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Riassunto esame Genetica degli eucarioti superiori, Prof.ssa R. Cozzi, libro consigliato Introduzione alla genomica, Zanichelli

Questo elaborato si basa sulle informazioni apprese con la frequenza delle lezioni dell'anno 2016/'17 integrate e corrette con lo studio autonomo e degli articoli affrontati durante il corso. Non c'è bisogno di nessun altro supporto didattico per superare con il massimo dei voti l'esame, poiché in questo riassunto ci sono tutte le informazioni necessarie.

Esame di Genetica degli eucarioti superiori docente Prof. R. Cozzi

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RISC gli consente di separare i due filamenti di RNA).

Inoltre, ad un certo stadio del processo, questo segnale di allarme viene amplificato

dalla duplicazione dell'RNA estraneo attraverso una RNA polimerasi RNA-dipendente.

I dati in letteratura dimostrano che esistono diversi small RNA con funzione

regolatoria della trasduzione:

siRNA (small interfering RNA), agiscono in cis, sulla stessa sequenza da cui sono

prodotti.

piRNA (Piwi-interacting RNA), sono piccoli RNA caratterizzati da una lunghezza di

25-33nucleotidi e dalla presenza di

un uridina al 5' . Formano

complessi proteina-RNA,

interagendo con le proteine Piwi,

coinvolti nel silenziamento dei

trasposoni nelle cellule germinali,

in particolare quelle

della spermatogenesi. La biogenesi

di queste molecole, che prevede la

formazione di una lunga molecola di

ssRNA, consta di due pathway: in

primo luogo si generano piRNAs

primari, poi amplificati da un ciclo

di amplificazione denominato ping-pong Loop, nel quale piRNAs primari di senso

guidano le proteine PIWI nel tagliare i trascritti antisenso bersaglio al fine di

generare nuove estremità 5’. Successivamente, è tagliata l’estremità 3’,

determinando la produzione di piRNAs antisenso secondari. Nel percorso della

biogenesi primaria, il lungo trascritto del trasposone è inizialmente scissa dalle

nucleasi Zuc, che probabilmente

generale estremità 5 'di piRNAs

primari. Le altre fasi di

maturazione dei piRNAs primari

non sono noti.

In D. melanogaster le due proteine

Piwi, Ago3 e Aubergine cooperano

nella produzione di piRNAs

secondari senso e antisenso.

Comunque, i piRNAs antisenso sono

43

presenti in numero maggiore. Nella linea germinale di topo, invece, le proteine Piwi

MILI e MIWI collaborano alla generazione dei piRNAs e dopo la rifilatura

dell’estremità 3’, questa viene metilata da parte della metiltrasferasi HEN1. Infine,

Caenorhabditis elegans

in esiste un pathway aggiuntivo per la produzione di piRNAs,

che prevede il processamento e l’eliminazione del cap di brevi RNA trascritti dalla

polimerasi II.

miRNA (micro RNA), sono la classe di mRNA interferenti scoperta più

recentemente. Questi RNA sono codificati dai geni MIR, situate di solito in regioni

intergeniche o negli introni di altri geni, e trascritti dalla Polimerasi II. Il

trascritto primario presenta una struttura secondaria caratterizzata da una

struttura a stem-loop e prende il nome di pri-microRNA. Questo viene riconosciuto

da una RNasi Drosha (DGCR8 in Drosophila) e dal suo cofattore Pasha, che rimuove

nucleotidi all’estremità 5’ della molecola, in modo tale da lasciare una sequenza di

sue o tre nucleotidi a singolo filamento. Tale forma del trascritto prende il nome di

pre-miRNA (~70 dNTP), che viene traslocato dal nucleo al citoplasma dalle proteine

RAN-GTP ed dall’exportin 5. Nel citoplasma l’RNasi Diceer processa il pre-miRNA,

tagliando il loop della struttura a forcina e generando molecole di RNA duplex di

circa 22 dNTP, dette miRNA:miRNA*. La formazione del complesso Dicer-RNA

recluta le proteine

argonauta, AGO, che

formano il complesso

di silenziamento

indotto dall’RNA, il

RISC. La maturazione

del miRNA consiste

nella separazione dei

due filamenti e nella

degradazione del

miRNA*. I miRNA

maturi sono

complementari al

3’UTR dei propri

mRNA target e la

regione a maggior

complementarietà è

detta sequenza seed 44

(meno di 10 dNTP), presente al 5’ del miRNA. A differenza dei siRNA, i miRNA

agiscono in trans.

Inoltre, i pre-miRNA possono anche essere generati da introni brevi, che sono

indicati come mirtrons. Questi sono Drosha-indipendenti e Nell’uomo la famiglia

di proteine

vengono liberati durante splicing dal spliceosoma. Argonauta (AGO)

I miRNA presentano due diversi meccanismi di azione, in base al presenta 3 geni noti,

grado di complementarietà che vi è tra essi e il proprio target. sul cromosoma1, con

In generale, la sequenza seed è appaiata in modo perfettamente elevata omologia e

complementare al suo target e il primo nucleotide del miRNA non strettamente

associati.

può non essere appaiato, mentre la regione 3’ del miRNA mostra

una complementarità imperfetta al suo target. Inoltre, sembra che le coppie G:U nella

regione del seed siano sfavorevoli al silenziamento, sebbene siano ammesse, mentre

sono abbastanza comuni nella regione 3’.

Si parla di complementarietà perfetta e complementarietà imperfetta. Nel primo caso

il miRNA, localizzato nel RISC, induce la degradazione dell’mRNA bersaglio (si verifica

soprattutto nelle piante), mentre se la complementarietà è imperfetta, l’mRNA 45

bersaglio non può essere tradotto e viene compartimentalizzato nei P-bodies (P =

processing), dove si accumulano enzimi di degradazione, che possono in un secondo

tempo degradare gli mRNA (si verifica soprattutto negli animali).

Da un punto di vista biologico e fisiologico, i miRNA sono coinvolti in diversi processi.

In particolare, nei vegetali sono coinvolti nella morfogenesi e nell’organogenesi, nella

risposta agli stress e ai patogeni, mentre negli animali, compreso l’uomo, in cui hanno

un’espressione temporale e tessuto-specifica, sono coinvolti nello sviluppo embrionale,

nell’organogenesi (cuore, sistema nervoso…), nel cancro e in altre sindromi congenite.

Per esempio, miR1 e miR124, rispettivamente espressi nel muscolo scheletrico e nel

cervello, sono in grado di indurre la riduzione dei livelli di circa un centinaio di mRNA,

guidando le cellule verso un profilo di espressione caratteristico muscolare o neurale,

mentre miR504 determina la degradazione di p53, coinvolto nel ciclo cellulare. in

C.elegans, invece, il miRNA lin-4, regola l’espressione delle proteine Lin-14 e Lin-28,

che regolano, rispettivamente, il passaggio dallo stadio larvale L1 allo stadio L2 e il

antam

passaggio L2-L3. Infine, in Drosophila, il miRNA B regola negativamente il gene

hid,

pro-apoptotico inibendo l’apopostosi. NB: più miRNA agiscono su più molecole di

mRNA e una molecola di mRNA può essere

legata da più miRNA.

Varie indicazioni suggeriscono che alterazioni dell’espressione di specifici miRNA sono

implicate nella cancerogenesi umana. Infatti una down-espressione dei miRNA o

difetti nella loro funzione, determinano la traduzione del loro mRNA target ad un

tasso maggiore di quello fisiologico. Ciò può provocare una dis-regolazione dei processi

di differenziamento, proliferazione o morte apoptotica cellulare, che conducono la

cellula alla trasformazione cellulare. la proteina prodotta in eccesso, quindi, si

comporta come un’onco-proteina. Un esempio, sono i miR 15 e 16 che sono down-

espressi nella leucemia linfatica cronica e let-7 down-espresso nei carcinomi

polmonari.

In altri casi, invece, la trasformazione tumorale è dovuta ad una up-regolazione di

miRNA, con conseguente assenza dei prodotti proteici dei loro mRNA target, che può

condurre ad una dis-regolazione i processi di morte apoptotica, differenziamento o

proliferazione cellulare. un esempio, è rappresentato da miR-155, presente a livelli

anche di 100 volte superiori rispetto al normale nei linfomi di Burkitt e nei linfomi

diffusi a larghe cellule ed è sovraespresso anche in tumori mammari.

In alcuni casi, infine, i miRNA agiscono come oncosoppressori e/o oncogeni, ossia la

loro attività determina, rispettivamente, la non traduzione di oncogeni e 46

oncosoppressori. Per esempio, let-7 agisce da oncosoppressore inducendo la non

traduzione degli mRNAs dei protocongeni Ras e Myc, mentre miR372 e miR373,

sovraespressi in alcuni tumori, agiscono da oncogeni, neutralizzando l’inibizione di CDK

(chinasi ciclina dipendenti), mediata da p53, permettendo la progressione del ciclo

cellulare.

È importante ricordare che il trascrittoma, che rappresenta il bersaglio dei miRNAs,

comprende gli mRNA dei geni codificanti, gli mRNA di alcuni pseudogeni (non tradotti)

e i cosiddetti LncRNA (long non-coding RNA), di cui il pià noto è XIST, coinvolto nel

processo di inattivazione del cromosoma X. Inoltre, più mRNA presentano sequenza

complementari (MRE) alla sequenza seed dello stesso miRNA.

Questo implica che ciascun mRNA ha anche una funzione non coding, che consiste nella

competizione con altre molecola di mRNA per il legame con il miRNA. In quest’ottica

potrebbero svolgere un ruolo importante i trascritti degli pseudogeni, che legando il

miRNA, promuovono la traduzione di un gene codificante appartenente alla stessa

famiglia.

Quindi, in una condizione di equilibrio fisiologico due mRNA, che presentano la stessa

MRE o MRE molto simili, sono entrambi presenti nel citoplasma ed entrambi saranno

“degradati” dal legame con il miRNA. Se, invece, si ha una down-regolazione di uno dei

due geni, il trascritto più abbondante legherà una maggior quantità di miRNA,

determinando deregolazione. Tale meccanismo è stato riscontrato in alcune cellule

tumorali in cui la delezione dello pseudogene p-tenp1, che compete per il legame con un

miRNA con l’mRNA dell’oncosoppressore p-ten, determina la degradazione dell’mRNA

di p-ten. Infatti, essendo assente l’mRNA dello pseudogene tutte le molecole di

miRNA presenti nella cellula legano l’mRNA dell’oncosoppressore, promuovendo la

trasformazione tumorale.

L’alterazione nell’attività fisiologica dei miRNA, dovuti a loro mutazioni o a mutazioni

degli enzimi coinvolti nella loro biosintesi (spesso le sequenze dei miRNA sono

localizzate in prossimità di siti fragili) oppure a fenomeni di alterazione genomica,

come amplificazioni, delezioni e traslazioni, è coinvolta nella cancerogenesi.

Quindi il ripristino della condizione di equilibrio fisiologico dell’attività dei miRNA può

rappresentare una terapia anti-tumorale. Al giorno d’oggi sono in fase di studio tre

diversi interventi terapeutici:

uso di AMOs, cioè oligonucleotidi di sintesi complementari a miRNA sovraespressi

nelle cellule tumorali (tumore al fegato dei primati). 47

Aumento dell’espressione dei miRNA down-espressi nel tumore, attraverso la

somministrazione di miRNA sintetici, che ne mimano l’azione.

Aumento dell’espressione dei miRNA down-espressi nel tumore, attraverso la

somministrazione di precursori (se introducono acidi nucleici risp. immunitaria

con IFN).

Infine, molti tumori solidi sono potenzialmente trattabili con la radioterapia, ma

spesso le cellule tumorali acquisiscono radioresistenza come conseguenza della terapia

stessa. Una delle nuove strategie terapeutiche anti-tumorali, consiste nell’rendere le

cellule tumorali sensibili alle radiazioni, che come è noto determinano danno al DNA,

conducendo le cellule a morte.

La radiosensibilità è associata a quattro pathways:

1. PI3-K/Akt, determina la soppressione dell'espressione dei geni pro-apoptotici Bad

e Bim.

2. NF-κB, aumenta l'espressione della proteina anti-apoptotica, Mcl – 1.

3. TGFβ, influisce indirettamente la radioresistenza, attivando l'espressione del gene

ATM.

4. MAPK, attraverso l’attivazione di ERK, determina la soppressione dell'espressione

dei geni pro-apoptotici Bad e Bim.

Quindi, l’inattivazione di proteine coinvolte in tali pathway promuovono la

radiosensibilità delle cellule tumorali. Tale inibizione può essere mediata dai miRNA.

In particolare:

1. PI3-K/Akt: miR-21, miR-26, miR-221/222, miR-216a/217 e miR486, che

regolano l’espressione

dell’oncosoppressore p-ten a monte di Akt.

miR-155, miR-205 e miR-375 regolano l’espressione di SHIP e di

PDK1, sterettamente correlate all’attivazione di Akt.

miR- 126 e miR- 320 regolano l'espressione di PI3-K , influenzando

l’attività a valle di PIP3 e i livelli di Akt fosforilata.

2. NF-κB: miR-155, miR-520h, miR-199a, miR-223, miR-15, miR-16e miR-124a

regolano l’espressione delle diverse subunità della chinasi IKK,

necessaria all’ativazione di NF-kB.

3. TGFβ: miR-421, la cui espressione è up-regolata dall’oncogene N-Myc,

regola il gene ATM.

