Riassunto esame Biologia Molecolare, prof Borgatti, libro consigliato: Biologia molecolare del gene, Watson

Biologia molecolare

Appunti lezione 2018 – Cdl in Biotecnologie, UNIFE. Lezioni tenute dalla prof.ssa Monica Borgatti.

Avviso di utilizzo

La seguente dispensa è stata redatta partendo dall’ascolto delle lezioni frontali e da un successivo riascolto tramite registrazioni, in modo da trascrivere tutte le informazioni dettate dalla professoressa nel corso delle lezioni. Tuttavia, queste dispense non sono da considerare “sbobine” perché le parole della professoressa sono state ascoltate, comprese e successivamente trascritte in modo corretto e ordinato.

Nei vari capitoli si trovano delle parole in grassetto o evidenziate per indicarne l’importanza (non c’è un determinato ordine di importanza) e la necessaria memorizzazione. In particolare, alcune parole possiedono vari colori per facilitarne la memorizzazione da parte del lettore. Tutte le immagini e le tabelle (compresi i testi all’interno) inserite nei vari capitoli fanno parte del programma del corso e devono essere studiate.

Per ottenere il massimo dei voti l’autore non raccomanda di sostituire queste dispense con il libro di testo, ma ne consiglia una integrazione a quest’ultimo. Nelle varie sessioni d’esame, tutti gli argomenti richiesti sono presenti all’interno di questa dispensa.

Materiale didattico del corso

• Watson J.D, Biologia Molecolare del Gene, Zanichelli editore
• Appunti forniti dal docente

Obiettivi formativi

Il corso prevede di fornire conoscenze sullo studio della struttura, funzione e regolazione delle macromolecole essenziali delle cellule, quali il DNA, l’RNA e le proteine approfondendo le vie biochimiche in cui sono coinvolte. In particolare, il corso affronterà i meccanismi alla base della replicazione e riparazione del DNA e i meccanismi che controllano il flusso dell'informazione genetica dal DNA alle proteine, trascrizione e traduzione, e i relativi meccanismi di regolazione cellulare. In tal modo lo studente sarà in grado di conoscere e comprendere la struttura, funzione e attività delle macromolecole biologiche, e delle vie coinvolte nella regolazione e controllo del flusso dell’informazione biologica.

