Riassunto esame Genetica degli eucarioti superiori, Prof.ssa R. Cozzi, libro consigliato Introduzione alla genomica, Zanichelli

Il genoma

Genomica strutturale

La genomica è lo studio dei genomi nella loro complessità e si sovrappone e amplifica i concetti della genetica. La genomica può essere suddivisa in tre settori:

Mappe genetiche e cromosomiche

Uno dei primi passaggi nella caratterizzazione di un genoma consiste nella preparazione di mappe genetiche, cromosomiche e fisiche dei suoi cromosomi. Queste mappe forniscono indicazioni riguardo alla localizzazione relativa dei geni, dei marcatori molecolari e dei segmenti spesso essenziali per poter posizionare le porzioni cromosomiche e allineare i tratti sequenziati di DNA in una sequenza genomica completa.

Mappe genetiche (a bassa definizione): forniscono con un’approssimazione grossolana la localizzazione dei geni in relazione alla posizione di altri geni noti.

• Linkare con geni noti individui eterozigoti per due o più loci genetici vengono incrociati ed esaminando la progenie, si determina la frequenza di ricombinazione tra i loci: se la frequenza di ricombinazione tra due loci è pari al 50% allora i loci sono disposti su due cromosomi diversi o si trovano sullo stesso cromosoma ma sono molto lontani. Se la frequenza di ricombinazione è < del 50%; loci si trovano nello stesso cromosoma (per i geni associati il tasso di ricombinazione è proporzionale alla loro distanza fisica). Sulla mappa genetica le distanze sono misurate con % di ricombinazione o unità di mappa. I dati derivati da incroci multipli a due o tre punti possono essere integrati su mappe di associazione per interi cromosomi.
• Ibridi somatici uomo-roditore: se due colture di cellule in sospensione di topo e di uomo sono mescolate in presenza di virus inattivati dagli UV, i virus mediano la fusione tra cellule delle due diverse specie. Dopo la fusione delle cellule si fondono anche i nuclei formando una linea cellulare mononucleata che contiene un assetto cromosomico di origine umana e uno di origine minima (i cromosomi di topo e uomo sono morfologicamente diversi e quindi distinguibili). Nel corso delle divisioni cellulari successive, la cellula ibrida gradualmente elimina con un processo casuale, i cromosomi umani. La linea di cellule di topo usata è mutante ad una specifica funzione biochimica; quindi affinché le cellule possano crescere, la funzione mancante deve essere fornita dal genoma umano. I cromosomi umani negli ibridi possono variare per numero e tipo ma comprendono sempre il cromosoma umano portatore dell’allele selvatico del gene che è difettivo nel genoma di topo.

Mappe cromosomiche e fisiche

Mappe cromosomiche: (ad alta risoluzione) determinano la posizione cromosomica di un gene o di un marcatore molecolare.

Ibridazione in situ: se si ha a disposizione un gene clonato, esso può essere usato per costruire una sonda marcata da utilizzare per l’ibridazione in situ, cioè direttamente sui cromosomi. Se i singoli cromosomi che compongono un corredo genomico sono riconoscibili in base al loro quadro di bande, alla grandezza, al rapporto tra bracci, allora il nuovo gene può essere assegnato al cromosoma con cui ibrida. L’ibridazione inoltre rivela la posizione approssimativa dei loci sul cromosoma. I tipi più comuni di marcatura delle sonde consistono nella radioattività e nella fluorescenza. Nella FISH il clone viene marcato con una sostanza fluorescente, quindi una preparazione di cromosomi parzialmente denaturati viene immersa nella soluzione con la sonda. La sonda si lega direttamente sui cromosomi e la posizione del frammento clonato è svelato da una chiazza di vivida luce fluorescente.

Chromosome painting: un insieme di frammenti di DNA clonati di cui si conosce il cromosoma di provenienza, vengono marcati con sostanze fluorescenti diverse. Queste sostanze colorano le regioni specifiche identificandoli al momento dell’osservazione al microscopio. Se il clone di un gene a localizzazione sconosciuta viene trattato con una sostanza fluorescente ancora diversa sarà possibile individuarne la posizione nell’insieme dei cromosomi colorati.

