Riassunto esame Biologia Molecolare, Prof. Pellicioli, libro consigliato Biologia Molecolare, Amaldi

TRADUZIONE

Enzimi chiave: ribosomi. Coinvolge tutti e tre i tipi di RNA.

Man mano che le proteine ribosomiali (proteine per lo più grosse, quasi tutte basiche; si trovano

solo sulla superficie esterna dell’rRNA) sono prodotte vengono assemblate agli rRNA, i quali

costituiscono l’impalcatura del ribosoma stesso (hanno struttura universale in tutti i ribosmi) per

formare le due subunità dei ribosomi che continueranno la loro maturazione nel citoplasma. (per

molti non esiste sito E)

Le altre due tasche presenti sulla subunità maggiore vengono create dall’interazione tra le due

subunità. In particolare, una sequenza specifica del 16S riconosce una complementare presente su

mRNA. Mentre nella subunità minore sono presenti un solco di entrata e uno di uscita per l’mRNA.

Alcune mutazioni che colpiscono siti particolari dei RNA possono essere patologici (alcuni posso

mutare in siti di legame per proteine ribosomiali, altri responsabili delle interazioni tra gli rRNA, altri

in sequenze di legame con il mRNA).

Harry Noller e collaboratori dimostrano, contrariamente a quanto si pensava inizialmente che non

erano le riboproteine a svolgere la sintesi proteica ma l’rRNA. rRNA estratto sperimentalmente,

privo di proteine era in grado di sintetizzare legami peptidici, in quanto presenta un centro di

legame con la peptidiltransferasi; catalizzata dal dominio V dell’rRNA 23S. Reazione peptidil-

transferasica si occupa del trasferimento di amminoacidi sulla catena peptidica in allungamento.

Due eventi critici sono alla base dell’accuratezza della traduzione:

1)l’abbinamento aa-tRN; secondo un codice bilingue che abbina caratteristiche stereo-

chimiche dell’aminoacil-tRNA e l’amminoacido (paracodons)

2)l’abbinamento tRNA-aa con il messaggero; secondo il codice genetico classico (codon-anticodon

interactions).

Il processo di caricamento degli aa sui tRNA è caratterizzato da ammino-acil- tRNA sintetasi; sono in

totale 20. Catalizzano legame tra gruppo carbossilico del aa con gruppo -OH dell’adenina all’estremità

3’ del tRNA. Gli aa prima di essere legati al tRNA vengono adenilati; quando si legano al tRNA il

distacco dell’ADP produce l’energia necessaria per il legame. Per alcuni aa è più semplice per

l’enzima riconoscerlo mentre per altri aa risulta più complicato. Le sintasi escludono dal sito si

attivazione alcuni aa perché hanno forme o dimensioni diverse da quella corretta però alcuni aa sono

strutturalmente simili tra loro.

A volte il tRNA con l’aa scorretto interagisce con l’enzima, possono avvenire diversi tipi di

editing: in certi casi aa.-AMP prima di legarsi a tRNA passa in un sito di editing/correzione; se

l’aa è quello corretto reazione prosegue mentre se è errato aa-AMP va incontro ad idrolisi; se

non è presente tasca di editing l’appaiamento aa-AMP scorretto viene legato a un tRNA

sbagliato e quindi verrà riconosciuto dalla stessa sintesi che lo idrolizza.

Classe di antibiotici che comprendono la puromicina bloccano proprio la formazione del legame

peptidico, altri possono bloccare la dissociazione e l’uscita di particolari fattori. L’utilizzo di vari

antibiotici sono stati utili per capire il meccanismo della traduzione. Caso di resistenza all’antibiotico è

dovuta a mutazioni in rDNA.

Sia in eucarioti che procarioti un trascritto è legato simultaneamente da più ribosomi che scorrono

lungo di esso in direzione 5’-3’. Per le proteine ci sono 1 errore ogni 10mila pb. Gli mRNA dei

procarioti sono policistronici, ovvero posso catalizzare la traduzione di più geni

contemporaneamente.

