Riassunto esame Biologia Molecolare, Prof. Pellicioli, libro consigliato Biologia Molecolare, Amaldi

Biologia molecolare: Principi base

Organismi modello

Un organismo modello è una specie che è stata ampiamente studiata, di solito perché è facile da mantenere e da allevare in un ambiente di laboratorio e ha particolari vantaggi sperimentali. Nel corso degli anni, sono stati accumulati molti dati su tali organismi e questo in sé li rende più attraenti per studiare. Gli organismi del modello vengono utilizzati per ottenere informazioni su altre specie - compresi gli esseri umani - che sono più difficili da studiare direttamente.

• Escherichia coli
• Saccharomyces cerevisiae
• Schizosaccharomyces pombe
• Caenorhabditis elegans
• Drosophila melanogaster
• Danio rerio
• Xenopus laevis
• Mus musculus
• Arabidopsis thaliana

Cristallografia a raggi X

Nei cristalli, le molecole vengono ordinate in un reticolo. Quando un raggio X incontra un particolare atomo di un cristallo, viene deviato ad un angolo caratteristico. Un raggio a raggi X, diretto a un cristallo, è suddiviso in fasci più piccoli che lasciano il cristallo ad angoli diversi generando un diffrattogramma, cioè un gruppo di punti su una lastra fotografica; questa immagine attraverso leggi fisiche permette di estrarre numerose informazioni sulla proteina. Ogni punto indica l'esistenza di moduli ripetuti (gruppo di atomi). La distanza di un punto dal centro è inversamente proporzionale alla distanza tra i moduli ripetuti (punti centrali = maggiore distanza, punti periferici = spaziatura minore). Questa tecnica è stata usata per lo studio del DNA.

Frazionamento cellulare

Altra tecnica per studiare la cellula è il frazionamento, ovvero scomposizione vera e propria della cellula usando varie tecniche come la centrifugazione differenziale; la centrifugazione a velocità differenti permette di far sedimentare di volta in volta elementi differenti della cellula. Utile per separare e purificare molti componenti della cellula. Centrifugazione in gradiente di densità: Gradiente più usato è il saccarosio. Per la preparazione di un gradiente di saccarosio si utilizza un apparato costituito da due vasi comunicanti aventi saccarosio a concentrazioni differenti. Vengono fatti defluire all'interno di una provetta formando un gradiente lineare di concentrazione che va dal 50% al fondo al 20% in cima. Il campione da analizzare viene caricato con una pipetta al di sopra di un gradiente di saccarosio, la provetta viene centrifugata. La centrifugazione viene interrotta quando il campione è sedimentato all'interno del gradiente, ma prima che raggiunga il fondo, gli elementi si stratificano. Si pratica un piccolo forellino alla base in modo che la soluzione inizi a gocciolare. La soluzione che gocciola viene prima fatta passare in uno spettrofotometro che ne registra l’assorbanza e poi frazionata in una serie di provette. In un gradiente di saccarosio, la velocità di migrazione nel gradiente dipende dal coefficiente di sedimentazione S (unità Svedberg). S dipende dalla massa e dalla forma della molecola o particella.

CitoFluorimetro (FAX)

Il citoFluorimetro (FAX) è uno strumento che permette di scoprire la fase del ciclo cellulare della cellula (usata per esempio negli esami del sangue). Ogni cellula viene sollecitata da un raggio laser e, sulla base dell'energia che viene riemessa dalla cella, si può capire la sua forma e la quantità di DNA che contiene (n o 2n, quindi si capisce la fase a cui appartiene).

Scoperta del DNA e il suo ruolo come materiale genetico

Miescher isolò da globuli bianchi una sostanza ricca di fosforo che chiamò nucleina. Protocollo Miescher per purificare Nuclein (1869): L'HCl diluito produce un precipitato flocculente. Il nucleo era solubile in soluzioni alcaline e non clottò sul riscaldamento... "Perciò non apparteneva a nessun tipo di proteine conosciuto...". Il nucleo conteneva una grande quantità di un nuovo composto chimico che non era associato a una parte proteica. Considerando l'alto contenuto di fosforo (3%), Miescher ha ipotizzato che potrebbe costituire un "deposito di fosforo organico" per la cellula.

Levene capiva anche che gli acidi nucleici consistevano in una catena di zuccheri legati da legami 3'-5' fosfodiestere mentre lateralmente vi erano legate basi azotate. Levene pensava che fosse lungo 4 nucleotidi poiché analisi sul peso molecolare davano un peso di circa 1000 Da che corrisponde circa a quello di 4 nucleotidi e poiché sembrava che i nucleotidi fossero presenti in proporzioni equimolari. Secondo l'ipotesi tetranucleotide di Levene (1917), la molecola del DNA era costituita da una catena di soli 4 nucleotidi (A-T-C-G).

