Riassunto esame Genetica degli eucarioti superiori, Prof.ssa R. Cozzi, libro consigliato Introduzione alla genomica, Zanichelli

A G

amminoacido. Dal punto di vista evolutivo, la prima divergenza ha determinato la

separazione delle catene ε-γ e δ-β, circa 200 milioni di anni fa, e successivamente le

diverse sequenze si sono diversificate, l’origine più recente è quella delle γ-globine.

All’interno della

superfamiglia è stato

ipotizzato che la prima

divergenza, risalente alla

comparsa dei mammiferi,

ha portato alla

differenziazione in catene

α e catene non-α,

successivamente è

avvenuta la divergenza tra

i membri delle due

famiglie.

In entrambe le famiglia

sequenza dei geni nel

cluster riflette l’ordine

con cui le sequenze sono espresse nelle diverse fasi dello sviluppo, come dimostrato

dall’Hb.

Infatti, la struttura di tale proteina è diversa nell’embrione, nel feto e dopo la

nascita. A seconda della fase dello sviluppo embrionale, fino all’8° settimana, l’Hb si

presenta in tre forme diverse e successive, ζ2-ε2, ζ2-γ2 e α2-ε2. L’Hb fetale ha

struttura α2-γ-, mentre quella adulta α2-β2.

La sequenzialità dell’espressione durante lo sviluppo dell’organismo è garantita da un

complesso meccanismo basato su una

sequenza a monte, costituita da una serie

di siti ipersensibili (facilmente clivabili con

DNAsi), che rappresentano la zona di

regolazione dell’espressione e per

esplicare la propria funzione devono

giustapporsi ai promotori a monte dei

singoli geni. L’ipotesi più plausibile prevede

che nel corso dello sviluppo, nei cluster

avvenga una giustapposizione dei diversi

siti ipersensibili con il promotore del 28

singolo gene da esprimere. La sequenza creata da questo avvicinamento, contese il

reclutamento e il legame dell’apparato trascrizionale. Se tale meccanismo di

regolazione non funziona correttamente si manifestano diverse condizioni

patologiche, come la persistenza dell’Hb fetale nell’adulto. È importante ricordare,

che nella fase adulta nel cluster β, sono accessi sia i geni delle β-globine che quelli

delle globine δ, che però sono espressi di meno e ciò è dovuto alla presenza di un

promotore debole per la catena δ.

Inoltre, i cluster delle due famiglie di globine, sono altamente soggetti a mutazioni

nella specie umana, che possono determinare l’insorgenza di patologia, come l’anemia

falciforme, dovuta ad una mutazione puntiforme nella catena β, che determina un

ripiegamento anomalo della catena stessa e conseguente mal funzionamento dell’Hb.

Infine, Nel cluster β, a causa della sua struttura e della presenza di sequenze

ripetute, sono frequenti eventi di crossing over ineguale, che provocano la

formazione di cromosomi con duplicazioni e altri con delezioni durante la meiosi.

Questi ultimi provocano la mancata espressione dei geni coinvolti nella delezione 29

L’epigenetica comprende tutti i meccanismi che mantengono diversi patterns di

espressione genica senza modificare la sequenza del DNA. Le modificazioni

epigenetiche sono caratterizzate da diversi livelli di complessità e comprendono la

metilazione, la modificazione degli istoni, il rimodellamento della cromatina e la

presenza di microRNA.

Il DNA può essere metilato da tre diversi enzimi, di cui due catalizzano l’aggiunta di

un gruppo metilico su atomi di azoto, con formazione di N-6metiladenina o N-

4metilcitosina. . il terzo enzima, invece, metila l’atomo di carbonio 5 a formare 5-

metilcitosina. La metilazione sul carbonio 5 della citosina è una modificazione

epigenetica ed è catalizzata dalla DNA metiltrasferasi. La metilazione, solitamente,

avviene nelle citosine della sequenza 5’-CpG-3’.

Il 70% dei dinucleotidi CpG è metilato,

ma la frequenza con cui appaiono nel

genoma è inferiore ad un quarto di

quella attesa. Ciò è probabilmente

dovuto al fatto che 5-metilcitosina

rappresenta una base ipermutabile, in

quanto può essere deamminata con conseguente deplezione delle isole CpG e

formazione di TpG.

I dinucleotidi CpG non sono distribuito casualmente nel genoma, me esistono delle

regioni in esso, definite isole CpG, che normalmente non sono metilate in tutti i tessuti

e che frequentemente si trovano nella regione del promotore di diversi geni. Se i

fattori di trascrizione sono disponibili, le modificazioni istoniche sono in uno stato

permissivo e l’isola CpG rimane in uno stato non metilato, il gene a valle di essa sarà

trascritto.

Lo stato di metilazione è mantenuto dall’azione delle DNA-metiltrasferasi (DNMT),

che catalizzano il trasferimento di un gruppo metile dal donatore di metili S-adenosil-

L-metionina (SAM) sul carbonio 5 dell’anello pirimidinico (SAM S-adenosil-

omocisteine, importante nella sintesi delle poliammine). Il pattern di metilazione è

ereditato di generazione in generazione attraverso un meccanismo post-replicativo.