Negli eucarioti non ci sono i cistroni e si ha una sola frame di lettura dell’mRNA, ogni mRNA corrisponde a

una sola proteina. I trascritti primari eucarioti e procarioti sono molto diversi strutturalmente quindi

anche il meccanismo di traduzione stesso.

Tendenzialmente quelli eucarioti non sono lineare ma ripiegati. Il cap e la coda vengono utilizzati

per tradurre perfettamente in messaggero e anche delle sequenze UTR contenenti info per la

traduzione; rappresentano forme di regolazione assenti dei batteri. Nella 5’UTR ci sono segnali che

inducono il messaggero ad assumere una struttura secondaria e delle sequenze IRES (non

codificanti) che vengono riconosciuti dai ribosomi come segnale che in zona sono presenti siti di

inizio della traduzione. Nei batteri subunità minore riconosce il sito di inizio AUG e si lega

direttamente, inducendo l’assemblaggio della subunità maggiore. Mentre negli eucarioti non vede

subito AUG ma il CAP, una volta legato a questo scorre per il filamento fino a trovare AUG. Il questo

tratto può trovare informazioni riguardo la traduzione.

Alcuni trascritti regolati tramite l’eliminazione del cappuccio il ribosoma può comunque funzionare e

tradurre grazie alle UTR e IRES. Il meccanismo di traduzione IRES-dipendente è tipico per trascritti da

stress e infezione virale.

L’inizio di traduzione nei batteri: I batteri contengono t-RNA specifico per formil-Metionina. In E. coli

il 50 % delle proteine presenta Metionina in N-terminale. Inoltre, Shine e Dalgarno scoprono una

sequenza consenso di legame per il ribosoma posizionata a monte di molti geni. Questa sequenza

detta Shine-Dalgarno box si appaia al rRNA 16S, avviene poi il reclutamento dei fattori IF. In

particolare, IF-2 regola l’associazione del primo AA-tRNA nei procarioti mentre IF-3 regola

l’associazione delle subunita’ ribosomiali nei procarioti.

Le fasi di inizio traduzione negli eucarioti: IF2 con GTP lega tRNA-Met iniziatore. Subunità minore

legata a fattori IF1, IF3, IF5 interagisce con il complesso tRNA-Met/IF2 e si lega al mRNA sul cap 5’ 

scivola fino ad AUG (contenuta della sequenza di Kozak); anticodone del tRNA-Met lega il codone

AUG, quindi reclutamento della subunità maggiore grazie a IF6.

Poiché la scansione fino a AUG può essere ostacolata dalla presenza di strutture secondare

dell’mRNA i IF4, che inizialmente legano il cap, svolgono un’attività elicasica che scioglie queste

strutture.

Regolazione inizio traduzione:

Subunità F4E viene destabilizzata da particolari proteine impedendo al complesso eligasico

- di legarsi al cap quindi tutto il complesso di pre-inizio di 48S non può formarsi.

eiF2 ha subunità alfa che può subire fosforilazione da parte di particolari proteine chinasi,

- inibendo la sintesi proteica generale; si attiva però un’altra via di sintesi tipica di situazioni di

stress = IRES-dipendente. (queste proteine chinasi infatti si attivano in caso di stress

cellulare; in particolare le cellule tumorali si trovano spesso in condizioni di stress quindi

inibizione della sintesi proteica).

Altro tipo di controllo è quello dovuta all’interazione di una particolare sequenza di mRNA con

- con uno specifico repressore traduzionale, un esempio è quello della sintesi della ferritina,

proteina responsabile del sequestramento del ferro nella cellula (se anch’essa in eccesso

può essere nociva). La sua traduzione è regolata sulla base del ferro disponibile; in assenza

di ferro il repressore traduzionale IRP lega l’mRNA in una specifica struttura a forcina

detta IRE della 5'UTR impedisce il legame della subunità

ribosomiale 40S al 5'cap dell’mRNA, bloccando così la traduzione. In presenza diferro, questo

lega IRP portandolo ad una conformazione che lo rende in capace di legare IRE IRP, quindi si

dissocia e sblocca così l’inizio della traduzione.

