Riassunto esame Biologia molecolare, Prof. Miceli Gaetano, libro consigliato Biologia molecolare, Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani

RICOMBINAZIONE OMOLOGA

Modello di Holliday

ROTTURA SINGOLO FILAMENTO

Tutto inizia con la formazione di un nick, cioè una rottura a singolo lamento su

entrambe le eliche del DNA (quindi un taglio parziale).

Uno dei due lamenti tagliati si stacca e invade la molecola omologa, trovando la

invasione

sequenza complementare e appaiandosi ad essa: questa fase è detta

del lamento. Contemporaneamente, anche il lamento dell’altra molecola

compie un’invasione analoga. giunzione di Holliday,

Il risultato è la formazione di una struttura incrociata, detta

in cui le due doppie eliche sono sicamente connesse in un punto.

eteroduplex,

Nel punto di incrocio si forma una zona chiamata dove i lamenti di

DNA provengono da origini diverse.

Essendo simili ma non identici, possono veri carsi mismatch, ovvero errori di

appaiamento, che in alcuni casi possono dare origine a mutazioni.

La giunzione di Holliday può muoversi lungo il DNA attraverso un processo

migrazione della rami cazione,

chiamato che estende la regione di scambio.

Alla ne, le due molecole devono essere separate, e questo può avvenire in due

modi distinti:

• crossing over,

taglio verticale —> si ottiene un vero e proprio cioè uno scambio

reciproco di segmenti tra le due molecole.

• patch:

taglio orizzontale —> si ha invece una situazione detta si forma solo una

piccola zona ricombinata, una sorta di “toppa” in cui un tratto di DNA proviene

dall’altra molecola, ma il resto della sequenza rimane invariato

ROTTURA DOPPIO FILAMENTO

Quando si veri ca una rottura a doppio lamento del DNA, interviene un

RecBCD,

complesso chiamato che ha attività elicasica e nucleasica, cioè è in

grado sia di disavvolgere la doppia elica, sia di degradare il DNA.

Questo complesso si lega al punto della rottura e comincia a svolgere le sue

funzioni, procedendo lungo il DNA nché incontra una sequenza speci ca

sito "chi"

chiamata (con sequenza GCTGGTGG).

A questo punto, la degradazione del lamento 3' si arresta, mentre continua quella

del lamento 5’. Il risultato è la formazione di una sporgenza a singolo lamento

con estremità 3’-OH, che è essenziale per il passaggio successivo.

RecA:

Qui entra in gioco la proteina essa si lega a questa estremità 3’ e la aiuta a

invadere una molecola omologa di DNA, cioè una molecola con sequenza simile,

per cercare una regione complementare.

Il lamento danneggiato si appaia così con quello sano, formando una struttura

temporanea a tripla elica.

Questo processo è reso possibile dal fatto che RecA possiede due siti attivi:

• uno principale, che lega il DNA a singolo lamento

• uno secondario, che lega il DNA a doppio lamento

Questi due siti lavorano insieme per facilitare l’invasione e l’appaiamento

corretto.

Dopo l’invasione, si forma una giunzione di Holliday, che viene riconosciuta dalla

RuvA, RuvB,

proteina che a sua volta recluta un’elicasi. Insieme, RuvA e RuvB

16

fi fi fi fi fi fi fi fi fi fi fi fi fi fi fi fi fi

fi

fi

permettono la migrazione della rami cazione (branch migration), ovvero lo

spostamento del punto di scambio lungo il DNA.

RuvC,

A questo punto interviene una nucleasi, che ha il compito di tagliare la

giunzione di Holliday per separare le due molecole.

Il taglio può avvenire in due modi: →

taglio verticale (su lamenti che non avevano subito il nick iniziale) si ha un

• crossing over, cioè uno scambio di tratti tra i due DNA →

taglio orizzontale (su lamenti che avevano già subito il nick) si forma un

• patch, cioè una piccola zona ricombinata, senza crossing over

In ne, una volta che il DNA è stato riparato, la forca replicativa può ripartire.

Questo è possibile grazie alla formazione del primosoma, un complesso di

proteine tra cui elicasi e primasi, che riattivano la duplicazione del DNA a valle

della riparazione.

RICOMBINAZIONE SITO-SPECIFICA

Questo tipo di ricombinazione non avviene ovunque nel genoma, ma solo in punti

siti di ricombinazione.

ben precisi, detti Questi siti sono delle brevi sequenze di

ricombinasi.

DNA (lunghe circa 20-200 basi) riconosciute da enzimi chiamati

La ricombinazione sito-speci ca è un meccanismo molto ordinato e regolato,

presente in tutti i tipi di cellule. È fondamentale perché permette di:

- Regolare l’espressione genica (accendere o spegnere geni)

- Fare modi che precise nel DNA durante lo sviluppo dell’organismo

- Consentire ai virus o ai plasmidi (piccoli DNA circolari) di inserirsi o integrarsi nel

DNA della cellula ospite

Perché il processo funzioni servono tre componenti:

1. Una ricombinasi, cioè l’enzima che taglia e riunisce il DNA

2. Un sito di ricombinazione, ovvero la sequenza precisa dove l’enzima si lega

3. Alcune proteine accessorie, chiamate architettoniche, che aiutano a regolare il

processo

A seconda di come sono posizionati i siti di ricombinazione, possono avvenire tre

diversi tipi di riarrangiamenti:

• INSERZIONE: Se i siti si trovano su due molecole diverse—>un pezzo di DNA si

integra nell’altra molecola

• DELEZIONE: Se i siti sono sulla stessa molecola, nella stessa direzione—> un

pezzo di DNA viene rimosso

• INVERSIONE: Se i due siti sono in direzione opposta—>il pezzo di DNA viene

capovolto Come agiscono le ricombinasi?