Molti ricercatori hanno iniziato a utilizzare metodi di purificazione più lievi e nei prossimi vent'anni il peso molecolare del DNA ha continuato a crescere: decine di migliaia di dalton, centinaia di migliaia e milioni. L'ipotesi principale era che il DNA era un colloide ad alto peso molecolare (cioè un aggregato molecolare). Ma per arrivare al riconoscimento che il DNA è una macromolecola (cioè un polimero in cui i singoli monomeri sono legati tra loro da legami covalenti) dobbiamo aspettare fino al 1943 (J.M. Gulland). Tuttavia l'idea che la macromolecola consistesse in una monotona ricorrenza di tetranucleotidi rimaneva (in analogia con la nuova scoperta struttura del glicogeno). Pertanto, ancora nel 1943, il DNA potrebbe essere chiamato una molecola orfana onnipresente, abbondante, chimicamente ben descritta.

Il DNA porta l'informazione genetica

Frederick Griffith (1928): Un ceppo S di batterio pneumococcus (Streptococcus pneumonie) causa la polmonite; mentre ceppo R no. Quando ceppo S viene inattivato alzando la temperatura e poi iniettato nei topi perde l’effetto patogeno. Tuttavia se ceppo S inattivo venisse mescolato con ceppo R, i topi morivano lo stesso. Scoprì che ceppo R acquisisce capsula polisaccaride e la mantiene per molte generazioni. Ipotizzo che il carattere patogeno era trasferito in modo mendeliano.

Suo esperimento confermato da Avery: frazionò l'estratto cellulare che era in grado di convertire ceppo R in ceppo S. Le varie componenti molecolari dell'estratto vengono purificate inserendole in una provetta contenente pneumococchi R, S vivi e ciascuna provetta conteneva un diverso reagente per la degradazione specifica di una componente molecolare. Solo quella in cui venne inserita la DNA ligasi non permetteva la crescita di batteri virulenti, dimostrando che la molecola di DNA rappresentava il principio trasformante.

Esperimento del frullatore 1952

I geni sono “scritti” nel DNA o nelle proteine? Fago che infetta i batteri ha un capside proteico. Dopo aver marcato il DNA del fago con p32 e le proteine del capside con s35, i virus vennero frullati in modo da separare virus da cellule. La successiva centrifugazione dimostrò che DNA si trovava all'interno delle cellule mentre proteine erano fuori. Ciò dimostrò che il DNA è il materiale genetico e che non sono le proteine a trasmettere info genetica.

Struttura chimica degli acidi nucleici

DNA e RNA sono polimeri lineari di nucleotidi. Nucleotidi costituiti da 3 componenti: zucchero pentoso (ribosio o desossiribosio), base azotata, uno o più gruppi fosfati. Le basi si dividono in purine (Adenina e Guanina) e pirimidine (Citosina, Timina e Uracile, presente solo in RNA), se legate al C1 di uno zucchero costituiscono un nucleoside. Ai nucleotidi possono essere legati più gruppi fosfati ottenendo nucleotidi. Lo scheletro della catena polinucleotidica è costituita da un'alternanza di gruppi fosfati e zuccheri. Ogni fosfato forma un legame estere con il C5 di uno zucchero e un secondo legame estere con il C3 dello zucchero successivo, legame fosfodiestero, conferisce asimmetria e polarità alla molecola.

Chargaff aveva iniziato ad analizzare la quantità di basi presenti nel DNA, scoprì che c’erano tante purine quante pirimidine (regola di Chargaff) e che le proporzioni erano variabili da specie a specie; quindi la teoria del tetranucleotide non poteva esistere.

Diffrazione raggi X per conoscere struttura DNA

1952: Pauling propose struttura a 3 eliche intrecciate tra loro con scheletro zucchero-fosfato all'interno e basi all'esterno. Franklin distinse due forme di DNA (A e B) che potevano essere separate l'una dall'altra. I preparati puri (la forma B è il più fisiologico, cuscinetto 8 molecole d'acqua per nucleotide, mentre la A deriva dalla disidratazione) ha dato un difrattogramma più riproducibile e analizzabile.