Fase di allungamento: ogni ciclo di allungamento è costituito da tre fasi: 1) entrata di un nuovo tRNA

nel sito A vuoto 2) formazione di un nuovo legame peptidico. 3) traslocazione dell’insieme mRNA-

tRNA-peptide dal sito A al sito P, in modo che il sito A ritorni vuoto pronto per iniziare un nuovo ciclo.

Nei procarioti sono necessari anche 3 fattori proteici: EF-Tu, EF-Ts, EF-G e GTP. EF-Tu media il legame

dell’amminoacil-tRNA nel sito A, lega dapprima una molecola di GTP, formando il complesso EF-Tu-

GTP. Successivamente si ha l’appaiamento del t- RNA con mRNA del sito A; se l’appaiamento è

corretto si ha un cambio conformazionale che porta l’idrolisi dell’GTP a GDP da parte del EF-Tu,

quindi viene rilasciato il complesso EF-Tu-GDP e si ha la formazione di un legame stabile del t-RNA

all’mRNA quindi formazione del legame peptidico. La riattivazione del EF-Tu-GDP a EF-Tu-GTP avviene

grazie al EF-Ts che agisce come fattore di scambio del GTP.

Il fattore EF-G è richiesto nella fase di traslocazione, la cui funzione è sempre associata all’idrolisi del

GTP. EF-GTP lega emisito A della subunità maggiore e poi si allunga nell’emisito A di quella minore

favorendo la traslocazione del peptidil-RNA da A a P e del tRNA scarico da P a E; EF-GTP viene quindi

rilasciato come EF-GDP; che viene riattivato a EF-GTP per un altro ciclo senza richiedere un fattore

specifico poiché l’affinità con il GTP è maggiore.

I dettagli del meccanismo sono state svelate usando particolari antibiotici.  Se somministro

puromicina la quale assomiglia alla parte terminale di un AA-tRNA, questa entra nella tasca A ma

non avendo nessun gruppo reattivo non reagisce con l’anticodone quindi viene rilasciato, quindi la

traduzione termina generando una proteina incompleta.

EF-TU dopo aver idrolizzato GTP esce dalla tasca A e se trattando con chirommicina viene impedita

l’uscita del GDP. Idem l’acido fusilico blocca l’uscita di EF-G/GDP dopo che è avvenuto il legame

peptidico, quindi blocca il ribosoma impedendone la traslocazione.

Spesso le EF-Tu poiché assomigliano molto alle tRNA competono per il sito A. L’idrolisi del GTP induce

un cambio di conformazione delle proteine EF-Tu e EF-TG e del ribosoma, ciò determina l’irreversibilità

del processo. Negli eucarioti i fattori di allungamento vengono chiamati eEF: eEF1A analogo del EF-Tu,

eEF1B analogo del EF-Ts, mentre eEF2 implicato nella traslocazione è omologo del EF-G.

La terminazione: ci sono 3 codoni di stop UAG, UAA, UGA. Questi non sono letti da nessun tRNA, e

richiamano particolari fattori detti fattori di rilascio RF. Quando sull’mRNA si presenta un codone di

stop nel sito A si lega un RF1 (o RF2) che provoca il distacco della catena peptidica (reazione

idrolitica), si lega poi un RF3-GPD. A seguito dello scambio GDP/GTP si ha il rilascio di RF1 e RF3-GTP.

Interviene un altro RRF che interagisce con il sito A del ribosoma e viene poi spiazzato da EF-G

inducendo il rilascio del tRNA e il disassemblaggio di tutti i componenti. In particolare, a reagire con la

tasca catalitica del ribosoma è la Q della sequenza GGQ presente in tutti i RF.

Nei procarioti RF1 riconosce UAA e UAG, mentre R