Riassunto esame Biologia Molecolare, prof. Mariottini, libro consigliato Il gene VI di Lewin

Biologia molecolare

Dal libro “Il gene VI” di Benjamin Lewin.

Introduzione – Le proteine

I geni sono l'unità dell'informazione genetica e codificano per le proteine, che a loro volta sono responsabili dell'assemblaggio delle strutture necessarie alla cellula per sopravvivere. La funzione di una proteina è determinata sia dalla sua struttura (dettata appunto dal gene) sia dalla localizzazione nella cellula.

Le macromolecole

La grandezza delle macromolecole varia fra 10 e 100 A (1-10 nm). Il DNA, ad esempio, ha un diametro di soli 20 A, per cui una piccola proteina di 25 kd (k dalton) può circondarlo completamente, avendo un diametro di 25 A. Le proteine che intervengono nella duplicazione del DNA o nella sintesi dell'RNA sono ovviamente più grandi.

Le molecole che costituiscono una cellula si dividono in:

• Molecole piccole: i substrati e i prodotti delle vie metaboliche, che forniscono alla cellula l'energia necessaria per sopravvivere. Si distinguono in amminoacidi, zuccheri, acidi grassi e nucleotidi.
• Molecole polimeriche: formate da molecole piccole che prendono il nome di subunità. La polimerizzazione porta alla formazione di quattro tipi di molecole: polisaccaridi (dagli zuccheri), lipidi (dagli acidi grassi), proteine (dagli amminoacidi) e acidi nucleici (dai nucleotidi). Tutte queste molecole, ad eccezione dei lipidi, essendo particolarmente grandi sono dette macromolecole.

Ogni reazione di polimerizzazione porta alla perdita di una molecola d'acqua secondo quella che viene detta reazione di condensazione. Viceversa, rompere un legame all'interno di una molecola polimerica implica l'aggiunta di una molecola d'acqua (reazione idrolitica). In particolare, rompere una proteina è una reazione proteolitica, mentre rompere un acido nucleico è una reazione nucleolitica.

La forma essenziale di un polimero è lo scheletro, una catena di strutture ripetute regolarmente, a cui si legano delle catene laterali. Una proteina ha un'ossatura di legami peptidici in cui gli amminoacidi rappresentano le catene laterali; un acido nucleico ha un'ossatura zucchero-fosfato dove le basi azotate rappresentano le catene laterali; un polisaccaride ha un'ossatura di zuccheri semplici tenuti assieme da legami glicosidici, in cui le catene laterali sono rappresentate da ossidrili o altri sostituenti.

Osservando una cellula batterica, è possibile determinare la percentuale di ogni componente contenuta nella cellula in termini di percentuale: la maggior parte della cellula è costituita da acqua (70%), seguono le proteine (15%) e gli acidi nucleici (5%). Gli altri componenti si dividono il 10% restante.

Le proteine

Tutte le proteine sono composte da 20 amminoacidi standard. Questi composti sono noti come amminoacidi α-perché, con la sola eccezione della prolina che è ciclica, hanno un gruppo amminico primario e un gruppo carbossilico legati allo stesso atomo α di carbonio (la prolina ha un gruppo amminico secondario ed è dunque un imminoacido). Anche la glicina rappresenta un'eccezione in quanto le catene laterali sono rappresentate entrambe dall'H.

Poiché un amminoacido può comportarsi sia come acido che come base, è una sostanza anfotera. Gli α-amminoacidi sono ioni dipolari, perché presentano una carica positiva sul gruppo amminico e una negativa nella zona opposta, sul gruppo carbossilico (il gruppo amminico basico sottrae un H al gruppo carbossilico acido), sebbene la molecola sia nella sua totalità neutra. Per questo, la maggior parte degli α-amminoacidi è molto solubile in acqua. Gli amminoacidi hanno forti caratteristiche acido-base, avendo due catene laterali ionizzabili (o tre).

Classificandoli in base alla carica ionica, si distinguono tre gruppi di amminoacidi:

• Basici: l'aggiunta di uno ione idrogeno al gruppo amminico ne determina il cambiamento nella forma NH₃⁺.
• Acidi: il gruppo carbossilico perde uno ione idrogeno modificandosi nella forma –COO^-.
• Neutri: sono gli amminoacidi privi di una carica netta. A volte, per motivi di distribuzione spaziale delle cariche, sono polari. Viceversa, sono non polari e quindi idrofobici.