Anche altri miRNA influenzano la radiosensibilità, come MiR-101 che lega sia le DNA-

PKCs (protein chinasi DNA- dipendenti) che ATM e miR-17-5p, che agisce come un

oncosoppressore promuovendo la proliferazione cellulare e la metastatizzazione del 48

tumore. Il meccanismo di regolazione di quest’ultimo è associato all’attivazione della

p38MAPK e aumenta la fosforilazione della Heat Shock Protein 27.

Un altro possibile meccanismo di regolazione può verificarsi quando le vie PI3-K/Akt e

MAPK / ERK sono attivate dalle radiazioni stesse ed influenzano i meccanismi di

riparazione del danno del DNA nel nucleo , soprattutto la via NHEJ e le attività di

DNA- PKcs , modulando in tal modo la radioresistenza . anche il pathway di TGF ,

attraverso l’attivazione di ATM, modula la radio resistenza, influenzando i meccanismi

di riparazione al DNA (NHEJ e riparazione per ricombinazione omologa rotture a

doppio filamento).

Infine, i miRNA sono coinvolti nella regolazione del microambiente tumorale (TME ) ,

che influenza la radiosensibilità delle cellule tumorali. In particolare i fattori estrinci

che maggiormente influenzano tale sensibilità sono l’ipossia e l'angiogenesi. Nello

specifico, il VEGF (fattore di crescita endoteliale vascolare) e HIF-1(il fattore 1

ipossia-inducibile) sono due fattori fondamentali che svolgono un ruolo importante nel

tumore radiosensibilità, modificando il flusso sanguigno e la concentrazione di

ossigeno dei tessuti tumorali Quindi, anche i miRNA che regolano l’espressione di tali

fattori , così come quelli che regolano l’espressione di oncogeni, oncosopressori e di 49

proteine coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare, influenzano la radiosensibilità

delle cellule tumorali.

Per esempio, miR-210, up-regolato in cellule ipossiche, inibisce la morte delle cellule

del tumore, diminuendo l'attività della caspasi-8 o abbassando il livello dei ROS. Esso,

inoltre, legando il fattore RAD52 (coinvolto nella riparazione ricombinazione

omologa), regola la capacità di riparazione danni al DNA delle cellule tumorali durante

l'ipossia (aumento dell’instabilità genomica), assistere alla riparazione di DSB DNA.

Ruolo analogo ha miR-373, che down-regola l'espressione di RAD23B, coinvolto nella

riparazione per escissione dinucleotidi.

Infine, i miRNA svolgono anche un ruolo attivo nella infiammazione, nella transizione

tra infiammazione e carcinogenesi e nel metabolismo tumorale (glicolisi aerobica e

fosforilazione ossidativa), strettamente associato alla radiosensibilità o alla

radioresistenza tumorale. 50

Il cancro è la seconda causa di morte nei paesi occidentali, superato solamente da

patologie cardiovascolari. Negli ultimi trent’anni è stato scoperto che il cancro è una

malattia genetica, caratterizzata dall’interazione fra oncogeni e oncosoppressori, che

porta ad una crescita cellulare incontrollata e alla diffusione delle cellule tumorali.

Clinicamente, il cancro è definito come un vasto numero di malattia complesse, con

caratteristiche dipendenti dal tipo cellulare d’origine. I tumori differiscono nell’età di

sviluppo, nella malignità, nell’invasività, nella prognosi e nelle risposte ai trattamenti.

Tuttavia, a livello molecolare, tutti esibiscono alcune caratteristiche comuni,

l’alterazione della proliferazione cellulare e la capacità di invadere altre porzioni

dell’organismo. Nelle cellule non tumorali, tali capacità, sono strettamente controllate

dall’azione di complessi network di geni, che nelle cellule tumorali sono espresso in

modo inappropriato o sono mutati.

In base alla caratteristiche morfologiche, all’attività proliferativa e al comportamento

nei confronti dei tessuti limitrofi e dell’intero organismo, i tumori sono suddivisi in due

grandi gruppi:

Tumori benigni: sono costituiti da cellule che si presentano molto simili alle cellule

normali per molte caratteristiche morfologiche e funzionali. Sono caratterizzati da

uno sviluppo di tipo espansivo, che causa compressione dei tessuti parenchimali

normali limitrofi. Le cellule tumorali benigne, inoltre, producono fattori di crescita

per il connettivo e l’endotelio vascolare, formando un proprio letto vascolare

necessario per il sostegno nutrizionale, e un proprio stroma, necessario per il

sostegno meccanismo. le neoplasie benigne non infiltrano i tessuti limitrofi e una

volta asportate non recidivano.

Tumori maligni: sono costituiti da cellule che si differenziano da quelle normali

d’origine sia dal punto di vista morfologico che funzionale. Il tumore viene definito

anaplastico (totalmente indifferenziato) quando il grado di differenziazione delle

cellule è talmente basso da impedire il riconoscimento del citotipo originario, le

cellule di questa tipologia di tumori infiltrano i tessuti limitrofi e li distruggono

progressivamente. Inoltre, alcune di esse possono raggiungere il circolo sanguigno

e/o linfatico ed essere trasportate in siti distanti da quello del tumore primario e

dar origine a metastasi (malattia locale malattia sistemica). 51

I tumori possono essere classificati secondo un criterio istogenico, che prende in

considerazione il tessuto in cui il tumore si è originato, o in base ad un criterio

prognostico, che si basa sulla previsione del comportamento della neoplasia.

Epitelio Tumori benigni: polipi, papillomi o verruche

Tumori maligni: epitelomi o carcinomi.

Epitelio ghiandolare Tumori benigni: adenomi

Tumori maligni: adenocarcinomi.

Tessuto connettivo Tumori benigni: prefisso indicante il nome del tessuto seguito

dal suffisso –osa

Tumori maligni: sarcomi.

Sistema melanoforo Tumori benigni: nevi

Tumori maligni: melanomi

Cells ematopoietiche leucemie, suddivise in: acute, caratterizzate dal

progenitrici blocco della maturazione dei linfociti in uno stadio precoce di

differenziamento, e croniche, in cui il blocco della maturazione

avviene in uno stadio più tardivo. Inoltre, le leucemie sono

distinte in: linfoidi, derivanti dalla trasformazione tumorale dei

progenitori dei linfociti T o B; mieloidi, classificate in base alla

linea di differenziazione (monocita, granulocita e

megacariocita), e eritroleucemie, dovute a trasformazione

neoplastica di un precursore eritroide.

Linfociti maturi linfomi, suddivisi in: linfomi di tipo Hodgkin, caratterizzati dalla

presenza di cellule multinucleate, e di tipo non Hodgkin.

Plasmacellula mielomi multipli

Le malattie mieloproliferative comprendono condizioni patologiche indotte da

proliferazione incontrollata di uno o più precursori mieloidi del midollo osseo, con

conseguente iperproduzione di cellule ematiche.

Fra le caratteristiche comuni alle cellula tumorali la più evidente è senza dubbio

l’acquisizione dell’indipendenza dai meccanismi di controllo della moltiplicazione

cellulare, che diventa continua ed illimitata nel tempo. I danni genomici in grado di

causare l’acquisizione di una fenotipo neoplastico possono essere strutturali

(mutazioni) o funzionali (alterazione nell’espressione genica, iper o ipometilazione).

Oltre alle alterazioni genomiche, allo sviluppo del tumore concorrono anche una serie

di fattori che possono essere endogeni o esogeni, come agenti fisici o chimici. 52

Fra gli agenti fisici dotati di potere cancerogeno, quelli più importanti sono le

radiazioni, come le radiazioni UV (λ = 100-400nm), il cui potere cancerogeno consegue

all’assorbimento di energia da parte del DNA. Il danno più significativo indotto da

queste radiazioni nel DNA consiste nella formazione di dimeri di pirimidine, in

particolar modo di timine. Se l’esposizione alle radiazioni UV è prolungata i danni da

essi indotti diventano maggiori e possono determinare lo sviluppo tumorale,

soprattutto in soggetti con difetti a carico dei sistemi di riparazione del DNA.

Le radiazioni ionizzanti, che hanno maggior energia rispetto le UV, invece, danneggiano

il DNA sia direttamente, ionizzando gli atomi in esso presenti, che indirettamente, per

ionizzazione dell’acqua. I danni maggiori che esse causano sono rappresentati da una

serie di aberrazioni a livello cromosomico, delezioni e riarrangiamenti, dovute a legami

crociati dei filamenti o a rotture a singolo o doppio filamento. La frequenza di

aberrazioni cromosomiche è proporzionale alla dose e a dosi basse la relazione è

2

lineare, mentre a dosi elevate la relazione è quadratica (Y = αD + βD , dove D è la

dose).

Attraverso studi condotti per valutare gli effetti delle mutazioni è stato dedotto che

non esiste una dose soglia al di sotto della quale le radiazioni sono innocue e che

cellule in proliferazione sono più radiosensibili di quelle differenziate. Inoltre il tempo

di latenza che intercorre tra le irradiazioni e la comparsa delle cellule tumorali può

essere di anni o decenni e dipende sia dall’età dell’individuo che dal tipo cellulare.

Tutti i fattori capaci di favorire la formazione di tumori sono definiti cancerogeni e

quelli di natura chimica includono sia sostanze organiche che inorganiche. In generale,

si considera che le sostanze chimiche esercitino la loro azione cancerogena

interagendo con il DNA e determinando in esso delle mutazioni o modificazioni

assimilabili ad esse. I cancerogeni chimici, a differenza di quelli fisici, presentano una

dose-soglia, peculiare per ogni sostanza, al di sotto della quale la sostanza in esame

non ha effetto.

I cancerogeni chimici sono suddivisi in due grandi gruppi:

Cancerogeni diretti, sono forniti di un’elevata attività elettrofilica , che consente

loro di interagisce direttamente con il DNA(il DNA neutrofilo interagisce con

sostanze elettrofile, cioè povere di elettroni). A questo gruppo appartengono: gli

analoghi delle basi, sostanze con struttura simile a quella delle normali basi del

DNA che possono essere incorporate al posto di queste ultime (5-bromouracile, 2-

amminopurina), agenti che riconoscono il DNA, come gli agenti alchilanti in grado di

trasferire un gruppo alchilante al DNA, e gli agenti intercalanti, come le acridine. 53

Cancerogeni indiretti, poveri di gruppi elettrofilici, sono incapaci di interagire con

il DNA. Tale capacità è acquisita dai loro derivati, che si formano nell’organismo

come intermedi del metabolismo.

Isaac Barenblum durante i suoi studi osservò che, a dispetto del cancerogeno usato, la

comparsa dei tumori era preceduta da iperplasia e da altre forme patologiche e che la

sospensione del trattamento con il cancerogeno, prima dello sviluppo della neoplasia,

determina la regressione di tali manifestazione patologiche, mentre la sospensione del

trattamento alla comparsa della neoplasia non determina regressione del tumore, che

continua a crescere in modo progressivo. Inoltre, egli osservò che la ripresa del

trattamento con lo stesso cancerogeno determina la comparsa di neoplasie solo nel

momento in cui la somma delle dosi somministrate, prima e dopo la sospensione

raggiunge il valore soglia.

Basandosi su tali risultai, Barenblum postulò la “teoria difasica” della cancerogenesi,

secondi cui la formazione di neoplasie si verifica in due tappe:

1. Iniziazione, è evocata dal cancerogeno e determina la trasformazione delle cellule

normali in cellule neoplastiche. Da un punto di vista biomolecolare essa consiste

nella comparsa di mutazioni, causate dal cancerogeno. È possibile mimare tale fase

in vitro, somministrando, per esempio, a fibroblasti murini in coltura benzopirene

(promutageno). Se le mutazioni non sono riparate dai meccanismi di riparazione del

DNA prima della replicazione cellulare, esse vengono trasmesse alla progenie, con

conseguente trasformazione neoplastica. È stato dimostrato che i geni bersaglio

dei cancerogeni sono preferenzialmente oncogeni e oncosoppressori, che vengono in

tal modo attivati e inattivati, rispettivamente.

2. Progressione, indotta dalla somministrazione della dose residua di cancerogeno,

induce le cellule trasformate a proliferare, formando la neoplasia. È caratterizzata

dall’accentuarsi di alcune atipie (instabilità del cariotipo, aneuplodia, anomalie

cromosomiche) e dalla comparsa del fenotipo invasivo e metastatico. Essa

rappresenta un’estensione della fase di promozione, dalla quale è in realtà

indistinguibile, che consiste nella comparsa di un tumore clinicamente evidente,

costituito dalla progenie della cellula trasformata. La fase di promozione è dovuta

al trattamento con agenti promuoventi o co-cancerogeni, incapaci di esercitare

attività cancerogena in cellule sane, che causando alterazioni cellulari reversibili

durante il tempo che precede la comparsa del tumore. Gli agenti promuoventi

vengono definiti come sostanze capaci di promuovere la mutagenicità, di attivare la

cancer stem cells

proliferazione delle e di indurre senescenza cellulare. 54

Negli anni ’70 è stato dimostrato che la trasformazione neoplastica non è dovuta solo

a mutazioni. Infatti, nonostante sussista una sovrapposizione tra mutageni e

cancerogeni, esistono mutageni che non sono cancerogeni e viceversa. Quest’ultimo

caso implica che il cancerogeno agisce causando una modificazione dell’espressione e

non della sequenza, cioè agisce a livello epigenetico, come l’etionina che interferisce

con la metilazione del DNA.

Nei primi anni del ‘900 Boverly ipotizzo che la trasformazione neoplastica era in

qualche modo riconducibile a modificazioni cromosomiche. La prima prova

dell’associazione fra un’anomalia cromosomica e una forma tumorale fu evidenziata nel

1960 con la scoperta del cromosoma di Philadelphia nella leucemia mieloide cronica.