Da "Picture 51" Franklin ha determinato le seguenti quattro caratteristiche fondamentali del DNA:

• La molecola del DNA è una fibra cilindrica (2 nanometri di diametro); le basi (strutture planari) sono imballate come un cumulo di monete avendo tra loro una distanza di 0,34 nm (periodo minore).
• La spina di fosfato-zucchero del DNA è trovata, esposta al solvente, all'esterno della molecola (e non internamente come supposto da altri scienziati).
• La struttura è probabilmente elicoidale con un periodo, per DNA-B, di 3,4 nm (periodo maggiore), 10 volte la distanza tra due basi vicine.
• Il DNA doveva consistere in più di una catena di polinucleotidi (ma probabilmente meno di 3). Dedotta confrontando la densità misurata del DNA (circa 1,75 g/cc) e quella calcolata dalla spaziatura atomica. Di conseguenza, il DNA non dovrebbe essere un'elica triplice come proposto da Pauling.

Franklin non prevedeva il "modello a doppia elica", soprattutto perché non aveva una teoria per spiegare l'interazione delle basi al centro della doppia elica. Watson e Crick misero insieme le varie informazioni della Franklin e di Chargaff e quindi ebbero l'illuminazione per cui ogni purina doveva stare con una pirimidina. Inoltre, dovendo essere sempre costante a 20 Å il diametro, quindi doveva esserci un accoppiamento preciso, ovvero A+T e G+C.

Se G+C è 25% A+T dovrebbe essere 75, ma misurato mi risulta 60, è dovuta ad un’alterazione del filamento di DNA (non parlo di mutazione perché mutazione riguarda solo filamenti che codificano per info genetica) e perdita di basi.

Pauling aveva indicato l'esistenza dei legami dell'idrogeno nella struttura secondaria del collageno. I legami idrogeno stabilizzano l'alfa-elica formando un ponte tra il gruppo CO di un legame peptidico e l'NH di un altro legame peptidico, a tre posizioni di distanza dal primo. Quando riscaldata a 70-80°C, una soluzione di DNA molto viscoso perde la sua viscosità (cioè è denaturato); a quelle temperature i legami chimici covalenti sono stabili: gli unici legami che si rompono sono i legami dell'idrogeno. Pertanto, Pauling era convinto che tali legami dovevano essere coinvolti nella struttura del DNA come accadeva per le proteine.

Al contrario, Watson ha avuto l'intuizione che i legami idrogeno nel DNA non stabilizzassero l'elica, ma, piuttosto, erano la colla che teneva insieme i due filamenti di DNA. Watson e Crick proposero che i legami idrogeno collegassero tra loro coppie di basi secondo l'ordine già conosciuto (cioè A con T e G con C). Le strutture risultanti sono planari, perpendicolari all'asse e di dimensioni identiche, fornendo quindi un diametro costante per la doppia elica. Impose inoltre che le due catene fossero antiparallele, disposte con polarità 5’→3’ opposta l’una rispetto all’altra.

L'elica doveva essere necessariamente destrogira perché nel caso di levogira non stava in piedi, c’erano degli angoli che non permettevano il mantenimento della struttura. Inoltre si scoprì che il ribosio non doveva trovarsi sullo stesso piano delle basi ma doveva essere perpendicolare al piano di queste. Se così fosse, i passi dell’elica dovevano essere tutti uguali, invece esistevano delle scanalature/solchi disuguali infatti si trovano leggermente spostati; la distanza tra i due ribosi è da una parte 120° dall’altra 240°. Esistono infatti solchi maggiori e solchi minori. Inoltre, la coppia di base successiva a causa dell’ingombro del ribosio non era disposta perpendicolarmente a quella sotto ma subiva una rotazione di 36°, solo dopo 10 basi si troverà nella stessa posizione.

Le proteine per interagire con le basi devono entrare nell’elica accedendo attraverso i solchi, quelle ad alfa elica interagiscono perfettamente.

Domanda esame: quali forze chimiche/fisiche permettono l’instaurarsi della doppia elica di DNA?

Non sono solo i ponti idrogeno; l’altra forza in gioco è l’idrofobicità dovuta all’impilamento delle basi dell’elica. Le basi presentano una sovrapposizione anche se non completa in modo da rendere minimo il contatto con l’acqua. In particolare la parte interna è idrofobica (paia di basi) mentre quella esterna idrofilica (zucchero-fosfato) che interagisce con l’acqua facendo ponti H con fosfati. Le varie combinazioni di basi hanno un contenuto energetico differente, ciò influenza la geometria di impilamento. La stabilità dell’elica dipende quindi anche dalla composizione di basi: se ricco di C-G è più stabile (fanno tre legami) rispetto a uno ricco di A-T (solo due legami). Posso anche separare i filamenti sconfiggendo forze legate ad idrofobicità per esempio variando la salinità.