Esistono due grandi classi di ricombinasi, in base all’amminoacido che usano per

tagliare il DNA:

Serina ricombinasi

• Fanno quattro tagli contemporaneamente (uno su ogni lamento del DNA)

• Dopo il taglio, i lamenti si scambiano e si richiudono, generando la

ricombinazione 17

fi fi fi fi fi fi fi fi

• Il meccanismo è molto preciso: la struttura dell’enzima permette una rotazione

interna che facilita lo scambio

Tirosina ricombinasi

• Il processo è più ordinato: fanno due tagli alla volta

• Prima tagliano due lamenti, li ricombinano, e poi tagliano gli altri due per

completare il processo

• Un esempio molto famoso di questa classe è l’enzima Cre, codi cato dal fago

P1, che agisce su particolari siti chiamati lox

Il sistema Cre-loxP

Questo sistema è molto usato in biotecnologia e genetica molecolare, perché

consente di modi care il DNA in modo preciso e controllato.

Funziona così:

• Si inserisce un gene bersaglio nel DNA, preceduto e seguito da due siti loxP

• Si crea un organismo che produce l’enzima Cre solo in un determinato tessuto

• Quando la Cre viene espressa, riconosce i due siti loxP e taglia il pezzo tra di

loro, causando la delezione del gene

Questo sistema è usato per creare i cosiddetti topi knock-out condizionali, dove un

gene viene eliminato solo in uno speci co tessuto e non in tutto l’organismo. È una

tecnica molto potente per studiare la funzione di un gene in modo mirato.

Funziona così:

Si crea un topo “lox”, in cui un gene target (cioè quello che vogliamo

1. eliminare) è stato preceduto e seguito da due siti loxP

◦ In tutte le cellule questo gene è presente e funziona normalmente

Si crea un topo “Cre”, in cui la ricombinasi Cre viene prodotta solo in un

2. particolare tessuto (es. cuore, fegato…) grazie a un promotore speci co

◦ In tutti gli altri tessuti, Cre non viene espressa, quindi non succede nulla

Incrociando questi due topi, si ottiene un topo knock-out condizionale:

3. ◦ In tutte le cellule il gene target è presente, ma solo nel tessuto in cui è attiva

la Cre il gene viene tagliato e disattivato.

Questo ti permette di studiare gli e etti speci ci della perdita del gene in un solo

tessuto, senza compromettere la sopravvivenza del topo.

TRASPOSIZIONE trasposoni,

In questo caso, ci sono dei pezzi di DNA chiamati che possono

spostarsi da un punto all’altro del genoma.

Questi “geni mobili” possono:

• Inserirsi dentro altri geni e bloccarne la funzione

• Spostarsi casualmente o in modo programmato

• Essere usati in laboratorio per capire a cosa servono certi geni

Ad esempio, se un trasposone interrompe un gene e la proteina non viene più

prodotta, si può dedurre la funzione di quel gene osservando cosa succede alla

cellula o all’organismo. 18

fi fi ff fi fi fi fi

TRASCRIZIONE DELL’RNA

Processo attraverso cui, partendo da una doppia elica di DNA, viene sintetizzato

un lamento di RNA.

Questo processo è simile ma anche diverso dalla duplicazione del DNA.

Ad esempio:

• Nella duplicazione, entrambi i lamenti del DNA fungono da stampo, nella

trascrizione, invece, viene copiato solo un lamento, chiamato lamento stampo.

• Inoltre, non è necessario un primer, perché l’RNA polimerasi può iniziare la

sintesi da sola, a di erenza della DNA polimerasi nella duplicazione.

Tuttavia, entrambi i processi:

• iniziano in punti speci ci (OriC per la duplicazione, promotori per la trascrizione)

• →

avvengono in direzione 5’ 3’

Fasi della trascrizione:

Inizio

1. —>L’RNA polimerasi riconosce e si lega a una regione speci ca del DNA

promotore. complesso chiuso

chiamata Si forma un (RNA polimerasi legata

→

alla doppia elica). Successivamente, la doppia elica si apre si forma una

complesso aperto.

bolla di trascrizione = Inizia la sintesi del lamento di RNA

2. Allungamento —> L’RNA polimerasi si allontana dal promotore e sintetizza

→

ribon ucleotidi per l’RNA in direzione 5’ 3’

3. Terminazione —> quando arriva al termine del gene, l’RNA polimerasi si

stacca dal DNA; la sintesi dell’RNA è conclusa

Regolazione della trascrizione:

Un punto fondamentale è che modulando l’interazione tra RNA polimerasi e

promotore, la cellula può regolare quanto RNA viene prodotto.

E di conseguenza:

• ➕ trascrizione = piu RNA = piu proteine

• ➖ trascrizione = meno RNA = meno proteine

RNA POLIMERASI CORE & OLOENZIMA

La RNA polimerasi esiste in due forme. Questa distinzione è simile a quella che si

fa tra la forma apo e la forma olo negli enzimi:

• polimerasi core apo):

RNA (forma è un enzima incompleto, ma già capace di

sintetizzare RNA. Tuttavia, non è in grado da sola di iniziare la trascrizione nel

punto giusto del DNA, perché non riconosce il promotore.

• oloenzima:

RNA polimerasi è la forma completa e funzionante. Si forma quando

subunità sigma

al core si aggiunge la (σ), che