Tale cromosoma deriva dalla traslocazione reciproca fra i cromosomi 9 e 22. In

particolare, la traslocazione provoca il trasferimento di quasi tutti gli esoni

dell’oncogene c-ABL dal cromosoma 9 al cromosoma 22, dovesi fonde con parte del

gene BCR. Il prodotto della fusione è il gene chimerico 5’-BCR-ABL-3’, il cui prodotto

proteico è una protein chinasi di 210KDa, non soggetta a controlli negativi e coinvolta

nella proliferazione cellulare (come c-Abl).

Successivamente, anche in altre forme neoplastiche sono state osservate

traslocazioni, come nel linfoma di Burkitt (linfoma delle Bcells), in cui si ha il

trasferimento del gene c-myc dal cromosoma 8 al cromosoma 14 in prossimità del gene

che codifica per le catene pesanti delle Ig. In altre due traslocazioni note, invece, c-

55

myc è trasferito in prossimità dei geni che codificano per le catene leggere delle Ig,

catena κ sul cromosoma 2 e catena λ sul cromosoma 22. Questo tipo di traslocazione

avviene durante il riarrangiamento dei geni VDJ e determina una maggior espressione

del gene c-myc, che codifica per un fattore di trascrizione, presente sotto forma di

dimeri con la proteina Max, cha a sua volta può dimerizzare con Mad, Mxi1 e con sé

stessa. L’aumentata espressione di c-myc determina uno squilibrio nella formazione

dei dimeri, con una diminuita formazione di quelli che inibiscono la trascrizione (Max-

mad e Max-Mxi1) e una maggior produzione di dimeri c-Myc-Max, che attivano la

trascrizione dei geni coinvolti nella proliferazione cellulare.

Infine, anche nel linfoma follicolare si ha una traslocazione fra i cromosomi 14 e 18,

con conseguente fusione dell’enhancer del gene codificante la catena pesante delle Ig

con il gene Bcl2, che codifica una proteina che svolge un controllo negativo

sull’apoptosi. Quando, quindi, Bcl2 è iperespresso impedisce ai segnali pro-apoptotici di

indurre la morte della cellula.

Le modificazioni strutturali, come traslocazioni, inversioni, delezioni e amplificazioni,

si trovano per lo più nelle cellule neoplastiche ematopoietiche, mentre in quelle dei

tumori solidi si trovano variazioni numeriche, come nel tumore della mammella in cui si

osserva trisomia.

Quindi, la neoplasia è costituita da una popolazione eterogena di cellule tumorali

derivanti da una cellula iniziale, che ha subito mutazioni o alterazioni epigenetiche

(modello monoclonale delle neoplasie). L’eterogeneità della popolazione di cellule

tumorali è dovuta all’instabilità genetica, che caratterizza la cellula inziale e la sua

progenie.

L’instabilità genetica è un indice dinamico, in cui si ha un aumento del tasso di

mutazioni, di cui si conoscono diverse forme: l’instabilità dei microsatelliti (instabilità

che riguarda le sequenze nucleotidiche e in particolar modo quelle dei microsatelliti) e

l’instabilità cromosomica (si manifesta principalmente sotto forma do aberrazioni

cromosomiche).

Differenti tipi di instabilità genetica sono alla base di diversi meccanismi di inattivazione di

oncogeni e oncosoppressori. Un esempio è rappresentato dal pathway dell’APC- β-catenina, che

risulta inattivato nel tumore colon-rettale. In condizioni fisiologiche, tale pathway inibisce la

crescita cellulare, trattenendo la β-catenina nel citoplasma, impedendogli di raggiungere il nucleo,

dove attiverebbe i geni volti a promuovere la vitalità cellulare. In alcuni tumori questo pathway è

alterato attraverso una mutazione dell’allele del gene APC e perdita dell’allele wt per perdita

cromosomale (instabilità cromosomica). In altri, invece, si verificano mutazioni a carico di entrambi

gli alleli del gene APC (instabilità dei microsatelliti). 56

two hit

Negli anni ’70 Knudson propose il modello di cancerogenesi , secondo cui sono

necessarie due mutazioni nello stesso gene per determinare la trasformazione

neoplastica. Il modello di Knudson è basato sullo studio del retinoblastoma, di cui la

forma familiare si manifestava con una cinetica compatibile alla probabilità di

sviluppare una singola mutazione, mentre la forma sporadica si manifestava con una

cinetica compatibile con la probabilità di sviluppare due eventi mutazionali

indipendenti nella stessa cellula. Egli concluse che per lo sviluppo del retinoblastoma

erano necessarie due mutazioni nel gene RB e che nella forma familiare, una delle due

fosse germinale, mentre l’altra veniva acquistata successivamente a livello somatico. Il

modello implica, anche, che è poco probabile che si verifichino due mutazioni

indipendenti, mentre è più probabile che si verifichi una mutazione tale da rendere

una cellula, che ha ereditato una condizione di eterozigosi, omozigote. Ciò spiegava

perché la forma familiare di retinoblastoma è generalmente bilatelare, mentre quella

sporadica è unilaterale.

Nel 1990 fu proposto il primo modello di progressione a stadi multipli del cancro

colon-rettale, che preveda coma prima tappa la perdita di funzione

dell’oncosoppressore APC sul cromosoma 5 e poi l’attivazione dell’oncogene Ras, sul

cromosoma 12, per culminare con la perdita di funzione di p53.

Al giorno d’oggi ancora non sono state individuate in modo univoco le alterazioni che

rappresentano la causa primaria dell’insorgenza dei tumori e sono state proposte

diverse teorie, che si contrappongono tra loro:

Teoria genetica del cancro

Tale teoria stabilisce che il cancro è dovuto all’espansione di cellule, che hanno

accumulato dalle quattro alle sette mutazioni, con conseguente formazione di una

popolazione eterogenea di cellule tumorali, soggette a mutazioni spontanee. Secondo 57

essa la causa dell’insorgenza della neoplasia sono le mutazioni di geni ed è stata

supportata dall’osservazione che in alcuni tumori le aberrazioni strutturali erano

bilanciate, con conseguente assenza di perdita del materiale genetico. Questa teoria,

però, non riesce a spiegare alcune caratteristiche dello sviluppo delle neoplasie, come:

Il cancro non è ereditabile. Se il cancro è una malattia esclusivamente genetica si

dovrebbe avere una maggior incidenza nei neonati.

Lunghe latenze neoplastiche. L’esistenza di un tempo di latenza nello sviluppo dei

tumori non è spiegabile, in quanto la mutazione è un fenomeno immediato.

Correlazioni fra cancro e aneuplodia. La teoria genetica non prende in

considerazione il fatto che l’aneuplodie sono ubiquitarie nei tumori.

I fenotipi tumorali sono troppo complessi per essere spiegati dalla presenza di

-7

mutazioni convenzionali. La frequenza di mutazioni, 10 per generazione, non è

conciliabile con l’eterogeneità della popolazione delle cellule tumorali ed inoltre i

fenotipi sono così differenti da quelli delle cellule sane, da poter essere spiegati

solamente attraverso la mutazione di un numero elevato di geni (mutazioni su più di

350 diverse proteine).

Teoria cromosomica del cancro

Tale teoria fu formulata da Bovery e Hansemann e afferma che la causa primaria

dell’insorgenza neoplastica sono le anomalie nel numero dei cromosomi. Questa teoria

riesce a spiegare alcune caratteristiche della cancerogenesi, che la teoria genetica

non riusciva a spiegare, come:

Il cancro non è ereditabile. Infatti, l’incidenza del cancro aumenta all’aumentare

dell’età, in accordo con l’ipotesi che sia l’aneuplodia (perdita o acquisizione) di

cromosomi intatti o di segmenti di essi la causa primaria dell’insorgenza tumorale.

Lunghe latenze neoplastiche. L’esistenza di un tempo di latenza nello sviluppo dei

tumori può essere spiegata come il tempo necessario affinché alcune alterazioni

cromosomiche evolvano in vere e proprie aneuplodie.

Correlazioni fra cancro e aneuploidia. L’aneuplodia è definita come un processo pre-

neoplastico, che precede la cancerogenesi, come dimostrato in alcuni esperimenti, in

cui l’aneuplodia rappresentava la causa di trasformazione tumorale. Tale ipotesi è

anche supportata dalle sindromi di instabilità cromosomica, che provocano alti tassi

di aneuplodie e predispongono all’insorgenza di patologie neoplastiche. Inoltre,

anche aneuplodie congenite, come la sindrome di Down (leucemia acuta), sono

correlate all’aumentato rischio di sviluppare tumori.

I fenotipi tumorali sono troppo complessi per essere spiegati dalla presenza di

mutazioni convenzionali. Le aneuplodie, al contrario, possono spiegare sia 58

l’eterogeneità della popolazione di cellule tumorali che i fenotipi che esse

presentano. Infatti, l’instabilità genetica associata alle aneuplodie è in grado di

spiegare la varietà delle cellule tumorali (1/100 cellule riarrangiano il proprio

genoma).

Impossibilità di rilevare geni trasformati. Finora non sono stati trovati geni, la cui

mutazione è in grado di provocare inevitabilmente la trasformazione tumorale.

Secondo la teoria cromosomica, quindi, la cancerogenesi è definita da una successione

di eventi che prevedono, inizialmente, la formazione di aneuplodie o alterazioni

cromosomiche indotte da cancerogeni. Le aneuplodie sbilanciano il genoma e, di

conseguenza, il proteoma della cellula, eliminando geni fondamentali per il corretto

svolgimento del ciclo cellulare.

Le aneuplodie possono avere origine da diversi meccanismi. In particolare, difetti

durante la segregazione dei cromosomi alla mitosi sono stati proposti come i principali

agenti causanti l’instabilità genetica. Il meccanismo principale, che agisce durante la

mitosi, è rappresentato dal checkpoint mitotico, che impedisce il passaggio in anafase,

se i cromosomi non correttamente attaccati al fuso mitotico.

In condizioni fisiologiche, le proteine del checkpoint mitotico sono reclutate a livello

dei cinetocori dei cromosomi non attaccati e impediscono la progressione della mitosi,

producendo un segnale diffusibile, che blocca il complesso che promuove

l’anafase/ciclosoma (APC/C), il cui ruolo è quello di ubiquitinare la securina e la ciclina

B. Tale evento libera la separasi, associata alla securina, e ne provoca la

defosforilazione attraverso la distruzione della ciclina B. La separasi libera cliva le

coesine, che tengono adesi i cromosomi e induce l’inizio dell’anafase.

L’assenza totale di questo checkpoint determina mis-aggregazione cromosomica e

morte cellulare, mentre difetti in esso, dovute a mutazioni nei geni per le proteine

coinvolte nel processo o a alterazione nell’espressione di questi geni, sono correlati a

numerose neoplasie. In ogni caso, la riduzione di uno o più componenti del checkpoint

mitotico possono provocare la non-disgiunzione dei cromosomi, con conseguente

aneuplodia.

Uno degli enzimi modificati che causa anomalie nel checkpoint mitotico è la chinasi Aurora, la

cui funzione è quella di assicurare la corretta separazione fra i cromatidi fratelli.

Una terapia ancora in studio, prevede la somministrazione di Ab anti-Aurora, determinando la

morte delle cellule tumorali in continua proliferazione.

L’aneuplodie possono essere causate anche da errori nell’orientamento del fuso

mitotico, come l’orientamento merotelico, in cui un cinetocore di un cromosoma è

legato a microtubuli provenienti da entrambi i poli del fuso (perdita di cromosomi), o 59

l’orientamento monotelico, in cui un cinetocore non è legato ai microtubuli (non-

disgiunzione), oppure l’orientamento sintelico, in cui due cinetocori fratelli sono

associati a microtubuli provenienti dallo stesso polo del fuso mitotico (non-

disugiunzione). Teoria epigenetica del cancro

Tale teoria afferma che l’origine del cancro è da ricercarsi nelle modificazioni

epigenetiche, comprendenti le variazioni dei patterns di metilazione, le alterazioni

della cromatina e la perdita di imprinting genomico. La teoria prevede il succedersi di

tre fasi:

Epigentic distruption of an epigenetic progenito model

1. , in cui una cellula

progenitrice, generalmente una cellula staminale, subisce modificazioni

epigenetiche;

2. Initiating mutation, in cui mutazioni genetiche provocano sbilanci nell’espressione

degli oncogeni e degli oncosoppressori.

3. Le cellule tumorali acquisiscono plasticità genetica ed epigenetica, che determina la

formazione di una popolazione eterogenea e che consente alle cellule tumorali di

cambiare il proprio assetto epigenetico, al fine di aumentare la loro invasività,

capacità di metastizzare e la resistenza ai farmaci.

Numerose evidenze supportano tale modello. Per esempio, è stato dimostrato che

cambiamenti epigenetici a livello globale precedono la mutazione iniziale nel cancro;

infatti, tutte le neoplasie esaminate mostrano variazioni nei pattern di metilazione.

Inoltre, la perdita di imprinting genomico di Igf2 è comune nell’epitelio di individui a

rischio di sviluppare il cancro colon-rettale.

Secondo il modello epigenetico, i geni delle cellule progenitrici che sono soggetti ad

tumor-progenitors genes

alterazioni epigenetiche sono i , geni che mediano l’espansione

delle cellule progenitrici e che aumentano la propensione ad evolvere in cellule

self-renewal

tumorali, probabilmente aumentano la loro capacità di e pluripotenza.

Un altro aspetto preso in considerazione in questo modello riguarda la capacità delle

cellule di comunicare con il microambiente, la nicchia, che le circonda. In particolare,

viene approfondito il cross-talk che media la metastatizzazione e il ruolo di alcune

proteine, come le caderine, le integrine e le connessine.