Sommario

1. Introduzione ...................................................................................................................................... 5
2. La struttura degli acidi nucleici ................................................................................................... 6
3. Struttura chimica degli acidi nucleici ........................................................................................... 6
4. Struttura fisica del DNA: la doppia elica e i suoi parametri strutturali ...................................... 8
5. Topologia del DNA e DNA topoisomerasi .................................................................................... 11
6. Il Linking Number ..................................................................................................................... 12
7. Le Topoisomerasi ...................................................................................................................... 13
8. Il funzionamento delle DNA Topoisomerasi ............................................................................ 14
9. Struttura dell’RNA ....................................................................................................................... 15
10. Tipi e funzioni dell’RNA ............................................................................................................ 15
11. Gli acidi Nucleici: Tecniche di base ............................................................................................... 16
12. Estrazione degli acidi nucleici ..................................................................................................... 16
13. Lisi delle cellule......................................................................................................................... 17
14. Purificazione del DNA............................................................................................................... 17
15. Concentrazione del DNA e RNA ............................................................................................... 18
16. Separazione degli acidi nucleici mediante elettroforesi su gel .................................................. 19
17. Enzimi di restrizione ................................................................................................................... 20
18. Clonaggio del DNA ........................................................................................................................ 21
19. Vettore di clonaggio .................................................................................................................. 21
20. Vettore di espressione .............................................................................................................. 22
21. Il legame tra frammento e vettore ........................................................................................... 22
22. Clonaggio di prodotti di PCR ..................................................................................................... 23
23. Selezione di batteri ................................................................................................................... 23
24. Tecnica di ibridazione su colonia ................................................................................................ 24
25. Struttura della Cromatina e del Nucleosoma ............................................................................... 24
26. Impacchettamento del Genoma batterico ed Eucariotico .......................................................... 24
27. Struttura del Cromosoma ......................................................................................................... 25
28. Nucleosomi e proprietà della Cromatina .................................................................................... 25
29. Struttura del Nucleosoma ........................................................................................................ 25
30. Strutture di ordine superiore della cromatina ........................................................................ 26
31. Regolazione della cromatina ....................................................................................................... 27
32. Modifiche delle code istoniche ................................................................................................. 28
33. Genomi Procariotici ed Eucariotici ............................................................................................. 29
34. Pseudogene ............................................................................................................................... 29
35. La replicazione del DNA ................................................................................................................ 29
36. Replicazione semiconservativa ................................................................................................... 29
37. Origine di replicazione ................................................................................................................. 29
38. La sintesi del DNA ........................................................................................................................ 30
39. La DNA Polimerasi e il suo funzionamento ............................................................................. 30
40. Gli ioni metallici ..................................................................................................................... 31
41. Le Sliding Clamp ....................................................................................................................... 33
42. La forca replicativa ................................................................................................................... 33
43. La RNA Primasi ........................................................................................................................ 35
44. Le Topoisomerasi nel processo replicativo .............................................................................. 35
45. Meccanismo di replicazione nei Procarioti (E. Coli in particolare) ........................................... 35
46. Meccanismo di replicazione negli Eucarioti ............................................................................... 38
47. Meccanismo di replicazione dei Telomeri Eucariotici................................................................ 39
48. Le Telomerasi ............................................................................................................................ 40
49. Assemblaggio dei Nucleosomi ..................................................................................................... 40
50. Replicazione in vitro: PCR e sequenziamento del DNA ............................................................... 41
51. PCR (Reazione a catena della Polimerasi) .................................................................................. 41
52. Sequenziamento del DNA con il metodo della terminazione della catena ................................ 42
53. Danno al DNA, riparazione e ricombinazione .............................................................................. 42
54. Riparazione dei MissMatch della Replicazione .......................................................................... 43
55. Riparazione delle basi danneggiate............................................................................................. 44
56. Riparazione dei danni alla doppia elica ...................................................................................... 45
57. La Ricombinazione non omologa (NHEJ) ................................................................................ 45
58. La Ricombinazione Omologa (HR) ........................................................................................... 46
59. I Checkpoint .............................................................................................................................. 46
60. Ricombinazione omologa in meiosi ............................................................................................. 47
61. La Ricombinazione per trasposizione ......................................................................................... 47
62. I trasposoni a DNA .................................................................................................................... 48
63. I Retrotrasposoni simil retrovirali o LTR ................................................................................ 48
64. I Retrotrasposoni non retrovirali o Non-LTR o poli-A............................................................. 49
65. La Ricombinazione Conservativa Sito-Specifica (CSSR) ........................................................... 50
66. La Trascrizione .............................................................................................................................. 51
67. L’inizio, l’allungamento e la fine.................................................................................................. 52
68. La RNA Polimerasi ....................................................................................................................... 52
69. La Trascrizione nei Procarioti e la sua regolazione ................................................................... 53
70. La Regolazione della Trascrizione nei Procarioti .................................................................... 56
71. Regolazione dell’Operone Lac inducibile (Metabolismo del Lattosio) in E.Coli .................. 57
72. Regolazione dell’Operone Trp reprimibile (Sintesi del Triptofano) in E.Coli...................... 59
73. La Trascrizione negli eucarioti e la sua regolazione .................................................................. 60
74. Lo Splicing .................................................................................................................................... 65
75. Ulteriori maturazioni dell’RNA: Editing ..................................................................................... 70
76. Ulteriori maturazioni dell’RNA: Traslocazione nucleo-citoplasmatica ..................................... 71
77. La Traduzione ................................................................................................................................ 71
78. Gli attori della traduzione: mRNA, tRNA e Ribosomi ................................................................. 72
79. Inizio della traduzione in Procarioti e Eucarioti ........................................................................ 76
80. La fase di allungamento ............................................................................................................... 78
81. La fase di terminazione ............................................................................................................... 80
82. La regolazione della traduzione in Procarioti ed Eucarioti ....................................................... 81
83. Meccanismi di controllo della qualità degli mRNA..................................................................... 82
84. Il codice genetico .......................................................................................................................... 84
85. Gli RNA Regolatori ........................................................................................................................ 84
86. Esercizi d’esame ........................................................................................................................... 85

Introduzione

Il dogma centrale della Biologia molecolare è il flusso dell’informazione genetica, ovvero come viene trasferita l’informazione codificata nel DNA alle proteine. Francis Crick nel 1956 scrisse questo dogma proponendo come tesi la “Dottrina della Triade”. Egli ipotizzava che l’informazione contenuta nel DNA venisse prima trascritta nel RNA e poi tradotta nella sequenza amminoacidica delle proteine. Inoltre, affermava che dalle proteine non si potesse mai tornare al DNA.