Altri amminoacidi, chiamati amminoacidi non standard, derivano da specifiche modificazioni dei residui amminoacidici dopo la sintesi della catena. I tre principali tipi di modificazione sono:

• Fosforilazione: consiste nell'addizione di un gruppo fosfato su un ossidrile libero. La proteina così modificata è detta fosfoproteina ed assume carica negativa.
• Acetilazione e metilazione: consistono, rispettivamente, nell'addizione di un gruppo acetile e uno metile, in genere sul gruppo amminico al termine della catena alchilica della lisina, che prende il nome si acetilisina.
• Glicosilazione: consiste nell'aggiunta di una catena laterale di carboidrati, con formazione delle glicoproteine. In genere, esse hanno funzione di trasporto delle altre proteine.

Il legame peptidico

Gli α-amminoacidi si uniscono mediante l'eliminazione di una molecola d'acqua, a seguito della quale il C e l'N si legano con un legame chiamato legame peptidico. Si forma così lo scheletro, mentre il resto della molecola forma dei residui amminoacidici. Le molecole che si sono unite presentano una direzionalità, con un gruppo amminico N-terminale ed uno carbossilico C-terminale. Il successivo allungamento avviene nella direzione che va da N a C. Di conseguenza, nelle proteine a più di due amminoacidi, gli amminoacidi intermedi non presentano né il gruppo amminico né carbossilico.

Il legame peptidico ha una lunghezza che varia tra quella di un legame semplice e quella di uno doppio, e non permette la rotazione. Se sono presenti due residui si parla di dipeptidi, se sono tre sono tripeptidi, da tre a dieci sono oligopeptidi ed oltre sono polipeptidi. Il numero possibile di proteine è praticamente infinito: solo nel caso dei dipeptidi sono possibili 20x20 = 400 dipeptidi diversi.

Conformazione delle proteine

Le proteine hanno un ruolo fondamentale nei processi biologici: possono essere enzimi catalizzatori, messaggeri chimici, ormoni, recettori di ormoni, possono trasportare importanti sostanze biologiche e generare il movimento delle fibre muscolari. Alcune proteine come la rodopsina ricevono gli stimoli luminosi, altre come le immunoglobuline partecipano alle attività del sistema immunitario. Possono partecipare alla formazione delle ossa, dei tendini o altro come collageno. Ma innanzitutto, le proteine sono il prodotto dell'informazione genetica.

Le funzioni delle proteine sono dunque molteplici, e possono essere scoperte a partire dallo studio della loro struttura:

• Struttura primaria: è la sequenza amminoacidica della catena.
• Struttura secondaria: è l'organizzazione spaziale dello scheletro della catena senza contare i gruppi laterali. In genere si tratta di eliche e foglietti.
• Struttura terziaria: si riferisce alla struttura 3D di una catena polipeptidica intera.
• Struttura quaternaria: è l'organizzazione strutturale di più subunità (più catene polipeptidiche), che porta alla formazione di proteine multimeriche.

Una proteina può inoltre essere formata da vari domini, ossia da regioni relativamente indipendenti. A volte il dominio corrisponde ad un sito ad attività particolare nella proteina, come un'azione catalitica o la possibilità di legare un ligando specifico. È possibile che un dominio rappresenti un'unità evolutiva, cioè che possa aver avuto origine come polipeptide indipendente e poi si sia associato ad altri polipeptidi simili.

La struttura secondaria

La struttura secondaria di una proteina può essere descritta attraverso l'osservazione dei suoi legami covalenti e non. Tra quelli covalenti i più comuni sono i ponti disolfuro, S-S, che si stabiliscono fra due residui di cisteina (ognuno portante un gruppo –SH), che prende il nome di cistina. I legami non covalenti si dividono in quattro tipi: legami idrogeno, interazioni elettrostatiche, interazioni idrofobiche e forze di attrazione di Van der Waals. Si tratta di legami molto più deboli rispetto a quelli covalenti. La loro formazione è legata strettamente alla presenza dell'acqua.