Tutte e tre le teorie sono accettate e sembra che lo sviluppo della patologia

neoplastica sia spiegabile con l’integrazione delle tre teorie. 60

Drosophila

Negli anni ’30 Muller osservò che il trattamento di cellule di con raggi X

provocava rotture nei cromosomi, che reagivano preferenzialmente fra loro e non con

cromosomi sani. Ciò era dovuto al fatto che i cromosomi intatti presentavano

estremità incappucciate, che Muller chiamò telomeri. Successivamente, la McClintock

osservò, nel mais, che la presenza di estremità prive di telomeri, conseguente alla

rottura di un cromosoma, era il motivo per cui si innescava il ciclo di rottura-fusione-

ponte durante il riarrangiamento. Il cromosoma “rotto” reagisce con il cromosoma

“rotto” più vicino e la velocità di tale fusione è direttamente proporzionale alla

vicinanza tra i due cromosomi. Ciò da vita a cromosomi dicentrici (due centromeri),

che formano una struttura a ponte durante l’anafase e, successivamente, danno

origine ad un’altra rottura, quando i due centromeri sono tirati ai poli opposti del fuso

mitotico. Tetraymena

Negli anni ’70 Blackburn identificò la struttura dei telomeri di (protista

ciliato), che consisteva in una sequenza ripetuta ricca di guanine.

I telomeri sono complessi di DNA e proteine che incappucciano e proteggono le

estremità dei cromosomi, prevenendo la fusione tra cromosomi e riarrangiamenti del

DNA che potrebbero portare ad instabilità genetica, ma, soprattutto, evitano la

perdita di informazioni durante la duplicazione dei cromosomi. Infatti, la DNA

polimerasi non è in grado di replicare il cromosoma fino alla sua terminazione e se non

ci fossero i telomeri la replicazione del DNA comporterebbe una significativa perdita

di informazione genetica ad ogni ciclo.

I telomeri riescono a svolgere la propria funzione di protezione delle estremità

cromosomiche, in quanto la struttura si ripiega su se stessa a formare un loop, detto 61

T-loop e il filamento G si ripiega ulteriormente all’interno di tale loop, formando il

cosiddetto D-loop con una

piccola estremità libera a

singolo filamento.

Il DNA telomerico consiste,

generalmente, di una sequenza

ripetuta su un filamento ricco

di residui di guanina. Tale

filamento, il filamento G, si

estende al 3’ dell’estremità del

cromosoma e protrude da essa

formando una struttura a singolo filamento.

La caratterizzazione delle sequenze telomeriche ha portato all’identificazione di

numerose proteine che si associano ai telomeri, di cui le principali risultano TRF1

TRF2, che formano generalmente, un eterodimero, che recluta altre proteine, tra cui

Tin2 e Rap1. In particolare, TRF1 è un omodimero, che lega le ripetizioni dei telomeri

Schizosaccharomyces pombe

e la cui delezione del suo omologo in , un lievito,

determina l’elongazione dei telomeri, mentre la sua over-espressione ne determina

l’accorciamento. Probabilmente, quindi, la TRF1 gioca un ruolo nella protezione dei

telomeri e potrebbe essere importante nella regolazione della loro lunghezza,

cis

mediante l’inibizione in della telomerasi. TRF2, invece, è un omologo di TRF1,

espresso in modo ubiquitario, che lega le ripetizioni telomeriche. La sua over-

espressione determina la perdita del filamento G, un aumento della fusione fra

estremità cromosomiche e il blocco del ciclo cellulare in uno stato simil-senescente.

TRF2, quindi, è necessario per il mantenimento dell’estremità telomerica, anche se non

è ancora chiaro se interagisca con le sequenze ripetute direttamente o mediante altri

fattori proteici. TRF1 e TRF2, quindi, competono per gli stessi siti di legame e le loro

funzioni antagoniste

consentono il

mantenimento delle

dimensioni del telomero in

condizioni fisiologiche.

Il TRF1 interagisce,

inoltre, con l’enzima

Tankyrasi, che presenta

all’estremità C-terminale 62

un dominio catalitico correlato alla poli ADP-ribosio polimerasi (PARP). Probabilmente,

Tankyrasi, mediante la propria attività polimerasica, segnala lo stato dei telomeri. Un

altro componente dei telomeri è, probabilmente, rappresentato dalla proteina

hnRNPA1, la cui delezione causa un accorciamento dei telomeri, che sembra interagire

con TRF2. Infine, studi recenti dimostrano che mutazioni dell’eterodimero Ku

(Ku70:80), componente fondamentale del sistema di riparazione NHEJ, causano

accorciamento telomerico. Essa agisce come cappuccio, preservando la struttura dei

telomeri e, presumibilmente, la sua attività (promuovere l’unione delle estremità) si

modifica quando lega i telomeri.

Nelle cellule somatiche (attività telomerasi livelli quasi non rilevabili) si osserva con il

procedere dei diversi cicli di replicazione

l’accorciamento dei telomeri.

Infatti, la DNA polimerasi non è in grado

di replicare l’estremità 5’, una volta che il

primer è stato rimosso, provocando un

accorciamento progressivo di tale

estremità dei cromosomi.

Questo è correlato, secondo alcune

ipotesi, ai processi di senescenza

cellulare. Ancora oggi non è chiaro quante

ripetizioni siano necessarie affinché i

telomeri risultino stabili, in quanto la

maggior parte dei meccanismi utilizzati

per determinare la loro lunghezza sono

indiretti. Infatti, la lunghezza dei

telomeri viene misurata attraverso l’uso

di enzimi di restrizione, che generano frammenti contenenti il DNA telomerico e

terminal restriction fragments

subtelomerico. Questi frammenti, definiti (TRFs),

sono identificati mediante l’uso di sonde telomeriche nel Southern blot. In media la

regione subtelomerica misura ~2.4Kb, mentre le ripetizioni della sequenza telomerica

(TTAGGG nell’uomo) variano fra 1-12Kb. [NB: le dimensioni dei telomeri non è uguale in

tutti i cromosomi e man mano che la cellula invecchia, la dimensione dei telomeri

diminuisce].

Le sequenze codificanti a ridosso delle sequenze subtelomeriche non codificanti sono quelle che più

frequentemente vanno incontro a inattivazione per eterocromatizzazione estensione

dell’inattivazione del DNA. 63

Sono stati ipotizzati due diversi modelli per spiegare come l’accorciamento dei

telomeri, o meglio la presenza di telomeri “corti” tipici delle cellule in senescenza,

inducano l’arresto della crescita cellulare:

1. I telomeri determinano il silenziamento dei geni adiacenti mediante un processo di

eterocromatizzazione.

2. La mancanza di telomeri o la presenza di telomeri corti alle estremità dei

cromosomi è riconosciuta come danno genomico, che provoca l’attivazione di p53 e

arresto del ciclo cellulare. infatti, un telomero corto non è più in grado di

proteggere le estremità del cromosoma, che vanno incontro a fenomeni di

riarrangiamento con altre estremità di cromosomi con telomeri corti oppure sono

attaccate da endonucleasi.

Negli eucarioti unicellulari e nella linea germinale di molti organismi multicellulari,

invece, la perdita dei telomeri è contrasto con

D. melanogaster

diversi meccanismi. In , per

esempio, la lunghezza dei telomeri è

mantenuta attraverso la trasposizione di

retroelementi alle estremità cromosomiche,

Anopheles gambiae

mentre in i telomeri sono

mantenuti da meccanismi di ricombinazione.

Comunque, il meccanismo più conservato e studiato per preservare la lunghezza

telomerica riguarda l’aggiunta di nucleotidi al filamento G, attraverso l’attività di un

complesso enzimatico ribonucleoproteico, la

telomerasi. Essa consiste di una molecola di

RNA e proteine, codificate da diversi geni,

che si pensa servano a mantenere l’enzima in

posizione sul filamento.

La subunità catalitica dell’enzima, TERT

(telomerase reverse transcriptase), è una

trascrittasi inversa, che presenta sette domini in comune con le trascrittasi dei

retrovirus e presenta, a differenza delle

altre, come parte della sua stessa struttura

una molecola di RNA (560 dNTP nell’uomo),

detta TER. Tale molecola di RNA a

dimensioni variabili tra i 500 e i 1300

nucleotidi e presenta una regione centrale 64

complementare al filamento G del telomero. I primi nucleotidi al 3’ complementari alle

sequenze telomeriche si appaiono con il filamento G e i restanti nucleotidi della

molecola di RNA sono usati come stampo. I componenti proteici della telomerasi,

quindi, catalizzano l’aggiunta di nuove ripetizioni sul filamento G, utilizzando le

ripetizioni al 3’ del filamento G stesso come primer.

La sintesi del DNA telomerico avviene in modo discontinuo, una volta raggiunta la fine

dello stampo, infatti, la telomerasi trasloca e riallinea l’estremità 3’ della propria

molecola di RNA con gli ultimi tre nucleotidi del filamento G ed inizia un nuovo ciclo.

Nel lievito, l’attività in vivo della telomerasi richiede la presenza della proteine Est1,

la quale si pensa sia necessaria per l’attacco dell’enzima a livello delle sequenze

telomeriche.

Studi recentissimi hanno ipotizzato che la telomerasi possa esplicare la propria funzione anche su

punti di rottura del cromosoma, determinando un evento che prende il nome di chromosome healing.

Diversi studi hanno dimostrato che in colture di cellule primarie trasfettate con virus

oncogeni, come EBV e HPV, la maggior parte si comporta come cellule normali, cioè

dopo un periodo di crescita entra in una fase di crisi, caratterizzata da un incremento

della morte cellulare e aberrazioni cromosomiche. Una piccola parte, costituita da

cellule immortalizzate, però, continua a crescere in modo indefinito e presentano una

telomerasi attiva. Nella maggior parte delle cellule immortalizzate i telomeri sono

corti, circa 2-4Kb, ma in alcuni casi l’immortalizzazione è seguita da un allungamento

dei telomeri, implicando, quindi, l’esistenza di un meccanismo capace di determinare

l’allungamento delle sequenze telomeriche e non solo il loro mantenimento. Le cellule

immortalizzate prive di telomerasi attiva, sono caratterizzate da telomeri molto

lunghi, suggerendo che la

telomerasi possa essere

stata attivata

precocemente per poi

essere repressa, oppure

presentano dei

meccanismi di

mantenimento della Mutazione e perdita controllo

lunghezza dei telomeri proliferazione

alternativi, rappresentati

da pathway telomerasi-

indipendenti (ALT), come 65

quello presente in Drosophila.

L’espressione della telomerasi in cellule somatiche rappresenta un marker tumorale.

Infatti, solo nel 10% dei tumori non è stata riscontrata la presenza di telomerasi

attiva e si pensa che tale percentuale si avvalga di meccanismi ALT per conservare le

dimensioni dei telomeri. Ovviamente, la comprensione dei meccanismi di regolazione

della telomerasi in cellule somatiche e, soprattutto, in cellule tumorali potrebbe

essere fondamentale per lo sviluppo di nuove strategie anti-tumorali, anche se l’uso di

farmaci anti-telomerasi potrebbe influenzare la vitalità delle cellule dei tessuti

germinali e immunitari.

Infine, studi effettuati su topi knockout per la telomerasi hanno dimostrato che tali

topi erano in grado di vivere a lungo ed erano fertili (mantenuti fino all’8°

generazione). La fertilità di questi topi può essere spiegata con l’attivazione di

meccanismi ALT nelle cellule della linea germinale. I MEFs derivati da questi, invece,

in vitro mostrano una forte instabilità genetica (in vivo però no, perché altrimenti il

topo morirebbe).

Telomere capture meccanismo per la stabilizzazione della delezione della regione

terminale del cromosoma associata alla duplicazione invertita,

che consiste nello spostamento di frammenti telomerici da un

cromosoma all’altro. 66

Da un punto di vista storico, il termine oncogene nasce con la scoperta di Raus che

polli infettati con il virus RSV (virus del sarcoma di Raus) sviluppavano sarcomi.

Questo retrovirus presentava un genoma caratterizzato dalla presenza di un gene

accessorio, src, che gli conferisce la capacità trasformante.

Attraverso studi di ibridazione è stato dimostrato che questo gene è un gene

cellulare (c-src) trasdotto nel genoma virale (la sonda per il gene src ibridava sia con il

genoma cellulare che virale) e poiché v-src non contiene introni è stato ipotizzato che

la trasduzione fosse avvenuta a livello di RNA.

Il modello che è stato proposto per la trasduzione degli oncogeni cellulari nel genoma

virale può essere suddiviso in 5 fasi:

1. La cellula è infettata con il retrovirus replicazione-competente.

2. Il genoma virale si integra in quello cellulare, casualmente in prossimità di un

oncogene cellulare.

3. Avviene una delezione al 3’ , che contiene il segnale di stop della trascrizione, del

provirus.

4. La trascrizione virale procede oltre il genoma virale integrati, determinando la

trascrizione anche dell’oncogene cellulare.

5. Il genoma delle particelle virali neoformate risulta tronco, in quanto privo della

regione al 3’, e quindi i virioni sono difettivi. 67

Il gene c-src codifica per una tirosin chinasi, situata sotto la membrana plasmatica,

composta da quattro domini: SH1, dominio catalitico, SH2, dominio regolatorio, che

interagisce con proteine che presentano Tyr fosforilate, SH3, dominio regolatorio che

interagisce con proteine ricche in Pro e SH4, dominio responsabile dell’interazione co

le membrane. All’estremità C-terminale, in posizione 527, è presenta una Tyr

conservata fosforilata, che interagisce con il dominio SH2, mantenendo la proteina in

uno stato inattivo. Quando tale residuo viene defosforilato, ad opera di fosfatasi, la

proteina si attiva e si distende, determinando una riorganizzazione del citoscheletro

prima della divisione e stimola la via degli inositol lipidi, che a sua volta genera segali

di proliferazione.