Mappa fisica dei genomi: manipolazione diretta dei frammenti di DNA clonati che si sovrappongono e che nel loro insieme rappresentano un intero cromosoma o addirittura l’intero genoma.

Uso delle mappe genomiche

Le mappe genomiche e quelle fisiche costituiscono un punto di partenza importante per vari tipi di analisi genetica tra cui l’isolamento di geni e la genomica funzionale.

Bioinformatica è un settore emergente che unisce la biologia molecolare e l’informatica allo scopo di sviluppare banche dati, algoritmi di ricerca al computer, programmi informatici di previsione del gene e altri strumenti analitici utilizzati per decifrare i dati di sequenza ricavati dal DNA, dall’RNA ed alle proteine.

Genomica funzionale

La genomica funzionale caratterizza la funzione delle sequenze individuate dalla genomica strutturale e consiste nello scandagliare le sequenze genomiche nel definire i geni, riconoscere l’organizzazione e comprenderne la funzione. Gli obiettivi principali sono l’identificazione di tutte le molecole di RNA trascritte a partire da un genoma e di tutte le proteine codificate dal genoma. La ricerca della funzione delle sequenze di DNA si avvale sia della bioinformatica sia degli approcci sperimentali di laboratorio.

Ricerche di omologia: un metodo di analisi mirato a determinare la funzione genica è quello di condurre una ricerca di omologia che si basa sul confronto tra le sequenze di DNA e delle proteine di uno stesso organismo e di forme di vita differenti.

Geni omologhi: geni correlati dal punto di vista evolutivo.

• OrtoLoghi: geni omologhi appartenenti a specie differenti che si sono evoluti a partire dal medesimo gene presente in un antenato comune.
• Paraloghi: geni omologhi presenti dello stesso organismo, derivati dalla duplicazione di un unico gene avvenuta nel passato evolutivo.

I geni omologhi hanno spesso la funzione identica o correlata: per questo motivo quando a un gene stato assegnata una particolare funzione essa può fornire indizi circa quello dei suoi omologhi. Per gli studi di omologia sono disponibili banche dati contenenti geni e proteine di una vasta gamma di organismi e sono stati sviluppati potenti programmi per ricercare particolari sequenze. Se un genetista sequenzia un genoma e localizza un gene che codifica una proteina priva di funzione conosciuta, una ricerca di omologia condotta su una banca dati con sequenze proteiche o del DNA di altri organismi può consentire di identificare una o più sequenze ortologhe. Se a una di queste sequenze corrisponde una proteina a funzione nota, tale funzione può fornire informazioni sul ruolo della nuova proteina scoperta dal genetista.

Il genoma umano contiene circa 32.000 geni, il numero di proteine è però nettamente superiore. Mediante splicing alternativo un singolo gene può codificare per due o più proteine complesse che contengono frequentemente delle regioni contraddistinte da forme o funzioni specifiche definiti domini proteici: ogni particolare dominio proteico possiede una tipica disposizione di aminoacidi. È verosimile che nel corso dell'evoluzione un numero limitato anche se ampio di domini proteici si sia combinato e appaiato per dare origine a una vasta gamma di proteine che si osservano negli organismi attuali.

Genomica comparativa

La genomica comparativa pone a confronto il contenuto genico, la funzione e l’organizzazione dei genomi di organismi differenti. I progetti di sequenziamento genomico forniscono informazioni dettagliate circa il contenuto dell'organizzazione genica di specie differenti e anche di membri diversi della stessa specie: tali dati consentono di fare deduzioni riguardo alla funzione di geni e all'evoluzione dei genomi. Questi progetti costituiscono una fonte di indizi importanti anche dal punto di vista delle relazioni evolutive tra gli organismi e dei fattori che influenzano la velocità e la direzione dell'evoluzione.

Genomi eucaristici: non esiste una stretta relazione tra l'ampiezza del genoma e la complessità. Negli organismi pluricellulari il numero di geni non sembra correlato in modo palese alla complessità genotipica: l'uomo ha più geni degli invertebrati ma solo il doppio rispetto alla Drosophila e solo pochi di più rispetto ad Arabidopsis.

Genoma umano

Il genoma umano: 3,4 miliardi di coppie di basi di cui solo il 25% è trascritto in un RNA e meno del 2% codifica proteine. I geni attivi sono separati da vaste regioni di DNA non codificante di cui gran parte è costituita da sequenze ripetute derivate da elementi trasponibili.

