

L'ultimo tipo di riparazione diretta coinvolge i dimeri ciclobutilici che possono essere riparati daun sistema dipendente dalla luce, chiamatofotoriattivazione. In E.coli il meccanismo coinvolgeun'enzima DNA fotoliasi che, quando stimolato dalla luce,lega i dimeri ciclobutilici e li

riconverte nei loro nucleotidi originali monomerici. Il cofattore di questi enzimi, l'acidofolico o un composto flavinico, cattura l'energia della luce che è poi usata per trasferire gli elettroni al dimerociclobutilico. Questa fotoriattivazione è presente in molti, ma non tutti i batteri e anche in pochi eucarioti tra cui diversi vertebrati, però non è presente nell'uomo e in altri mammiferi placentati.

Un tipo simile di fotoriattivazione coinvolge la fotoliasi del fotoprodotto (6-4) che può riparare questo tipo di lesioni. Né E. coli né l'uomo possiedono questo enzima, che è però presente in molti altri organismi.

I sistemi di riparazione mediante escissione sono di gran lunga prevalenti e sono in grado di correggere uno spettro molto ampio di mutazioni differenti. L'escissione di basi è il sistema meno complesso fra quelli che prevedono la rimozione di un nucleotide danneggiato ed è

minore della doppia elicadi DNA in cerca di nucleotidi danneggiati, anche se alcune potrebbero essere associate con glienzimi della replicazione.

Nel meccanismo short patch ci sono due vie possibili, quindi in totale abbiamo 3 meccanismi:

A. Short patch 1. Un’endonucleasi AP taglia il legame fosfodiesterico all’estremità 5’ del sito AP. Alcune endonucleasi AP possono anche rimuovere il ribosio dal sito AP, ciò che rimane del nucleotide danneggiato, mentre altre mancano di questa proprietà e quindi funzionano in associazione con una fosfodiesterasi. Alternativamente negli eucarioti il ribosio può essere rimosso mediante un’attività liasica posseduta dalla DNA polimerasi β. Il riempimento del gap avviene tramite una DNA polimerasi che usa la base non danneggiata 122 nell’altro filamento dellamolecola di DNA come stampo per assicurare che venga inserito il nucleotide corretto. Dopo il riempimento dello spazio, il legame

fosfodiesterico viene ripristinato da una DNA ligasi.

B. Short patch 2. Se la DNAglicosilasi è bifunzionale, essa può tagliare direttamente il legame in 3' del sito AP, probabilmente in contemporanea alla rimozione della base. Questo taglio è seguito dall'escissione del ribosio da parte di una fosfodiesterasi, della DNA pol β o dall'attività esonucleasica 5'-3' della DNA polI in E. coli. Anche in questo caso il riempimento del gap avviene prima con la DNA polimerasi e poi con la DNA ligasi.

C. Long patch. Il sito AP creato dalla DNA glicosilasi è tagliato al 5' da una endonucleasi AP ma questo non è seguito da ulteriori tagli. Invece, analogamente a quanto accade sul filamento in ritardo durante la replicazione, viene sintetizzato un frammento di 2-10 nucleotidi, di cui il primo è quello che sostituisce quello modificato inizialmente. Nei batteri la sintesi è condotta dalla DNA pol I con la sua

attività esonucleasica 5'-3'. Negli eucarioti la DNA pol δ e ε, mentre viene sintetizzato il nuovo polinucleotide, spiazza il corto segmento che viene poi rimosso grazie al taglio dell'endonucleasi FEN1.

La riparazione per escissione di nucleotidi ha una specificità più ampia del sistema di escissione di basi e può riparare forme di danno più estreme, come i cross links sullo stesso filamento e basi modificate da gruppi chimici ingombranti. È anche in grado di correggere i dimeri ciclobutilici mediante un meccanismo di riparazione al buio che permette di riparare questi dimeri negli organismi che non hanno un sistema di fotoriattivazione (come l'uomo).

Un segmento di DNA a singolo filamento contenente i nucleotidi danneggiati viene escisso e sostituito da nuovo DNA. Rispetto all'escissione di basi, questo meccanismo non è preceduto dalla rimozione selettiva delle basi e il tratto polinucleotidico escisso.

è più lungo.In E. coli c’è un meccanismo short-patch e uno long-patch. Il primo porta all’escissione di circa 12 nucleotidi. Questa è avviata da un complesso multienzimatico chiamato endonucleasi UvrABC. Nella prima fase un trimerocomprendente 2 UvRA e UvRB si lega al sito danneggiato. Il complesso individua probabilmente una caratteristica più generale del danno al DNA, come la distorsione della doppia elica. La proteina UvrA potrebbe essere la parte del complesso maggiormente coinvolta nella localizzazione del danno perché si dissocia una volta che il sito è stato localizzato, tramite l’energia fornita dall’ATP che viene usata per piegare il DNA e cambiare la conformazione della 123 proteina UvrB. Il rilascio di UvrA permette a UvrC di legarsi formando un dimero con UvrB che taglia il polinucleotide a entrambi i lati del sito danneggiato. Il primo taglio è al quinto legame fosfodiesterico a valle del nucleotide

danneggiato, mentre il secondo taglio è effettuato all'ottavo legame fosfodiesterico a monte, provocando un'escissione di 12 nucleotidi, anche se esiste una certa variabilità. Il segmento escisso viene poi rimosso, di solito come oligonucleotide intatto dalla DNA elicasi II o UvrD che presumibilmente rilascia il segmento rompendo gli accoppiamenti tra le basi che lo tengono legato all'altro filamento. A questo punto si distacca anche UvrC, mentre UvrB rimane al suo posto creando un ponte da una parte all'altra dello spazio prodotto dall'escissione. UvrB legata si ritiene possa impedire che la regione a singolo filamento formi accoppiamenti di basi intramolecolari, ma potrebbe anche proteggere questo filamento da eventuali danni o dirigere la DNA polimerasi verso il sito che deve essere riparato. Lo spazio viene riempito dalla DNA polimerasi I e il legame fosfodiesterico finale è sintetizzato dalla DNA ligasi. Lo studio della riparazione long-patch