La proteina codificata da v-src manca di 7 aa, tra cui la Tyr527, con conseguente sua

attivazione permanente. Questo implica un continuo segnale di crescita e conseguente

divisione cellulare continua.

In alcuni casi l’acquisizione dell’oncogene cellulare si verifica a spese della mancata

trascrizione di una parte del provirus, con conseguente produzione di retrovirus

oncogeni difettivi. Questi sono in grado di produrre progenie virale solo co-infettano

la stessa cellula ospite con un virus helper. In questo caso, infatti, la trascrittasi

inversa copia i genomi di entrambi i virus attraverso un meccanismo di scelta della

copia, che consente la trascrizione del genoma del virus difettivo e della regione al 3’

di quello helper. In questo modo le particelle virali neoformate risultano

replicazione-competenti.

Successivamente, sono stati identificati altri virus oncogeni, cioè capaci di indurre

trasformazione tumorale e tutti sono caratterizzati dalla presenza di sequenze non

canoniche nel loro genoma. Per esempio, il virus della mieloblastosi aviaria presenta il

gene Myb, mentre il virus del sarcoma felino presenta il gene Fms. Tutti questi virus

sono privi di alcuni geni tipici dei retrovirus (il primo manca di env e l’altro di pol).

Altri virus oncogeni, invece, presentano oncogeni nel loro genoma, necessari al loro

ciclo replicativo. Tra questi possiamo ricordare il papilloma virus, virus a DNA con

tropismo esclusivo per le cellule epiteliali dell’epidermide e delle mucose e la cui

replicazione è condizionato dallo stato di differenziazione della cellula ospite. Esso

deve la propria capacità di favorire la trasformazione tumorale alla codificazione di

tre oncogeni: 68

E5

: è una piccola proteina idrofobica, localizzata nelle membrane della cellula

infetta ad ha la funzione di alterare la funzione delle proteine di membrana

coinvolte nei segnali di proliferazione cellulare (EGF). In particolare, i dimeri di E5,

inseriti nella membrana cellulare nelle vicinanze dei recettori per PDGF, ne

provocano l’attivazione, indipendentemente dalla presenza del ligando, stimolando la

proliferazione cellulare.

E6

: è costituita da circa 151 aa e presenta due domini a dito di zinco. È una dei

principali oncogeni del virus e viene espressa precocemente nel corso del ciclo

virale. Essa induce una parziale inversione del processo di differenziamento negli

strati epiteliali e la sua interazione con diversi fattori cellulari durante i ciclo virale

può inibire l’attivazione del programma apoptotico cellulare. La principale azione

anti-apoptotica del virus viene esplicata attraverso il legame di E6 con p53, in un

complesso ternario che coinvolge anche una ligasi-ubiquitina, E6AP. Tale complesso

induce l’ubiquitazione e la degradazione di p53. Inoltre E6 è in grado di regolare

negativamente l’attività di p53 anche in modo indiretto, attraverso la sua

associazione con p300/CBP, un co-attivatore di p53. E6 è anche in grado di inibire

l’apoptosi attraverso un pathway indipendente da p53, caratterizzato

dall’interazione di E6 con Bak, un membro pro-apoptotico della famiglia Bcl-2.

Questa interazione causa la degradazione ubiquitina-dipendente di Bak, attraverso

il reclutamento della ligasi ubiquitina E6AP.

In ceppi ad alto rischio la proteina E6 è in grado di attivare l’espressione della

subunità catalitica della telomarsi, con conseguente accorciamento dei telomeri nel

corso delle divisioni cellulari e induzione finale della senescenza. Inoltre, induce la

degradazione delle proteine MAGUK associate alle membrane, determinando la

perdita del contatto cellula-cellula e della polarità cellulare.

E7

: è il principale oncogeno responsabile dell’attività trasformante degli HPV ad

alto rischio. Le proteine E7 sono fosfoproteine di 98 aa e sono attive in forma

dimerica, la cui struttura è caratterizzata da tre regioni conservate, CR1, che

causano la degradazione di pRb, principale target intracellulare legato da E7. La

funzione principale di E7 è quella di stimolare le cellule a rientrare nella fase S del

ciclo cellulare. Ciò determina l’assenza della fase di senescenza della cellula ospite,

con conseguente immortalizzazione cellulare (la proteina pRb interagisce con E2F1,

E2F2 e E2F3 inibendo la loro funzione. Oltre a legarsi al dominio di attivazione

trascrizionale dei fattori E2F, pRb recluta anche i fattori di rimodellamento della

cromatina, come ad esempio la istone deacetilasi 1 (HDAC-1), per reprimere

ulteriormente la trascrizione dipendente da E2F. Nella fase G1 precoce pRb, nelle

sue forme ipofosforilate, può legarsi al fattore di trascrizione E2F e impedirne

l’attivazione attraverso la dimerizzazione con DP. In tal modo pRb riesce a 69

reprimere efficacemente la trascrizione dei geni controllati da E2F. In seguito a

stimoli proliferativi, nel corso della progressione della cellula dalla fase G1 a quella

S del ciclo cellulare, pRb viene progressivamente iperfosforilato dai complessi

ciclina-chinasi, provocando il rilascio della proteina dal legame col fattore E2F, il

quale può così attivare la trascrizione dei geni coinvolti nella sintesi del DNA e nella

progressione del ciclo cellulare).

Quindi lo scopo principale dell’inattivazione della famiglia RB da parte delle

oncoproteina E7, è quello di attivare la trascrizione dei geni regolatori del ciclo

cellulare e della sintesi del DNA controllati da E2F, in modo da stabilire un

ambiente permissivo per la replicazione virale. Legando pRb nello stato

ipofosforilato, E7 sequestra la proteina dal legame con i complessi dimerici

E2F/DP1, col risultato di un’attivazione costitutiva dei geni controllati da E2F/DP1.

L’abolizione della funzione

di pRb promuove la

progressione del ciclo

cellulare nelle cellule

epiteliali differenziate,

consentendo la fase di

replicazione produttiva dei

geni HPV.

Le proteine E7 dei ceppi a

basso rischio legano pRb

con un affinità ridotta,

rispetto a quelli ad alto

rischio.

Inoltre, E7 lega le pocket protein p130 e p107, favorendo la progressione del ciclo

cellulare, promuove l’alcalinizzazione citoplasmatica in cheratinociti primari,

tramite la stimolazione del co-trasportatore di membrana Na+/H+ (della famiglia

NHE-1), regola negativamente l’espressione della proteina TApo-1, necessaria per

il trasporto attivo di peptidi antigenici dal citosol nel lume del RE.

Anche l’HIV, virus a RNA, e l’Epstein-Barr virus, virus a DNA, presentano la capacità

di promuovere la trasformazione tumorale. Il primo, infatti, presenta nel proprio

genoma il gene Tat, che codifica per la proteina Tat, che entra nel nucleo cellulare,

dove attiva la trascrizione dei geni virali, legandosi alla sequenza TAR presente al 5’

degli mRNA nascenti, aumentando l’efficienza della RNA polimerasi II. Inoltre causa

la trans-attivazione della trascrizione dei geni codificanti citochine e fattori di

crescita, partecipando alla patogenesi del sarcoma di Kaposi. EBV

Nell’infezione latente, invece, EBV produce tra le varie proteine EBNA2 (

nuclear antigen latent membrane protein

) e LMP1 ( ). Il primo è un fattore 70

trascrizionale capace di promuovere la trascrizione dell’oncogene c-fgr, implicato

nella stimolazione della proliferazione cellulare, mentre LMP1 si associa, sulla

membrana plasmatica, a una proteina mediatrice di segnali che inducono

proliferazione e attiva l’oncogene bcl2, che contrasta l’apoptosi.

In questo modo i linfociti B infetti latentemente formano un a popolazione in attiva

proliferazione, in cui si ha una maggiore possibilità di secondi eventi, come mutazioni,

che possono provocare la trasformazione neoplastica. EBV è associato al linfoma di

Burkitt.

In generale, i virus oncogeni ad RNA sono distinti in base al loro potenziale oncogeno

in acutamente trasformanti, caratterizzati da un processo rapido e capaci di

infettare cellule in coltura, e virus debolmente trasformanti, caratterizzati da un

processo più lungo. Fino al 1976 si riteneva che per indurre il cancro era necessaria

un’infezione virale, in quanto la sequenza trasformante era portata dal genoma virale.

Nel 1976 Bishop, utilizzando cDNA delle sequenze non canoniche virali, ibridizza

cellule normali in coltura e osserva che in esse sono presenti sequenze complementari

alle sequenze virali. Quindi, le sequenze virali sono state ottenute da quelle cellulari

e si comincia a parlare di V-onc e C-onc.

Tali sequenze cellulari sono definite protooncogeni, la cui conversione ad oncogene

può avvenire attraverso diversi meccanismi:

Mutagenesi inserzionale: è un meccanismo tipico dei virus, che integrandosi nel

genoma della cellula ospite in siti casuali possono determinare la cis-attivazione

dell’oncogene. Un esempio è rappresentato dal virus della leucosi aviaria, che causa

una proliferazione dei linfociti, integra il proprio genoma a livello del primo esone o

del primo introne dell’oncogene c-myc. La trascrizione del genoma determina la

produzione di un mRNA caratterizzato dalla sequenza 5’LTR a monte di c-myc, che

quindi è attivato.

Un altro esempio è il virus dell’epatite B, associato al carcinoma epatocellulare

primitivo, che può integrare il proprio genoma nella sequenza del recettore

dell’acido retinoico o nel gene della ciclina A, modificando il controllo della

crescita cellulare, oppure nel cromosoma 17, determinando la perdita di un allele

dell’oncosoppressore p53.

HBV può causare trasformazione neoplastica anche attraverso il prodotto del gene X,

che agisce come transattivatore della trascrizione di numerosi geni associati alla

proliferazione cellulare, come gli oncogeni c-fos, c-myc e c-jun 71

Mutazioni puntiformi: ovviamente non si tratta di mutazioni sinonime. Un esempio

è rappresentano dall’oncogene Ras, in cui le mutazioni riguardano principalmente

hot spots

tre , che possono rendere la GTPasi insensibile all’inattivazione da parte

dei fattori GAP oppure possono inibirne l’attività GTPasica. In entrambi i casi il

risultato finale consiste in una attivazione costitutiva dell’enzima. I geni della

famiglia Ras sono mutati con frequenza elevata nei carcinomi del pancreas (90%),

del colon (50%) e dei tumori al polmone (30%).

Traslocazione: può rendere una sequenza costantemente espressa (ex: linfoma di

Burkitt traslocazione di c-myc o formazioni di geni di fusione con conseguente

produzione di una proteina chimerica).

Delezioni: determinano la produzione di una proteina tronca non funzionante. Ciò si

verifica in alcuni tumore nel gene codificante il complesso di trascrizione AP1. In

particolare, la delezione comporta la perdita della regione al 3’UTR, con

conseguente non regolazione della traduzione da parte dei miRNA, oppure la

perdita di una sequenza di regolazione della traduzione.

Amplificazione: causa una produzione eccessiva del prodotto del protooncogene,

con conseguente induzione alla trasformazione neoplastica (ex: erbB2/HER2 nei

carcinomi della mammella).

Meccanismi epigenetici.

Tutte queste modificazioni sono dominanti!!!

Al giorno d’oggi vengono definiti oncogeni tutti quei geni che, in seguito a

modificazioni molecolari che ne causano un guadagno di funzione, favoriscono la

trasformazione neoplastica. Sono geni dominati e pertanto è sufficiente l’eterozigosi

affinché si manifesti un fenotipo trasformato e i loro prodotti possono essere

classificati in sei gruppi principali:

1. Fattori di trascrizione: sono spesso famiglie multigeniche che presentano domini

strutturali comuni. Un esempio è rappresentato dalla famiglia dei fattori di

trascrizione Fos include c-Fos, FosB, Fra1, Fra2 e varianti di splicing di FosB,

come FosB2 e δFosB2. I membri

della famiglia Fos dimerizzano

con i fattori trascrizionali Jun

(entrambi presentano una

regione a cerniera di leucine per

la dimerizzazione) per formare il

complesso trascrizionale AP1, 72

che incrementa l’espressione di numerosi geni che controllano la proliferazione

cellulare (Ciclina D1, p16 e Rb), l’angiogenesi (VEGF), l’invasività e la

metastatizzazione, l’ipossia (geni coinvolti nei meccanismi di difesa dall’ipossia) e il

differenziamento (recettore per gli estrogeni) , legando i promotori che

contengono una sequenza TRE (elementi di risposta all’attivatore tissutale del

serum

plasminogeno). Nel promotore del gene Fos è presente la sequenza SRE (

response element Serum response factor

), legata normalmente da SRF ( ) e p62,

che ne impediscono la trascrizione. In seguito a stimolazione con fattori di

crescita, shock termico, esteri del forbolo, radiazioni UV o metalli pesanti, p62

viene fosforilata da membri appartenenti alla

famiglia delle ERK (MEK ERK), consentendo la

trascrizione di Fos. In molte cellule tumorali

sono espressi costantemente, determinando un

costante stimolo alla proliferazione cellulare.