Esistono tipi di elica differenti; i cristalli non sono stabili variano a seconda dell’umidità e della salinità. La struttura di Watson e Crick rilevata in condizioni di alta umidità e in soluzione acquosa, corrisponde alla situazione in vitro e viene identificata come forma B.

• Forma A: bassa umidità, elica è più tozza, diametro maggiore; con cristallizzazione al centro appare vuota perché basi sono più vicine ai fosfati in superficie; solchi sono minori.
• Forma Z: molto più allungata e stretta, ricca di CG con citosine metilate; sinestrorsa a causa del cambio di orientamento del legame tra la guanina e il desossiribosio, ciò fa sì che la guanosina assuma una conformazione syn. I due filamenti hanno andamento a zig zag, ovvero il filamento non è lineare ma sembra accartocciato, proprio a causa dell’alternanza di nucleotidi syn e anti. Prove sperimentali hanno mostrato che nella stessa molecola di DNA possono coesistere tratti B e tratti Z. Poiché Z è sinestrorsa nel tratto di giunzione delle due catene, A e T perdono il contatto e tendono ad essere esposte all’esterno. Cambiano completamente i parametri fisici dell’elica. Oggi ci sono anticorpi in grado di riconoscere le metilazioni di CG. Le sequenze Z spesso sono sequenze regolatrice e sono legate a patologie, hanno anche implicazioni termodinamiche poiché hanno 3 legami idrogeno.

Movimenti tipici delle basi:

• Twist: movimento rotazionale tra le basi mentre ruotano, non sono proprio sullo stesso piano.
• Propeller twist: si alza da un lato corto, esce dal piano.
• Tilt: altro tipo di legame coppia di base successiva non giace tutta sul piano ma rimane legata a quella sottostante in un punto del piano.
• Rolling: si alza una coppia di basi rimanendo legata per il lato lungo.
• Slide
• Flipping: una purina viene estrusa all’esterno, ovvero al posto di legarsi alla piramidina viene ruotata verso l’esterno.

Strutture alternative

• DNA Curvo: L'energia di impilamento delle basi varia, può tirare di più da una parte rispetto che dall’altra e spesso le coppie di basi non sono parallele tra di loro. La sequenza del DNA influenza la sua struttura. Due paia di basi AT adiacenti hanno tendenza a piegarsi verso il solco minore mentre due CG hanno tendenza inversa. Struttura regolare di una molecola duplex di DNA secondo il modello di Crick e Watson. Alcune coppie di basi adiacenti, non essendo perfettamente parallele, introducono piccoli piegamenti della molecola duplex; se tali perturbazioni sono distribuite in maniera casuale lungo la molecola di DNA, risultano in una struttura un po’ irregolare ma sostanzialmente dritta. Se la sequenza nucleotidica è tale per cui i piccoli angoli tra le coppie di basi adiacenti si ripetono regolarmente a ogni giro di elica (cioè ogni 10 pb), gli angoli si sommano tra loro e risultano in una curvatura intrinseca della molecola di DNA. In questo caso la sequenza random non si è evoluta a caso. DNA curvo (bent DNA) esiste in vivo: probabile funzione biologica. Il Tilt e il Roll delle coppie adiacenti di paia di basi sono all’origine di curvature dell’asse della doppia elica di DNA. Le modificazioni di Tilt e Roll possono essere più o meno drastiche e questo può causare diversi tipi di DNA piegato.
• Struttura cruciforme: si verifica quando sullo stesso filamento ci sono, adiacenti o a breve distanza, ripetizioni invertite (due copie della stessa sequenza in orientamento opposto) di basi, quindi si associano tra loro e non con quelle del filamento complementare. Cruciforme se avviene su entrambi i filamenti mentre se su uno solo, quindi una sola ansa, si parla di struttura a forcina.
• Tripla elica: si forma in casi molto particolari; nella doppia elica si intercala nel solco maggiore un altro filamento fatto solo di pirimidine, crea ponti idrogeno diversi da quelli tra AT e CG e accoppiamenti ATA e CGC detti appaiamenti di Hoogsteen. Le purine formeranno legami H sia con le pirimidine del duplex sia con le pirimidine del filamento extra.
• Quartetto G: struttura che si forma da tre/quattro tratti di DNA o RNA a singolo filamento aventi più di 3 G consecutive che si affiancano tra loro e formano legami idrogeno tra le G. Situazione più comune è quella in cui il quartetto si forma tra serie di G dello stesso filamento che si ripiega più volte su se stesso.