Tale processo, detto metilazione di mantenimento, è catalizzato da DNMT specifiche

per il DNA emimetilato, generato durante la replicazione del DNA. Il periodo che

intercorre fra l’incorporazione della citosina nel filamento di DNA e la sua metilazione

è di circa un minuto, dovuto all’inaccessibilità al DNA a livello della forca di

replicazione. La metilazione di mantenimento è probabilmente implicata nel ristabilire

non solo il pattern originale di metilazione, ma anche la struttura della cromatina e la

30

formazione dei nucleosomi. Nel processo sono stati descritti diversi tipi di DNMT,

come la DNMT1 (1500 aa), che è la principale metiltrasferasi e consiste di un dominio

conservato ad attività metiltrasferasica, un dominio regolatorio e siti di legame ad

altre proteine, fra cui DNMT3a, DNMT3b, Rb e le istone-deacetilasi (HDAC1 e 2).

Inoltre, tale enzima è coinvolto anche nell’inattivazione del cromosoma X e nei

imprinting

processi di genomico.

vitro

In si può indurre una condizione di emi-/ipo-metilazione, utilizzando la 5’-

azacitidina, analogo della citosina non riconosciuto dalla DNMT1 ( 50% di

metilazione in meno) o l’etionina (cancerogeno), analogo della metionina, che

legandosi all’adenosina riduce la disponibilità di SAM e quindi la metilazione

genomica.

Oltre alla metilazione di mantenimento, nello sviluppo embrionale è stato evidenziato

de novo

un processo di metilazione , catalizzato da DNMT3a e DNMT3b. Tale

processo è stato, poi, rilevato anche nei tessuti adulti. In particolare, sia nel feto che

dopo la nascita, durante il differenziamento delle cellule germinali nelle ovaie e nei

de novo

testicoli, la metilazione è necessaria a ristabilire i pattern di metilazione

genomica, rimossi nelle cellule germinali primordiali. Il DNA dei gameti maturi

presenta pattern sesso- e gene-specifici di metilazione, con un livello totale che

risulta inferiore negli oociti che negli spermatozoi. Tuttavia, i pattern di metilazione

stabili durante la gametogenesi sono soggetti a cambiamenti drammatici dopo la

fecondazione. Infatti, il grado di metilazione nello zigote di 8 cellule corrisponde ad

una combinazione del DNA materno ipometilato e del DNA paterno metilato,

successivamente fra tale stadio e quello di blastocisti si assiste ad una riduzione

globale nel grado di metilazione sia del DNA materno che, e soprattutto, di quello

paterno. La maggior parte del DNA delle cellule della blastocisti risulta non metilato e

ciò potrebbe essere dovuto alla mancanza del donatore di metili SAM nell’embrione.

de novo

In seguito, l’embrione subisce un processo di metilazione e durante la fase di

gastrulazione il grado di metilazione del DNA corrisponde ai livelli, che caratterizzano

l’animale adulto (la metilazione prosegue anche dopo lo stadio di gastrula).

Le cellule germinali, comunque, presentano un grado di metilazione differente da

quello delle cellule somatiche. In particolare, nelle cellule germinali maschili, e

soprattutto negli spermatociti, oltra all’RNA di 5.2Kb, che codifica per la DNMT

presente in tutte le cellule, è presente un trascritto di 6.2Kb, che sembra essere

responsabile della maggior metilazione negli spermatozoi rispetto gli oociti. 31

Il tasso di

In generale, il pattern di metilazione delle cellule nell’adulto è metilazione si

caratterizzato dalla completa metilazione dei geni inattivi e dalla misura con l’utilizzo

ipometilazione dei geni trascrizionalmente attivi. di Ab anti-5-

La metilazione determina silenziamento genico, bloccando metilcitosina

direttamente il legame dei fattori di trascrizione al DNA o

attraverso il riconoscimento della 5-metilcitosina da parte di una famiglia di proteine,

altamente conservate, le methyl-CpG binding domain (MBD). Il meccanismo di

silenziamento dovuto all’inibizione del legame dei fattori di trascrizione caso, è stato

messo in discussione dalla dimostrazione che il fattore di trascrizione Sp1,

generalmente associato ai geni housekeeping, lega il DNA e attiva la trascrizione,

consesus

anche quando la è metilata. Ciò ha suggerito la possibilità che il legame di

Sp1 al DNA ne previene la metilazione.

Per quanto riguarda le MBD, la prima ad essere stata individuata è stata la MeCP2

(466aa; 52Kb), una proteina multidominio, contenente un dominio di legame ai

dinucleotidi CpG metilati e uno di repressione della trascrizione genica (TRD). Tale

proteina è reclutata a livello delle regioni metilate del genoma, dove interagisce con un

complesso, contenente il co-repressore Sin3, e con le istone-deacetilasi, che

aumentano la compattezza della cromatina, inducendo il silenziamento genico.

Sono stati proposti anche modelli HDAC- La rimozione dei gruppi acetili

indipendenti, secondo cui il legame delle MBD può dagli istoni ad opera delle HDAC,

provocare rimodellamento locale della struttura aumenta la carica positiva degli

della cromatina, rivestire i siti d’accesso al genoma, istoni (Lys non coperte dai gruppi

impedendo il legame del complesso trascrittasico, e acetili), determinando una

sequestrare i fattori di trascrizione, maggior “avvolgimento” della

prevendendone la funzione. cromatina su di essi.

Nonostante le funzioni molecolari della MeCP2 non 32

sono ancora note, è stato dimostrato che essa è necessaria nei neuroni affinché ci sia

una normale funzionalità cerebrale. Infatti, mutazioni nel gene di tale proteina sono

all’origine della sindrome di Ret umana (RTT) e causano un fenotipo RTT-simile nei

topi. Tale sindrome è un disordine neurologico progressivo, che riguarda quasi

esclusivamente le donne, che risultano eterozigoti per mutazioni inattivanti il gene X-

linked MeCP