Un altro esempio è rappresentato dalla famiglia dei fattori di trascrizione Myc

(trascritti solo in cellule in proliferazione), che comprende c-myc, N-myc e L-myc,

caratterizzati dalla presenza di un dominio di trans-attivazione, TAD, che deve

essere fosforilato per determinare l’attivazione della proteina (fosforilazione da

parte di ERK, a sua volta attivato da Ras, attivato dai fattori di crescita) e un

basic Helix-Loop-Helix/Leucine Zipper

dominio composito bHLH/LZ ( ) che gli

consente di legare il DNA (bHLH) e di dimerizzare con il fattore di trascrizione

Max (trascritto in tutte le cellule). I dimeri Myc-Max legano le sequenze E-box

(CACGTG) nei geni target, stimolandone la trascrizione. Esplicata la propria

funzione Myc viene degradato

rapidamente, mentre Max forma

dimeri con Mad (trascritto in

cellule quiescenti) e Mnt, che

agiscono come repressori

trascrizionali delle sequenze E-

box. Tra i geni target di Myc

possiamo ricordare il gene per

l’ornitina decarbossilasi, che

interviene nella biosintesi delle

poliammine (necessarie per la sintesi di DNA) e Cdc25A, fosfatasi che interviene

nella progressione del ciclo cellulare dalla fase G1 alla fase S. Quindi, Myc

promuove la proliferazione cellulare e la progressione del ciclo cellulare e, 73

recentemente, è stato proposto anche un suo ruolo nel rimodellamento sulla

cromatina, mediante il reclutamento di istone acetil-trasferasi, HAT (i dimeri

Max-Mad reclutano istone deacetilasi, favorendo la formazione di

eterocromatina).

Infine, è stato scoperto che tra i geni target di Myc vi sono anche geni pro-

apoptotici, che sono attivati in condizioni di stress, danno genotossico e mancanza

di fattori di crescita. Il pathway propapoptotico iniziato da Myc determina

l’attivazione in sequenza di ARF (p19), p53 e la caspasi 9. Questa duplice e

contrastante funzione di Myc è regolata dalla presenza di Bcl2, che in condizioni

fisiologico è espresso solo nelle stem cells, in cui reprime la funzione

proapoptotica di Myc.

Negli anni200 sono stati condotti numerosi studi su dischi immaginali (abbozzi embrionali) di

Drosophila, che hanno dimostrato che Myc nell’insetto è coinvolto nella crescita cellulare e nello

sviluppo dell’organismo. Infatti, se Myc viene over-espresso si ottiene una Drosophila di

dimensioni maggiori del normale, mentre se il gene viene represso si ha la morte dell’insetto.

Sembra che tra i suoi geni target vi siano geni, i cui prodotti regolano la maturazione dell’rRNA.

2. Fattori di crescita: uno dei primi ad essere stato identificato è il PDGF (fattore di

crescita derivato dalle piastrine), dimero rilasciato dalle piastrine durante i

processi di coagulazione del sangue. Esso può stimolare la proliferazione di diversi

tipi cellulari e la sua iper-espressione in vitro induce la trasformazione di

fibroblasti che esprimono il corrispettivo recettore.

3. Recettori per fattori di crescita: risultano alterati in numerose anomalie. In molti

casi, per esempio, si verifica una perdita del dominio di interazione con il ligando

del recettore dell’EGF, con conseguente attivazione costitutiva del recettore, che

si traduce in proliferazione cellulare.

4. Trasduttori del segnale: esempi sono la tirosin chinasi codificata dal gene scr

(vedi Sarcoma di Raus) e la famiglia

ras, che comprende tre membri (c-Ras-

Ha, c-Ras-ki e N-ras), codificanti

GTPasi ad alta omologia di 188-189 aa.

Queste aderiscono al lato interno della

membrana cellulare attraverso residui

di Cys localizzati nella porzione C-

terminale. Le proteine Ras svolgono

differenti ruoli nella fisiologia 74

cellulare, in particolare, risultano essere importanti mediatori tra i fattori di

crescita e gli effettori mitogenetici coinvolti nella proliferazione e nel

differenziamento cellulare. In seguito alla loro attivazione, infatti, numerosi

recettori tirosin chinasici reclutano la proteina adattatrice SOS, che a sua volta

interagisce con le proteine Ras inattive (mantenute in tale stato dai fattori GAP),

promuovendone l’attivazione. Il complesso Ras-GTP interagisce con Raf1, una

serin-treonin chinasi, determinando l’attivazione della cascata della MAPK (MEK-

ERK), che dimerizza e trasloca nel nucleo, dove promuove l’attivazione di Fos e

Jun.

5. Regolatori dell’apoptosi

6. Proteine cromatiniche

Alla fine degli anno ’60 Henry Harris e collaboratori dimostrarono che la fusione di

cellule tumorali con cellule somatiche, fibroblasti e linfociti, dava origine ad ibridi i

cui la tumorigenicità risultava diminuita. Tali risultati potevano essere spiegati solo

con il fatto che le cellule somatiche fornivano funzioni assenti nelle cellule tumorali.

Ciò implicava l’esistenza di altri geni che svolgono un ruolo determinante

nell’insorgenza e nella progressione tumorale. Tali geni furono chiamati

oncosoppressori ed essi inibiscono lo sviluppo del cancro e si oppongono alle funzioni

degli oncogeni.

In cellule sane, l’omeostasi è mantenuta dall’equilibrio tra oncogeni e

oncosoppressori, consentendo la proliferazione cellulare controllata e impedendo la

two hit

trasformazione tumorale. Il modello di Knudson diede, inoltre, una

spiegazione all’apparente paradosso per cui i tumori sono ereditati in modo

dominante, mentre gli oncogeni agiscono in modo recessivo. Infatti, Knudson

dimostrò che la mutazione dell’oncosoppressore Rb è recessiva e, infatti, solo in

individui omozigoti si sviluppa il retinoblastoma. Successivamente, studi di mappatura

genica dimostrarono che il retinoblastoma si sviluppava in soggetti in cui il

cromosoma 13 presentava una delezione del braccio lungo, che determinava la perdita

two

di Rb e mutazioni nell’altro allele del gene. Ciò confermò la validità del modello

hit .

I prodotti proteici codificati dagli oncosoppressori svolgono funzioni, generalmente

in contrasto con quelle degli oncogeni. In particolare, le funzioni degli

oncosoppressori sono:

Repressione di geni essenziali per la prosecuzione del ciclo cellulare 75

Interruzione del ciclo cellulare in caso di DNA danneggia

Induzione dell'apoptosi

Soppressione del processo di metastatizzazione: tra le proteine con tale funzione

vi sono diverse proteine coinvolte nell'adesione cellulare, capaci di impedire la

disseminazione delle cellule tumorali nell'organismo.

gatekeeper

Gli oncosoppressori vengono definiti “ ”, ossia controllori, in quanto regolano

l’equilibrio di diverse funzioni cellulari. Tra i più importanti e studiati oncosoppressori

possiamo ricordare:

shuttle-protein

APC: una in grado di muoversi tra il nucleo e il citoplasma, la cui

principale funzione è modulare i livelli citoplasmatici di β-catenina, che migrata nel

nucleo attiva i complessi proteici di trascrizione detti TNA, con conseguente

trascrizione di cMyc e ciclina D1. In particolare, l’APC forma un complesso

enzimatico che fosforila la β-catenina che viene ubiquitinata e degradata. Se il

fattore di crescita wnt si lega al suo complesso recettoriale, si ha inattivazione

delle proprietà chinasiche dell'APC, con conseguente accumulo di β-catenina e

crescita cellulare. Sue mutazioni sono coinvolte nel tumore del colon-retto.

PTEN: codifica per una fosfatasi che defosforila sia substrati proteici che PIP3,

inibendo l’attività della chinasi Akt (PIP3 attiva chinasi PDK1 attiva

Akt), che stimola la proliferazione e la sopravvivenza cellulare, inducendo la

trascrizione di MDM2 e inibendo quella dei fattori proapoptotici. Inoltre,

Akt attiva la chinasi mTOR, che forma due complessi, di cui uno promuove la

sintesi di Myc e della ciclina D. Sue mutazioni sono coinvolte nelle Sindromi

amartomatose assiociate a PTEN, tra cui la sindrome di Cowden (predispone a

carcinomi di tiroide, mammella, cervello, endometrio e tratto gastro-

intestinale).

NF1: codifica la neurofibronina 1, una GAP che aumenta l’attività GTPasica di Ras,

mantenendola in uno stato inattivi. Sue mutazioni sono coinvolte nel

neurofibrosarcoma.

BRCA1 e BRCA2: localizzati rrispettivamente sul cromosoma 17 e 13, codificano

per proteine coinvolte nel processo di riparazione per

ricombinazione omologa del DNA. In particolare, BRCA1 attiva

BRCA2, che recluta RAD51, che avvia il processo riparativo

[danno al DNA attivazione chinasi ATM e ATR attivazione

BRCA1]. Loro mutazioni sono coinvolte nel carcinoma della

mammella e dell’ovaio.

Geni del sistema di riparazione del danno al DNA per escissione di nucleotidi o di

riparazione dei mismatch. Mutazioni in questi ultimi sono coinvolti nel cancro del

colon ereditario non poliposico, detto anche Sindrome di Lynch.

ATM: codifica una proteina che controlla l’integrità del DNA e sue mutazioni sono

coinvolte nell’ipersensibilità alla cancerogenesi da radiazioni. 76

Rb: nelle cellule di mammifero appartiene ad una famiglia genica, che codifica anche

per p130e p107, strutturalmente e funzionalmente correlate a Rb. Essa è un

cofattore in grado di potenziare o contrastare l’attività di altri fattori di

trascrizione ed inoltre agisce anche come proteina adattatrice reclutando

enzimi di rimodellamento della cromatina. Rb controlla il differenziamento

cellulare durante l’embriogenesi e nei tessuti adulti, regola l’apoptosi e svolge

check point

un ruolo nel G1 del ciclo cellulare. In particolare, è il suo grado di

fosforilazione (su treonine o serine) a determinare l’arresto o la progressione

del ciclo cellulare. In dettaglio, nella fase G0 o durante le prime ore della fase

G1, Rb è ipofosforilata, mentre è iperfosforilata in fase G1, S e G2 e perde i

propri gruppi fosfato solo alla fine della fase M. Quando Rb è ipofosforilata è

capace di legare i fattori di trascrizione E2F, inattivandoli. Quando la cellula

riceve stimoli proliferativi, i complessi ciclina D-CDK 4/6 fosforilano Rb, che

rilascia i fattori E2F, che inducono la

trascrizione dei geni target, tra cui c-

myc, la timidina chinasi e la

diidrofolato reduttasi, necessari per la

progressione del ciclo cellulare, e geni

proapoptotici.

Rb, inoltre, può essere acetilata,

sumoilata o clivata da caspasi.

L’acetilazione, che avviene a livello dei

residui di Lys, potrebbe prevenire

l’inattivazione della proteina, che

sarebbe attiva anche in assenza dei

complessi CDK-cline. La funzione della

sumoliazione sul residuo K270, invece,

è ancora sconosciuta, mentre il

clivaggio mediato dalla caspasi 8 al C-

terminale determina resistenza all’apoptosi, indotta da TNFα. Sue mutazioni

sono coinvolte nel retinoblastoma familiare e sporadico.

VHL: localizzato sul cromosoma 3, codifica per la proteina VHL che fa parte di un

complesso, la cui funzione consiste nell’indirizzare la subunità L del fattore

di risposta all’ipossia (HIF) alla degradazione, quando i livelli di ossigeno del

sangue sono fisiologici. Quando i livelli di ossigeno, invece, sono bassi la

subunità L non viene degradata, con conseguente aumento di espressione dei

geni correlati all’ipossia tra cui VEGF e il recettore per chemochine CXCR4.

Ino0ltre VHL può interagire con l’elongina B e C, impedendone il legame con

l’elongina A, con cui formano un complesso di elongazione SIII, che impedisce

alla RNA polimerasi di stallare durante la trascrizione. Infine, è stato

proposto che VHL interagisca con p53 e ATM al fine di aumentare le risposte

77

di p53. Mutazioni di questo gene, per lo più delezioni e mutazioni missenso,

sono correlate alla Sindrome di

Von Hippel-Lindau,

caratterizzata da suscettibilità

a diversi tipi di cancro,

contraddistinti dalla produzione

di alti livelli di VEGF (fattore di

crescita dell’endotelio

vascolare).

WT1: localizzato sul cromosoma 11,

codifica per un fattore

trascrizionale con 4 motivi a

dito di Zinco, implicato nelle

prime fasi dello sviluppo del rene. Sono state identificate 24 isoforme di

questa proteine, derivanti dalla combinazione di eventi di splicing alternativo,

editing e uso di codoni d’inizio alternativi. Le varianti più studiate sono quelle

ottenute per splicing del 5° esone, che includono o escludono 17aa, e le

isoforme ottenute per splicing del 9° esone, che includono o escludono 3 aa

tra i motivi a dito di Zn 3 e 4. WT1, in ogni caso, agisce come regolatore

trascrizionale e si comporta come un attivatore o un repressore in funzione

del contesto cellulare, regolando l’espressione di più di 20 geni coinvolti nella

regolazione del ciclo cellulare.

Mutazioni o delezioni di questo gene nella linea germinale sono correlate allo

sviluppo del tumore di Wilms, un tumore pediatrico del rene, dovuta al non

differenziamento delle cellule embrionali, che continuano a proliferare.

p53: localizzato sul braccio corto del cromosoma 17, appartiene alla stessa famiglia

di p63 e p73 (presentano un dominio addizionale SAM e loro mutazioni sono

state riscontrate in cellule di leucemia). Il prodotto proteico è una proteina

binding

caratterizzata dalla presenza di tre domini: il dominio di , che consente

il legame con sequenze consenso nei promotori dei geni target; il dominio N-

terminale, che è un dominio di trans-attivazione, contenente una regione ricca

in Pro, riconosciuta da proteine con domini SH3, e regione di legame di

proteine regolatorie, come MDM2; e il dominio C-terminale, necessario per la

tetramerizzazione, necessaria all’attivazione del fattore trascrizionale (è un

tetramero), seguito da un dominio regolatorio.