DNA eucariotico: geni in copia singola (funzionale) DNA ripetitivo DNA spaziatore.

Sequenze funzionali: sequenze prive di una funzione nota.

• Famiglie di geni codificanti sequenze funzionali ripetizioni dell’ ripetizioni sequenze E di pseudo geni correlati non codificanti eterocromatina tandem trasposte.

Sequenze ripetitive funzionali codificanti

Famiglie di geni dispersi: molti geni che codificano per proteine appartenenti a famiglie di geni correlati dispersi in tutto il genoma. Le sequenze dei geni che appartengono alla stessa famiglia possono divergere; in seguito alla divergenza delle sequenze i geni omologhi possono arrivare ad assumere funzioni differenti. Alcuni geni nell'ambito di varie famiglie sono divenuti non funzionali dando origine a pseudogeni non trascritti.

Famiglie geniche ripetute in tandem: i prodotti di alcuni geni sono usati dalle cellule in elevata quantità; spesso questi geni si sono evoluti a formare delle famiglie di ripetizioni in tandem (esempio: organizzatore nucleare, sito che contiene ripetizioni in tandem di geni per rRNA).

Sequenze funzionali non codificanti

I telomeri che contengono serie di ripetizioni in tandem di semplici sequenze di DNA che pur non codificando per un RNA o per una proteina svolgono una funzione ben definita. Il filamento copia nella replicazione del DNA, una volta raggiunta l'estremità, arriva ad un punto in cui il suo innesco ad RNA non può funzionare per cui resterebbe una regione non polimerizzata, portando come risultato finale all'accorciamento della lunghezza complessiva del cromosoma; ma un enzima specifico, la telomerasi, addiziona agli estremi le semplici unità ripetitive.

Sequenze prive di funzione nota

Sono sequenze di DNA presenti in molte copie nel genoma:

• DNA altamente ripetitivo fiancheggiante il centromero: quando il DNA genomico viene centrifugato in gradiente di densità di cloruro di cesio, spesso è visibile una banda satellite. Il DNA satellite si rivela composto da molteplici copie di ripetizioni in tandem di brevi sequenze nucleotidiche la cui lunghezza può arrivare a centinaia di kb.
• VNTR (ripetizioni in tandem a numero variabile): sequenze lunghe da 1 a 5 kb che consistono in un numero variabile di ripetizioni di una stessa unità composta da 15 - 100 nucleotidi. Poiché il numero di ripetizioni varia da persona a persona l'insieme dei frammenti che appare in autoradiografia in un Southern blot fingerprint è altamente individuale (del DNA).
• Microsatelliti: regioni disperse composte da un numero variabile di ripetizioni in tandem di sequenze nucleotidiche. Utile per la costruzione di marcatori molecolari usati per mappare il genoma.

Sequenze trasposte: elementi ripetitivi che si sono introdotti e propagati nel genoma producendo copie di se stessi in grado di spostarsi in nuove localizzazioni (trasposoni, retrotrasposoni che si propagano grazie alla trascrittasi inversa).

• LINE: (sequenze disperse lunghe) elementi di 1 - 5 kb di lunghezza presenti con 20.000 - 40.000 copie; sono elementi trasponibili.
• SINE: (sequenze disperse brevi)
• Pseudogeni: elementi moderatamente ripetuti originati da processi di trascrizione inversa (non contengono introni)

DNA spaziatore

È possibile che la sua unica funzione sia quella di separare i geni: gene umano medio 27.000 bp, 9 esoni.

Gli introni sono più estesi in numero maggiore rispetto agli altri genomi. Non codifica un numero maggiore di domini proteici ma si combinano in modo molto vario per produrre un proteoma differenziato.

Un singolo gene specifica per più proteine tramite splicing alternativo e ognuno di essi può codificare circa 203 mRNA diversi. Con 3200 geni può produrre fino a 96000 proteine.

La densità genica varia a seconda dei cromosomi: maggiore nel 17, 19, 22; minore nell’ X, Y, 4, 18, 13. La complessità non è data dal numero di geni ma dal loro riassortimento e dall'amplificazione.