Le seguenti ricerche e scoperte scientifiche portarono a confermare la tesi di Francis Crick, tanto che oggi è ormai avvalorato che il DNA è la molecola che contiene, trasporta ed eredita le informazioni, e l’RNA è la molecola che può trasmettere le informazioni necessarie alla sintesi delle proteine. In realtà l’RNA possiede anche altri compiti e non serve solo alla sintesi delle proteine. I diversi tipi di RNA saranno descritti nei vari capitoli.

La struttura degli acidi nucleici

Struttura chimica degli acidi nucleici

Il DNA e l’RNA sono catene polinucleotidiche, ovvero sono polimeri lineari di nucleotidi. I nucleotidi sono delle molecole organiche formate da tre componenti: Uno zucchero pentoso (formato da 5 atomi di carbonio e un ossigeno disposti ad anello), una base azotata (contiene diversi atomi di azoto) e uno o più gruppi fosfato (formati da fosforo e ossigeno).

Lo zucchero pentoso può essere Ribosio (nel caso del RNA) o Deossiribosio (nel caso del DNA), cioè può contenere o meno un atomo di ossigeno legato al carbonio 2 dell’anello carbonioso. La mancanza dell’atomo di ossigeno nello zucchero del DNA rende la molecola più stabile. Lo zucchero e la base azotata si uniscono mediante un legame N-glicosidico per dare origine al nucleoside. Questo legame si instaura tra il carbonio 1′ dello zucchero e l’azoto nelle purine o l’azoto nelle pirimidine. Le basi azotate si dividono in queste due categorie: Le purine (Adenina (A) e Guanina (G)) hanno un doppio anello, mentre le pirimidine hanno un singolo anello e comprendono la Citosina (C), Timina (T) e l’Uracile (U). La Timina è presente solo nel DNA e viene sostituita dall’Uracile nell’RNA.

Il gruppo fosfato si lega al carbonio 3′ o 5′ dello zucchero per generare il nucleotide che è il “mattoncino” con cui viene costruita tutta la catena polinucleotidica dell’acido nucleico. Quando i nucleotidi sono uniti per formare la lunga catena di DNA o RNA, il gruppo fosfato unisce i due zuccheri una volta in posizione 5′ e nell’altra in posizione 3′. In questo modo si genera anche una sorta di “direzione di lettura” del DNA/RNA (5′ → 3′ o 3′ → 5′, si legge: cinque primo al tre primo o dal tre primo al cinque primo).

Nel DNA questi mattoncini si chiamano deossiribonucleotidi (o anche deossiribonucleosidi 5’ monofosfato) e nel RNA si chiamano ribonucleotidi (o anche ribonucleoside 5’ monofosfato). Il gruppo fosfato è in grado di dare una caratteristica acida alle molecole, per cui nella nomenclatura dei nucleotidi si antepone la parola “acido”. Nelle cellule sono presenti delle eccezioni dove uno o più gruppi fosfato sono legati in posizioni diverse (es. 3′; 2′; 2′ e 3′; 3′ e 5′). Possono essere presenti nella cellula anche dei nucleosidi che contengono fino a 3 gruppi fosfato (es. ATP).

Come abbiamo già visto, nelle catene polinucleotidiche il gruppo fosfato è in grado di legarsi con due zuccheri contemporaneamente mediante un legame fosfodiesterico e formare lunghe catene di nucleotidi. Questo legame avviene tra i carboni 5′ e 3′ dello zucchero ed è instaurato nella cellula dalla DNA (o RNA) polimerasi. É possibile dare un ordine di lettura alla catena polinucleotidica proprio grazie alla direzione in cui lavora la polimerasi. Essa infatti, lavora solo in direzione 5′ → 3′. Nel DNA, essendoci 4 tipi diversi di basi azotate, esistono 4 tipi diversi di nucleotidi che legati insieme uno dopo l’altro nel giusto ordine, danno origine alla vera e propria informazione genetica. Le catene con meno di 50 nucleotidi sono dette oligonucleotidi, mentre quelle da più di 50 sono dette polinucleotidi.

Riassumendo, lo zucchero (Ribosio o Deossiribosio) si lega in lunghe catene con il gruppo fosfato...