Il dominio di tetramerizzazione è connesso al C-terminale da una regione linker

basica, che ospita la sequenza di localizzazione nucleare, soggetta a

modificazioni post-traduzionale, che stabilizzano e attivano la proteina. Tali

modificazioni consistono nella fosforilazione delle Ser e delle Thr e

l’acetilazione da parte di p300 delle Lys del dominio C-terminale.

L’attivazione del tetramero è dovuta alla fosforilazione, in particolare sulle Ser

15, 20 e 37 del dominio di transattivazione. Queste sono fosforilate dalle 78

chinasi ATR e ATM (Ser 15), che attiva a sua volta la chinasi Chk2 (Ser 17),

attivate in risposta al danno del DNA, e la chinasi DNA-PK, coinvolta nella

riparazione del danno al DNA.

In cellule sane l’omeostasi cellulare è mantenuta dall’equilibrio tra biosintesi e

degradazione di p53. Quest’ultima è promossa dall’ubiquitazione dei residui di

Lys del dominio C-terminale della proteina ad opera dell’attività E3 ubiquitina

ligasica della proteina MDM2, la cui trascrizione è a sua volta regolato da p53.

deadly association

Si parla di , in quanto p53 promuove la trascrizione di MDM2,

che legandosi al suo dominio di trans-attivazione ne determina la degradazione.

È stato ipotizzato che l’ubiquitinazione di p53 determini l’esposizione della

sequenza NES (esportazione nucleare) nella regione C-terminale di p53,

consentendo la sua esportazione nel citoplasma e conseguente degradazione nel

proteosoma. L’attività E3 ubiquitina ligasica di MDM2 è inibita dal legame

diretto con p14ARF, la cui espressione è indotta dal fattore trascrizionale E2F.

Inoltre, p14ARF lega la chinasi INK4 e il dimero risultando agisce in

coordinazione con p53, inibendo i complessi ciclina-CDK.

L’attivazione di p53 è dipendente dai segnali di stress, che inducono

l’attivazione delle chinasi, che fosforilano il dominio trans-attivante

dell’oncosoppressore e determinano l’attivazione di altri pathways volti a

stabilizzare p53. In particolare, molti agenti danneggianti il DNA determinano

una down-regolazione di MDM2.

La principale funzione da oncosoppressore di p53 consiste nell’arresto del ciclo

cellulare e nell’induzione dell’apoptosi. Inoltre, essa gioca un ruolo diretto nella

riparazione del danno al DNA, nei meccanismi di riparazione per escissione di

nucleotidi e per escissione di basi ed, infine, è in grado di inibire l’angiogenesi

nei tumori, mediante l’attivazione o la repressione dei geni che regolano la

formazione di nuovi vasi sanguigni.

Arresto del ciclo cellulare: p53 agisce da fattore trascrizionale attivando la

trascrizione dell’inibitori della chinasi ciclina-dipendente p21CIP1, che induce

l’arresto del ciclo sia in fase G1 che in fase G2, impedendo la fosforilazione di

Rb, con conseguente non attivazione del fattore di trascrizione E2F. Inoltre

p53 determina la trascrizione di altri geni che determinano l’arresto del ciclo

cellulare in fase G2, come le proteine 14-3-3 sigma, GADD45 e Reprimo.

Induzione dell’apoptosi: p53 promuove la trascrizione di numerosi geni pro-

apoptotici, tra cui il gene Bax, Bak, Noxa, p53AIP1 e PUMA, i cui prodotti

proteici legandosi alla membrana del mitocondrio ne alterano il potenziale di

membrana, promuovono il rilascio del citocromo c, con conseguente attivazione

della cascata apoptotica della caspasi 9. Nella perturbazione dell’integrità del

redox-

mitocondrio sono coinvolti anche geni codificanti per gli enzimi

controlling , la cui trascrizione è sempre p53-indotta. Studi recenti, inoltre,

hanno dimostrato che p53 stessa lega può localizzare sul mitocondrio, dove

induce l’attivazione di un meccanismo trascrizione-indipendente che induce 79

enabler

l’apoptosi, agendo sia come , interagendo con proteine pro-apoptiche

activator

(Bcl2) e rilasciando Bax e Bak, che come , legando e attivando

direttamente Bax e Bak. Infine p53 up-regola l’espressione dei recettori di

morte FAS e DR5/killer e del ligando FASL. In particolare, p53 promuove la

trascrizione di DR5, legando il suo promotore, mentre aumenta l’espressione in

superficie di FAS, promuovendo il suo trasporto dal Golgi alla membrana.

Il legame FAS-FASL determina l’attiva dei domini di morte FADD nel recettore FAS.

Questi reclutano e attivano la caspasi 8, che attiva la caspasi 3, che tagliando l’inibitore

di CAD, consente l’ingresso di quest’ultima nel nucleo, dove essendo un’endonucleasi,

determina taglio del DNA. Contemporaneamente, la caspasi 8 taglia il fattore pro-

apoptotico BID, che recluta Bax, con cui si lega al mitocondrio, inducendo il rilascio del

citocromo c, con conseguente attivazione della caspasi9, attraverso l’interazione con

l’adattatore APAF1

La scelta tra arresto del ciclo cellulare e apoptosi dipende sia da fattori

indipendenti all’attività di p53, come la presenza di fattori di sopravvivenza

extracellulari o la presenza di alterazioni oncogeniche, che dall’attività di p53

stessa. In particolare, il tipo e il grado di stress cellulare regolano sia l’attività

che la concentrazione di p53 attiva. L’induzione dell’apoptosi è associata a livelli

più alti di p53, suggerendo che i promotori dei geni coinvolti in questo pathway

presentano una minor affinità di legame con p53 rispetto a quelli coinvolti

nell’arresto del ciclo cellulare. In alternativa, l’affinità di p53 per i propri

targets potrebbe essere regolata da cambiamenti conformazionali, dovuti anche

alla fosforilazione. Per esempio la fosforilazione della Ser46 è necessaria per

l’induzione della trascrizione del gene apoptotico p53AIP1 . l’inibizione, invece,

della chinasi responsabile della fosforilazione di tale residui, da parte di una

fosfatasi p53-indotta, inibisce la capacità di p53 di attivare la risposta

apoptotica.

Riparazione del DNA: il C-terminale di p53 lega direttamente differenti

forme di danno al DNA, come i singoli filamenti di DNA, le estremità dovute a

rotture a doppio filamento e le protuberanze dovute all’inserzione o delezione

di mismatches. Inoltre alcune attività biochimiche dell’oncosoppressore, come

l’allineamento del DNA e l’attività esonucleasica 3’-5’ possono giocare un ruolo

nelle funzioni di riparazione del DNA, in particolare nei meccanismi di

riparazione per escissione di basi e nucleotidi.

Infine, alcuni geni target di p53 sono coinvolti nella riparazione del danno al

proliferating cell nuclear antigen

DNA, come GADD45, che lega il PCNA ( ) e

che potrebbe inibire la replicazione del genoma, permettendo ai meccanismi di

riparazione di agire.

Mutazioni di questo gene sono correlate a numerose forme tumorali, tra cui vi è

la Sindrome di Li-Fraumeni, dovuta a mutazioni nella linea germinale, che 80

inattivano p53 e caratterizzata da una predisposizione allo sviluppo di

carcinomi. Le mutazioni riscontrate finora nelle neoplasie sono per lo più

binding

mutazioni missenso, che colpiscono preferenzialmente il dominio di .

Infine, la correlazione fra mutazioni di p53 e cancro è ben esemplificata

dall’azione di tre cancerogeni noti:

La micotossina Aflatossina b, prodotta dagli ascomiceti o da muffe,

determina mutazioni nel codone codificante la Ser249 (AGG AGT) di p53.

Tale mutazione è osservata in cellule di epatocarcinoma.

Il Benzopirene, presente nel fumo di tabacco causa mutazioni nei codoni 157

(trasversione G-T: GTC TTC), 248 e 273 di p53, producendo il diolo

espossido che lega la molecola di DNA. Tali mutazioni dell’oncogene sono

tipiche delle cellule dei carcinomi polmonari.

L’esposizione alla luce solare (raggi UV) causa mutazioni CC TT in p53,

correlate alla formazione di melanomi.

Tutte le mutazioni degli oncosoppressori associate all’insorgenza tumorale sono

loss of function

mutazioni recessive. La degli oncosoppressori può dipendere, oltre

che dalla perdita di materiale genetico, anche da aploinsufficenza, che si verifica

quando una sola copia del gene non è sufficiente a svolgere la funzione

dell’oncosoppressore in modo corretto, dalla presenza di un allele ipomorfo (incapaci di

svolgere da soli la propria funzione), per cui in condizioni di eterozigosi

l’oncosoppressore svolge in modo inadeguato la propria funzione, oppure dal fatto che

la proteina mutata interferisce con l’oncosoppressore non mutato, limitandone la

funzione (dominante negativo, come p53). Inoltre, l’inadeguata funzionalità di questi

geni può essere dovuta a inibizione della loro espressione per modifiche dei profili di 81

metilazione e per regolazione della traduzione da parte dei miRNAs (modello continuo

per la soppressione tumorale).

loss of function

Quindi, i meccanismi di degli oncosoppressori sono sufficienti a

determinare lo sviluppo tumorale, anche in assenza di una condizione di omozigosi,

two hit

come affermato dal modello , attraverso quella che viene oggi definita perdita

dell’eterozigosi.

La prima descrizione del ciclo cellulare risale al 1882, quando Flemming descrisse il

processo di divisione cellulare preceduto dalla condensazione dei cromosomi,

chiamandolo mitosi. Poiché nella restante parte del ciclo le cellule non sembravano

attive il periodo fra due mitosi successive fu definito interfase.

Oggi, il ciclo cellulare viene diviso in quattro fasi distinte: G1, S, G2 e M. un tipico

ciclo cellulare dura in media 24 ore nei fibroblasti

e nella fase G1, che dura in media 11 ore, la cellula

è metabolicamente attiva e aumenta le sue

dimensioni. Nella fase S, che dura in media 8 ore,

avviene la replicazione del DNA, mentre durante

la fase G2, di circa 4 ore, la cellula sintetizza le

proteine necessarie ad affrontare la fase M, in

cui avviene la mitosi (circa 1 ora) e si ha la

divisione della cellula madre in cellule figlie.

Tutti gli eventi del ciclo cellulare devono essere

accuratamente regolati e coordinati, per questo la progressione del ciclo dipende da

una serie di checkpoint, che controllano il passaggio tra una fase e la successiva e in

cui intervengono una serie di fattori, di cui il primo è stato identificato negli anni ’70.

Masui e colleghi, infatti, in quegli anni identificarono il cosiddetto “fattore che

promuove la maturazione”, MPF, capace di stimolare la meiosi di oociti di rana in fase

G0 (iniezione di citoplasma di oociti di rana stimolati

con progesterone in oociti in G0). Negli stessi anni,

Hartwell osservò che mutanti condizionali sensibili

S. cerevisiae

alla temperatura di arrestavano il loro

ciclo in punti specifichi e identificò un mutante che

arrestava il ciclo in un punto , definito start, per il

superamento del quale era necessaria la proteina 82

S. pombe

Cdc28. Esperimenti analoghi furono condotti su , in cui mutanti per Cdc2, un

omologo di Cdc28, si bloccavano in fase G e fra la fase G2 e M. Negli anni ’80 Hunt e

colleghi dimostrarono in embrioni di riccio di mare che l’ingresso i fase M richiede la

cicline

sintesi di alcune proteine che mostravano un andamento ciclico, chiamate , che

si accumulavano in interfase e venivano degradate alla fine della mitosi.

Nel 1988 l’MPF viene purificato da uova di rana, dimostrando che esso consisteva di

due subunità, un ciclina (ciclina B) e una chinasi (Cdk 1).

Oggi sappiamo che il ciclo cellulare degli eucarioti è regolato da numerosi complessi

ciclina-Cdk , in cui il legame della ciclina determina l’attività della chinasi. In realtà,

l’attività delle Cdk è regolata a diversi livelli: Nell’uomo 16 cicline, struttura

Associazione con le cicline e loro degradazione; composta da 5 α-eliche e PM

Fosforilazione del residuo di Thr160 delle Cdk ad opera compreso fra 30 e 90KDa.

di CAK (chinasi attivante Cdk), costituita da Cdk7-ciclina H;

Fosforilazione inibitrice di Tyr15 ad opera di Wee e di Thr14 ad opera di Myt1.

L’attivazione dipende dall’azione di defosforilasi, in particolare Cdc25a in G1 e

Cdc25b, c in G2;

Legame di proteine inibitorie, dette CKI, appartenenti alle famiglie Ink4 e Cip/Kip.

Le prime comprendono diversi membri (p15, p16, p18 e p19) e bloccano il passaggio

in fase S, legando i monomeri di Cdk4/6, mentre le seconde (p21, p27, p57)

inibiscono l’attività chinasica (talvolta hanno funzione attivatrice).

Queste ultime fosforilano una serie di fattori necessari per la progressione del ciclo

cellulare.