Amplificazione genica

L’amplificazione genica è un processo che comporta “la selettiva e ripetuta replicazione di un determinato gene o di più geni senza che ci sia un incremento proporzionale in altri geni del genoma”. Questo fenomeno può essere visto come una strategia evolutiva adottata dagli organismi per far fronte all’eventuale perdita di un gene essenziale. Sulle sequenze amplificate può agire l’evoluzione e dare origine a geni i cui prodotti possono avere funzioni uguali, simili o differenti.

Esempi di proteine i cui geni si sono originati per amplificazione sono l’ -fetoproteina e la sieroalbumina. L’ -fetoproteina è una proteina sierica presente nei feti dei mammiferi, che viene sostituita alla nascita dalla sieroalbumina. Nei mammiferi i due geni sono associati sul braccio lungo del cromosoma 4. Entrambe le proteine sono costituite da tre domini molto simili fra loro, ciascuno codificato da quattro esoni. I due geni si sono originati per amplificazione e duplicazione di un gene ancestrale, seguite da leggere modificazioni successive, che hanno consentito l’espressione differenziale.

Drosophila melanogaster e amplificazione genica

In Drosophila melanogaster, durante il terzo stadio larvale, le ghiandole salivari iniziano a secernere un insieme di proteine, definite Sgs, che consentono alla pupa di aderire al substrato. I geni Sgs sono caratterizzati dalla ripetizione di 21 coppie di basi (7 aa), in cui il numero di ripetizioni è caratteristico del ceppo in esame.

Pertanto, l’amplificazione non agisce solamente su intere sequenze codificante, ma anche su piccole sequenze intergeniche. Gli eventi di amplificazione genica possono essere classificati in due categorie: amplificazione di tipo programmato e amplificazioni spontanee.

Amplificazione programmata è stata riportata per la prima volta negli oociti di Xenopus ed è un tipo molto raro di strategia regolatoria, di cui si conoscono pochi esempi, nessuno dei quali nei mammiferi. In D. melanogaster, per esempio, alcuni geni sono amplificati in tale modo per fornire a breve termine e in grande quantità le proteine necessarie alla formazione del corion (guscio dell’uovo). Nel genoma aploide dell’insetto i geni per e proteine corioniche, presenti sia nella linea germinale che nel genoma somatico, sono generalmente presenti in copia singola. Circa 18 ore prima che abbia inizio la sintesi delle proteine corioniche, i relativi geni nel genoma delle cellule follicolari vanno incontro ad eventi di amplificazione. Alcuni dei 20-50 geni corionici si trovano associati in due raggruppamenti: uno di 4 geni in tandem sul cromosoma 3 e uno di 6 geni sul cromosoma X. Questi due raggruppamenti sono quelli soggetti ad amplificazione e ciò è stato dimostrato stimolando la variazione del numero di copie con cui questi geni compaiono in insiemi di frammenti di restrizione, derivati da geni clonati. Ciascun gene clonato fu impiegato come sonda marcata in separati blotting di DNA genomico, preparati sia con il DNA embrionale che con quello delle cellule follicolari in seguito a digestione con endonucleasi. Il numero di copie relativo fu dedotto in base al rapporto tra la quantità radioattiva associata al DNA delle cellule follicolari e a quella associata al DNA embrionale. Questi esperimenti hanno dimostrato che il DNA del cromosoma X, ad esempio, viene amplificato di 15 volte nella regione in cui contiene i geni corionici.

L’amplificazione è dovuta ad una serie di cicli replicatici che si susseguono rapidamente, la cui origine di replicazione si trova nei pressi del raggruppamento dei geni di interesse (modello Replicazione a buccia di cipolla). La competenza a subire l’amplificazione dipende da brevi segmenti di DNA (< 5Kb), contenuti nella regioni dei geni corionici sui cromosomi 3 e X, definiti elementi di controllo dell’amplificazione.

Amplificazione spontanea, invece, è un fenomeno ampiamente diffuso, la cui scoperta è stata conseguente all’osservazione che trattando le cellule con inibitori, la cui azione è diretta specificatamente contro un singolo enzima essenziale, si provoca morte di tutte le cellule, eccezion fatta per cellule mutanti resistenti all’inibitore usato.