Il legame H deriva dall'interazione elettrostatica tra un gruppo donatore debolmente acido (R-H) ed un atomo accettore con una coppia di elettroni spaiati (A). In questo modo, la carica dell'atomo di idrogeno è condivisa dai due atomi R-A. I legami H sono i principali responsabili della struttura ripiegata di una proteina, ed in pratica la differenza di energia libera di una proteina non ripiegata (denaturata) con una ripiegata (nativa), corrisponde all'energia fornita dai legami H. Un singolo legame non ha un'alta energia, anzi è debolissimo, ma poiché all'interno di una stessa molecola se ne formano numerosissimi, allora il bilancio finale è quello di un legame ad alta energia. Il legame H dispone la proteina in modo che possa formare il maggior numero possibile di legami H e quindi le dà una forma altamente specifica.

Poiché è difficile riuscire a calcolare esattamente le interazioni elettrostatiche, in quanto sono a largo raggio e coinvolgono anche molti atomi diversi, conviene osservare interazioni che avvengono al livello molto più semplice di coppie di gruppi di atomi. Ad esempio si può parlare di interazioni ioniche, dovute all'associazione di gruppi con carica opposta. Queste interazioni formano una coppia ionica o ponte salino. La loro forza dipende dalle circostanze. L'interazione ionica fra Na⁺ e Cl^- è altissima, ma se i due atomi si trovano in presenza di acqua, tenderanno a reagire più con quella che non fra loro (l'acqua, quindi, scherma gli atomi). La forza di legame fra i due atomi, a questo punto, risulterà simile al debole legame idrogeno.

Di conseguenza, visto che l'ambiente organico è spesso acquoso, non sono le coppie ioniche a stabilizzare la struttura di una proteina. Sono invece le deboli interazioni dipolo-dipolo che finiscono con lo stabilizzare la proteina. Questo perché i gruppi carbonilici e ammidici dello scheletro peptidico sono strutture a dipolo permanente. Un dipolo permanente è poi in grado di indurre un momento dipolare in un gruppo vicino (a causa dello spostamento dei suoi elettroni: dipolo indotto), e generare un'altra forza attrattiva. I dipoli indotti quindi coinvolgono anche gruppi che di per sé non avrebbero momento dipolare. Questi, a loro volta, dopo essere stati indotti possono indurre un debole dipolo in una molecola adiacente simile (forze di dispersione di London).

Effetto idrofobico è il nome dato a quelle interazioni che tendono a diminuire il contatto con l'acqua delle sostanze non polari, inducendo la formazione di micelle in soluzioni acquose. Naturalmente anche questi effetti hanno un ruolo estremamente significativo nella struttura delle proteine, in quanto danno alle proteine globulari la tipica forma a micella. In presenza di una zona non polare all'interno di una molecola posta in acqua, la parte non polare tende a rannicchiarsi in una cavità, in modo che lo spazio che occupa sia minore di quello che occuperebbe se fosse distesa sulla superficie. Visto che i legami H devono essere sempre formati nel numero maggiore possibile, le molecole d'acqua tendono a riarrangiarsi in modo da formare legami H tra di loro, e dunque assumono una forma differente, che le porta a formare un reticolo attorno alla zona non polare.

Si è osservato che una proteina accetta molto più frequentemente la mutazione di una catena polare esterna che non quella di una idrofobica interna: in pratica, questo prova che il ripiegamento delle proteine è guidato principalmente da forze idrofobiche. Le forze di Van der Waals entrano in gioco solo su distanze molto ravvicinate, ogni volta che si verifica una qualsiasi attrazione fra due atomi. Allo stesso modo dei legami idrogeno, singolarmente non si tratta di forze rilevanti, viceversa lo sono se considerate globalmente in una macromolecola.

La struttura terziaria

La struttura terziaria di una proteina è, in pratica, formata da associazioni di zone a struttura secondaria che donano alla proteina una specifica forma tridimensionale. Se una catena polipeptidica forma, grazie alla presenza dei legami idrogeno, sempre lo stesso angolo α tra i suoi carboni dà origine ad un'elica. In un'elica, i legami idrogeno si formano fra gruppi C=O e N-H posti a quattro residui di distanza lungo lo scheletro della catena. Un'elica è caratterizzata dal numero di unità peptidiche n per giro dell'elica, e dal passo p, la distanza che percorre un giro completo dell'elica lungo il suo asse. Essa può essere destrorsa o sinistrorsa: un'elica è destrorsa quando gira nella direzione che le dita della mano destra seguono quando la mano si chiude sull'asse dell'elica e il pollice è posto nella direzione dell'elica che cresce. Un tipo particolare di elica è l’α-elica, la forma della molecola di DNA.