È importante ricordare che ogni transizione da una fase alla successiva è regolato da

specifici complessi ciclina-CDK. In particolare, la transizione G1 S è regolata

inizialmente da complessi Cdk 4/6 associati a cicline D (nei mammiferi D1, D2 e D3) e

in seguito dai complessi Cdk2-cicline E (E1 e E2). Nella fase S sono attivi i complessi

Cdk2-ciclina A, mentre la transizione G2 M è regolata dai complessi Cdk1-ciclina B1.

restriction point

Le cellule in fase G1 sono soggette ad un “ ”, che consente la

progressione del ciclo cellulare solo se sono presenti gli adeguati stimoli ambientali 83

committed)

(fattori di crescita, mitogeni), destinando la cellula alla replicazione ( . Le

restriction point pocket proteins

proteine che agiscono nel sono le cosiddette (Rb,

p107 e p130)e la famiglia dei fattori di trascrizione E2F (10 nei mammiferi), che si

associano con i fattori DP 1 e 2.

Quando nell’ambiente sono presenti mitogeni,

questi legano i propri recettori tironi-chinasici, che

a loro volta attivano la cascata delle MAPchinasi

(Ras Raf Mek Erk), che determina

un’aumentata stabilità e trascrizione (attivata da

Fos e Jun) della ciclina D. Quest’ultima lega e

attiva Cdk4/6. Giunti nel nucleo, trasportati da

p21, i complessi ciclinaD-Cdk4/6 fosforilano Rb,

determinando il rilascio dei fattori E2F, che

determinano la trascrizione di diversi geni, tra cui

quelli delle cicline E, cicline A, Cdc52a, che

defosforila attivando Cdk2 e Emi1. Quest’ultima

inibisce l’attiva del complesso APC associato a Cdh1

(suo attivatore come Cdc20, attivo nella fase M),

che tramite la sua attività ubiquitina-ligasica

conferisce ciclicità al processo, inibendo le Cdk.

Inoltre, il complesso ciclinaD-Cdk4/6 recluta p27, determinando il rilascio della Cdk2,

che può legarsi alla ciclinaE, formando il complesso Cdk2-cilinaE. Questi fosforilano

ulteriormente Rb e i complessi Cdk2-cilinaA, che mediano la progressione in fase S.

Il ciclo cellulare viene, invece, arrestato in fase G1 quando si ha danno al genoma, al

fine di impedire agli errori presenti di fissarsi nella progenie cellulare. Il danno al

genoma viene rilevato da sensori del danno, rappresentati dalle chinasi ATM e ATR,

reclutate da hRad e hHus a livello del DNA. ATM riconosce rotture a doppio

filamento, mentre ATR riconosce danni a singolo filamento, una volta attivate, queste

chinasi fosforilano le chinasi del checkpoint, Chk2 e Chk1, rispettivamente, e sia

direttamente che indirettamente, attraverso Chk1, fosforilano la Ser20 e la Ser15 di

p53, che, attivata, stimola la trascrizione dei propri geni target, tra cui p21, che lega i

complessi cilinaE-Cdk2, arrestando il ciclo cellulare. Inoltre, p53 determina la

trascrizione di GADD45, che

stimola la riparazione del danno

al DNA, legando la PCNA. Se,

invece, il danno al genoma è

esteso p53 induce la morte per

apoptosi della cellule. Infine, la

Chk2 fosforila la Cdc25a,

determinandone la degradazione

ubiquitina dipendente. 84

Per preservare l’integrità del genoma ciascuna origine di replicazione (una per ogni

replicone, che nel genoma degli eucarioti sono migliaia) deve necessariamente

accendersi una sola volta per ciclo. Ciascuna origine di replicazione lega durante tutto

il ciclo cellulare un complesso multiproteico, definito complesso di riconoscimento

dell’origine (ORC), cha agisce come una piattaforma sulla quale si assemblano i fattori

pre-replication complex

proteici, con cui forma il , che da inizio alla replicazione del

genoma. Durante la fase G1 sono reclutati sull’ORC i fattori Cdc6 e Cdt1 (cofattore di

Cdc6), che collaborando con Cdc7p e Dbf4p reclutano il complesso di proteine MCM.

Le proteine MCM 2-7 sono

necessarie per la replicazione

del DNA e formano un

complesso esamerico, che si

pensa sia necessario per

impedire che avvenga più di

replicazione per origine di

replicazione. I complessi

Cdk2-ciclinaA fosforilano le

proteine MCM2-7 e Cdc6,

inducendo un cambiamento

conformazionale, che provoca

il rilascio di Cdt1, che viene degradato. Sono, quindi, reclutate Cdc45 e RPA, che

promuovono l’attività elicasica delle MCM e richiamano la DNA polimerasi α-primasi.

La formazione del complesso di pre-replicazione è garantita dalla degradazione

ubiquitina-dipendente della Geminina ad opera del complesso APC/C. Infatti, tale

proteine sequestra Cdt1 in un complesso inattivo, impedendo la sua interazione con il

complesso MCM2-7 e, quindi, inibendo la replicazione del genoma.

contemporaneamente la sua presenza in tutto il ciclo cellulare impedisce che le

proteine MCM siano caricate sul DNA in momenti differenti dalla fase S.

[Esperimenti di fusione cellulare hanno dimostrato la presenza di un fattore di promozione della fase S,

SPF. Infatti, cellule sincronizzate in differenti stadi del ciclo cellulare sono state fuse per ottenere

cellule con due nuclei. Se la fusione avveniva tra una cellula in fase S e una in fase G1, il nucleo in G1 era

indotto ad entrare in fase S prima del previsto]. 85

Alla fine della fase S inizia ad essere sintetizzata la ciclina B1, che si associa alla

Cdk1. Il complesso è attivato dalla fosforilazione nel nucleo della Tyr15 da parte della

chinasi Wee e della Thr161 da parte della CAK e nel citosol della Thr14 da parte di

Myt1 (il complesso fa la spola tra nucleo e citoplasma). Contemporaneamente, la

chinasi Polo attiva mediante fosforilazione Cdc25c, che si accumula nel nucleo, dove

promuove la rimozione dei gruppi fosfato inibitori dal complesso Cdk1-ciclinaB1. Il

complesso ora attivato promuove l’entrata in fase M, in particolare, consente la

condensazione cromatinica, attraverso la fosforilazione delle condensine (proteine

coinvolte nella condensazione dei cromosomi), rottura dell’involucro nucleare,

frammentazione

dell’apparato del Golgi

e formazione del fuso

mitotico.

Alla fine della fase G2

è presente un ulteriore

checkpoint, volto

all’identificazione di

eventuali danni o

mutazioni del genoma in

seguito alla

replicazione. Come nel

checkpoint in G1, la

presenza di un danno al

DNA determina

l’attivazione di hRad e hHus (Rad9-Rad1-Hus1) che attivano le chinasi ATM e ATR, che

fosforilano le chinasi del checkpoint, Chk2 e Chk1, rispettivamente, e sia

direttamente che indirettamente, fosforilano la Ser20 e la Ser15 di p53, che,

attivata, stimola la trascrizione dei propri geni target, tra cui p21 e la proteina 14-3-3

sigma. Contemporaneamente la Chk1 fosforila la Ser216 di Cdc25c, creando un sito di

legame per 14-3-3 sigma che la sequestra nel citoplasma. Inoltre, la 14-3-3 sigma lega

anche il complesso ciclinaB1-Cdk1, impedendone il trasporto nel nucleo. Questi eventi

determinano, quindi, l’arresto del ciclo cellulare in G2. 86

La fase M corrisponde alla mitosi cellulare e l’evento chiave che interviene nel

controllo di questa fase è il complesso APC/C, che forma un complesso con Cdc20, che

degrada la ciclina B e la Securina, permettendo il passaggio metafase-anafase.

Infatti, affinché avvenga la segregazione dei cromatidi fratelli è necessario che le

coesine (complesso costituito da SMC1/3 SCC1/3), che li tengono uniti a livello del

centromero, siano tagliate dall’endopeptidasi Separasi, che è inattivata dal legame con

la Securina.

Durante la profase , infine, si verifica il cosiddetto checkpoint del fuso mitotico,

attivato dai cinetocori che mancano di legami ai microtubuli e dalla mancanza di

tensione nel fuso, volto alla correzione dei possibili errori, come il legame di entrambi

i cromatidi fratelli allo stesso polo del fuso mitotico oppure il legame di un singolo

cinetocore ad entrambi i poli. Questo checkpoint è dominato dall’azione delle chinasi

AURORA A, B e C. In particolare, AURORA A partecipa alla strutturazione dei

centromeri, stabilizzandoli e garantendo il loro legame alle fibre del fuso mitotico;

AURORA B, invece, garantisce il corretto assemblaggio dei centromeri con le fibre

del fuso mitotico, mentre AURORA C garantisce la segregazione dei cromatidi

fratelli, agendo come coordinatore dell’evento.

La proteina AURORA B, inoltre, reclutano Mad2, Bub3 e BubR1, che si attivano

legandosi a CENP-E (proteina del centromero), e formano un complesso, che fosforila

Cdc20, con conseguente inibizione dell’attività del Complesso APC/C, incapace di

degradare la Securina ( no segregazione cromatidi fratelli). 87

Errori in ciascuno dei checkpoint del ciclo cellulare possono condurre a

trasformazione cellulare. I difetti più comuni nelle cellule tumorali sono:

Mutazioni nel gene Rb o dei geni coinvolti nell’attivazione di E2F, con conseguente

superamento del restriction point in G1 anche in assenza di stimoli di proliferazione

esterni.

Mutazioni nei recettori per mitogeni o fattori di crescita, che risultano attivi anche

in assenza del loro ligando.

Mutazioni negli inibitori delle Cdk.

Mutazioni in p53, che consente il superamento dei checkpoint da danno al DNA.

Mutazioni delle chinasi Aurora, in particolare Aurora B e C, con possibile aneuplodia

utilizzo di Ab anti-Aurora impediscono la progressione della mitosi.

Gli studi sulla riparazione dei danni al DNA sono iniziati circa 40 anni fa. Al giorno

d’oggi la maggior parte delle informazioni sui meccanismi di riparazione sull’uomo si

sono ottenute dallo studio di sindromi genetiche autosomiche e recessive, in cui i geni

mutati sono coinvolti nei processi di riparazione, di cui la maggior parte è associata ad

un elevato rischio di sviluppare neoplasie (no sindrome di Cockayne, caratterizzata

dall'anomalo sviluppo del sistema nervoso, da grave fotosensibilità e dal prematuro

invecchiamento cellulare).

In generale, una volta che il danno al genoma è stato identificato si possono istaurare

error-prone error-free

due tipologie di meccanismi: i meccanismi e i meccanismi . I

primi sono meccanismi di tolleranza, messi in atto quando il danno presente non

interferisce con la replicazione e la trascrizione del DNA, che non rimuovono e

correggono il danno, ma lo bypassando spiazzando la DNA polimerasi “canonica” con

DNA polimerasi inclini all’errore. I meccanismi error-free, invece, sono i meccanismi

di riparazione propriamente detti, che ripristinano la corretta sequenza del DNA, in

modo da non trasmettere il danno alla progenie cellulare.

È importante ricordare che alcuni danni possono essere rimossi direttamente per

reversione della modificazione chimica che li ha generati. Questo si verifica per la 88

correzione dei dimeri di pirimidine (CPD), danno indotto dalla radiazioni UV,

attraverso fotoriattivazione (no nei mammiferi placentati), e per i danni dovuti ad

agenti alchilanti a livello delle guanine attraverso la transmetilazione.

I dimeri di pirimidina possono fotorevertire spontaneamente a lunghezze d’onda

comprese tra i 200 e i 300nm o essere monomerizzati ad opera della DNA fotoliasi,

che si lega al dimero e, in presenza di energia luminosa di lunghezza d’onda compresa

tra i 200 e i 300nm, catalizza una reazione che rompe l’anello di ciclobutano, che

unisce le due pirimidine.

Tutte le fotoliasi identificate negli eucarioti sono associate a due cromofori il

FADH2 e una pterina o una deazaflavina, che definiscono lo spettro di lunghezza

d’onda a cui agisce l’enzima. In particolare, la DNA fotoliasi lega il DNA, interagendo

con circa 6-7 dNTP, anche al buio e quando la luce colpisce la pterina (o deazaflavina),

questa la assorbe, si eccita e trasferisce l’energia al FADH2, che eccitandosi, a sua

volta, cede un elettrone al dimero. L’anione dimero formato è instabile e monomerizza,

rompendo l’anello del ciclobutano.

Nel genoma umano sono stati identificati due geni con sequenza simile a quella delle fotoliasi, detti

geni Cry, che codificano per fotorecettori coinvolti nel controllo dei ritmi circadiani.

6

La transmetilazione, invece, è un processo che rimuove l’O -metilG, lesione altamente

citotossica e mutagena, indotta dall’esposizione a cancerogeni metilanti e a farmaci

chemioterapici. Tale base modificata, infatti, è in grado di appaiarsi sia con la timina

che con la citosina e, se non rimossa, da origine durante la replicazione transizioni

6

G:C A:T. Nell’uomo la transmetilazione è catalizzata dalla O -metilguanina-DNA

metiltrasferasi (MGMT), che trasferisce il gruppo metilico dalla base azotata ad un

residuo di Cys sull’enzima stesso e durante tale reazione si inattiva (enzima suicida). 89


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106

PESO

4.82 MB

AUTORE

BioD

PUBBLICATO

+1 anno fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in biologia per la ricerca molecolare, cellulare e fisiopatologica
SSD:
A.A.: 2017-2018

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher BioD di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Genetica degli eucarioti superiori e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Roma Tre - Uniroma3 o del prof Cozzi Renata.

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