Un altro tipo di struttura terziaria è il foglietto β, che utilizza i legami idrogeno non per legare parti interne della propria catena, ma per legarsi con altre catene vicine. Le catene laterali si estendono alternativamente ai lati opposti del foglietto. Ogni catena può assumere la forma di catena estesa, di elica, di foglietto o una forma globulare (scritte in ordine di dimensioni decrescenti). La possibilità di modificare così fortemente la propria conformazione dipende dalla capacità degli atomi di ruotare attorno ai singoli legami covalenti. Di conseguenza, per passare da una struttura all'altra basta rompere e riformare i deboli legami non covalenti. Sempre grazie alla debole energia dei legami non covalenti, una proteina può attaccarsi ad altre strutture. Una piccola molecola che si lega ad una proteina viene detta ligando.

Come le proteine si ripiegano nella struttura corretta

Il ripiegamento avviene nell'arco di qualche secondo, e viene chiamato ripiegamento sequenziale, perché implica la formazione di intermedi altamente instabili. Il processo inizia con il collasso delle catene laterali idrofobiche all'interno del core della proteina (il suo nucleo interno). Quindi si formano le strutture secondarie ed infine le terziarie, più lentamente. Sembra che il processo sia cooperativo, per cui la formazione di una struttura secondaria in una determinata zona, favorisce la formazione di un'altra struttura nella zona adiacente.

È più facile notare il meccanismo di passaggio dalla forma ripiegata a quella distesa di una proteina eseguendo la sua denaturazione: questo processo comporta infatti la rottura di tutti i legami tranne i ponti disolfuro ed i legami fra gli amminoacidi, in modo che sia possibile osservare la struttura primaria della proteina. In genere una proteina denaturata non subisce danni e può tornare nella sua conformazione ripiegata. In altri casi, invece, il processo inverso non è più possibile, magari perché la conformazione attiva della proteina si poteva formare solo durante la fase di sintesi, senza l'interferenza delle zone ancora non sintetizzate.

Affinché la proteina raggiunga la sua corretta conformazione, spesso deve essere presente un cofattore (come il gruppo eme dei citocromi, che lega il Fe). I cofattori possono essere enzimi catalitici o fattori che, grazie alla loro stechiometria, riescono a dirigere il ripiegamento di altre proteine (chaperoni molecolari). Gli chaperoni formano dei complessi con la proteina in ripiegamento, ma non fanno parte della struttura matura. Servono ad impedire che avvengano dei ripiegamenti sbagliati sia durante la formazione della proteina, sia dopo che questa è stata denaturata. Lo chaperone, in pratica, si avvolge attorno ai siti che potrebbero dare origine ad associazioni scorrette, schermandoli dal resto della catena. La sua azione è fortemente ATP-dipendente.

Gli chaperoni intervengono anche durante il trasporto delle proteine fuori dal citoplasma: ovviamente non gli è possibile attraversare la membrana in forma ripiegata e gli chaperon le aiutano a mantenersi distese. La formazione dei ponti disolfuro, invece, dipende più che altro dall'ambiente: la maggior parte delle proteine citoplasmatiche non possiede ponti disolfuro, viceversa per quelle extracellulari. La formazione dei ponti è aiutata da un enzima, la PDI (proteina disolfuro isomerasi).

Proteine allosteriche

I cofattori sono anche in grado di modificare la conformazione della proteina già ripiegata, che in questo caso viene definita allosterica (perché ha più di una forma). Le proteine allosteriche possiedono un sito attivo a livello del quale avviene una reazione catalitica, ed un sito che lega l'effettore allosterico, modo in cui viene chiamato il cofattore in queste situazioni. I due siti sono altamente specifici, in genere a forma di conca, in modo che le catene laterali dei loro amminoacidi si leghino in maniera specifica al ligando.

Quando l'effettore allosterico si lega al proprio sito, determina una modificazione nella conformazione del sito attivo che, riarrangiando i suoi legami idrogeno, diviene in grado di legare il substrato. Le proteine allosteriche hanno un ruolo importante sia nella regolazione metabolica che in quella genetica. Ad esempio, possono inibire la formazione di altri prodotti metabolici mediante un meccanismo di inibizione a feedback o retroinibizione, in cui la proteina allosterica va a legarsi all'enzima che catalizza la catena di produzione, bloccandola. Una proteina allosterica può essere fondamentale per il funzionamento biologico.