Riassunto di citoistochimica

Laboratorio di Citoistochimica

Potere di risoluzione: si definisce potere di risoluzione la distanza minima che deve

➔ esserci tra due oggetti per essere visti come distinti.

L’occhio ha un potere risolutivo di 0,1 mm;

◆ Il microscopio ottico ha un pot. ris. di 0,25 micron;

◆ Il microscopio elettronico ha un pot. ris. di 0,5 nanometri (nm).

◆

Il potere risolutivo di uno strumento determina il massimo livello di dettaglio che si

➔ può ottenere nell’immagine.

Preparazione del materiale istologico

La luce del microscopio può attraversare solo materiale di spessore molto ridotto;

● proprio per questo il tessuto deve essere sezionato mediante speciali strumenti, detti

microtomi.

La maggioranza dei tessuti biologici sono molli, pertanto, prima del taglio, il tessuto

● dev’essere indurito tramite fissazione (es: aldeidi), inclusione o tramite

congelamento.

Prima dell’osservazione al microscopio, il tessuto dovrà essere colorato; coloranti con

● affinità per componenti cellulari e tissutali diverse possono essere combinati nella

stessa sezione istologica.

Fasi di una tipica procedura istologica

1) Fissazione di un campione di tessuto in formaldeide;

2) (Eventuale congelamento);

3) Inclusione del pezzo;

4) Taglio al microtomo;

5) “Immersione” in soluzioni coloranti;

6) Montaggio su vetrino;

7) Osservazione al microscopio.

​

Striscio di sangue: è una delle tecniche istologiche più diffuse; consente lo studio

● microscopico delle cellule del sangue e si distingue dal protocollo generico perchè

non richiede il taglio al microtomo del tessuto.

Tipologie di microscopi

A contrasto di fase;

● Ad interferenza;

● In campo scuro;

● A luce polarizzata;

● A fluorescenza;

● Confocale;

● Elettronico:

● a trasmissione;

○ a scansione.

○

Preparazione dei campioni biologici

​

1. Prelievo

:

a. Operazione fisica con la quale si ottiene il campione da esaminare;

b. Deve essere eseguito su materiale biologico vivente;

c. Deve essere eseguito il più velocemente possibile e con la massima precisione

e cura per il campione onde evitare artefatti;

d. Dimensioni:

i. Microscopia ottica: 10 x 10 x 3 mm

ii. Microscopia elettronica: spessore ≤2 mm

​

2. Fissazione

:

a. Ha lo scopo di bloccare i processi degenerativi del tessuto prelevato,

rendendolo stabile nel tempo ed inalterabile all’azione dei trattamenti

successivi;

b. Mantiene inalterate le caratteristiche strutturali del campione, preservandone

la morfologia;

c. Protegge il campione da eventuali danni osmotici.

d. Fissazione fisica: esposizione del tessuto a t° molto alte o molto basse:

i. Congelamento in N​ o -30 C°;

​

2

ii. Calore: fiamma viva per materiale biologico strisciato su vetrino; può

alterare le strutture cellulari interne.

e. Fissazione chimica: impiegata per l’osservazione delle strutture intracellulari;

uso di sostanze chimiche:

i. Perfusione;

ii. Immersione;

iii. Con vapori.

f. La fissazione determina la morte immediata della cellula, preservandone la

struttura protoplasmatica;

g. Inattiva gli enzimi litici, preservando le strutture cellulari dall’autolisi;

h. Rende le strutture cellulari insolubili, facendo precipitare le proteine ed altri

costituenti chimici;

i. Preserva i campioni dall’attacco di muffe e batteri.

j. Metodi di fissazione alternativi:

i. Criostato:

1. congelamento del tessuto tramite immersione in N​ liquido

2

(-196 C°);

2. taglio del pezzo congelato con il criostato (-20 C°);

3. colorazione a t° ambiente.

ii. Il congelamento permette di conferire al campione istologico una

rigidità tale da consentire l’allestimento di sezioni sottili, permettendo

inoltre di stabilizzare le strutture cellulari e di mantenere inalterate le

caratteristiche di antigenicità del tessuto.

k. Classificazione dei fissativi chimici:

i. Aldeidi (es: formaldeide);

ii. Alcoli (es: etanolo);

iii. Acidi organici e minerali (es: acido acetico, tricloroacetico, picrico,

cromico);

iv. Sali di metalli pesanti (es: bicromato di potassio, cloruro di mercurio).

v. La formaldeide e l’etanolo vengono usati singolarmente, mentre le

ultime due classi sono sempre usate in miscele di fissazione, insieme

ad altri composti.

l. Le aldeidi

i. Formaldeide:

1. Usata in soluzione (4-10%) in tampone a pH 7,4;

2. Elevato potere di penetrazione (0,8 mm/h);

3. Agisce formando legami crociati con gli amminoacidi delle

proteine (legami reversibili);

4. Preserva una buona morfologia;

5. Non provoca un indurimento eccessivo dei tessuti;

6. Non dissolve i lipidi ed è possibile mantenere per varie ore i

preparati immersi;

7. Viene usata in soluzione acquosa, chiamata formalina,

normalmente utilizzata a concentrazioni tra 4-10%;

8. Le soluzioni devono essere tamponate a pH 7-7,4 ond’evitare

interferenze e danni alla morfologia tissutale;

9. Molto tossica per la salute umana, quindi necessita di

particolari precauzioni.

ii. Paraformaldeide:

1. Preserva la reattività delle macromolecole;

2. Indicata per indagini biochimiche.

iii. Glutaraldeide:

1. Penetra bene i tessuti, ma meno rapidamente della

formaldeide;

2. Forma legami crociati più velocemente e più stabili della

formaldeide;

3. Non fissa i lipidi, quindi per preservare le membrane si deve

fare una post-fissazione con Osmio Tetrossido.

iv. Osmio Tetrossido:

1. Fissa i lipidi insaturi;

2. Agisce rapidamente, ma penetra molto poco;

3. Reagisce in modo differente con i vari componenti cellulari,

accentuando le differenze di densità e fornendo una sorta di

colorazione.

m. Gli alcoli

i. Etanolo:

1. Usato in concentrazioni tra 70 e 100%;

2. Fissativo generale piuttosto blando;

3. Indurisce in modo eccessivo il materiale biologico sottoposto

alla sua azione;

4. Fa precipitare le proteine, denaturandole ed annullando quasi

totalmente la reattività enzimatica.

n. Acidi organici

i. Acido acetico (CH​ COOH):

3​

1. Usato sempre in miscele;

2. Ha un eccellente potere di penetrazione;

3. Non solubilizza i grassi, ma altera la struttura dei mitocondri.

ii. Acido tricloroacetico (CCl​ COOH):

3​

1. Usato sempre in miscele;

2. Possiede caratteristiche molto simili all’acido acetico.

iii. Acido picrico:

1. Usato sempre in miscele;

2. Eccellente stabilizzatore proteico;

3. Ha un colore giallo.

iv. Acido cromico:

1. Usato sempre in miscele;

2. Precipita drasticamente le proteine;

3. Usato a concentrazioni molto ridotte.

o. Sali di metalli pesanti

i. Bicromato di potassio (K​ Cr​ O​ ):

2​ 2​ 7​

1. Usato sempre in miscele;

2. Migliora la stabilizzazione del citoplasma;

3. Spiccata affinità per i fosfolipidi di membrana;

4. I lavaggi post-fissazione devono essere accurati, per evitare la

formazione di ossido di cromo che può interferire nelle fasi

successive.

ii. Cloruro di mercurio (HgCl​ ):

2​

1. Usato sempre in miscele;

2. Eccellente stabilizzatore delle proteine;

3. Penetra rapidamente ma poco profondamente;

4. Usato in campioni di piccole dimensioni.

p. Miscele di fissazione

i. Liquido di Boulin:

1. Elevatissima capacità di penetrazione;

2. Particolarmente indicato nel trattamento di pezzi anche

voluminosi;

3. E’ una miscela di acido picrico, acido acetico e formalina.

ii. Liquido di Carnoy:

1. Miscela di etanolo, cloroformio ed acido acetico;

2. Usato per fissare cellule isolate.

q. Variabili che influenzano il tempo di fissazione:

i. Rapporto corretto fra volume del pezzo e quantità di fissativo;

ii. Opportuno spessore delle sezioni;

iii. Composizione chimica del tessuto;

iv. Temperatura del fissativo;

v. Procedure di accelerazione della fissazione;

vi. La penetrazione della formalina può essere accelerata con l’uso di

mezzi fisici, spesso accoppiati al calore, quali il vuoto od onde sonore a

bassa frequenza (micro-onde).

r. L’effetto più rilevante di un fissativo sta nella sua capacità di denaturare le

proteine cellulari e nel rendere insolubili altri componenti cellulari:

i. Coagulazione delle proteine: i gruppi idrofili delle proteine perdono

contatto con l’acqua e, formando nuovi legami tra loro, tendono ad

escludere quest’ultima;

ii. Alcuni fissativi (formalina, osmio) possono portare alla gelificazione

delle proteine, favorendo la stabilizzazione della loro struttura con la

formazione di ponti metilenici (formalina) o d’altro tipo, creando così

una rete tridimensionale.

​

​

3. I tamponi

:

a. I fissativi devono essere diluiti in tamponi a pH 7-7,4, in modo che non vi sia

diversità di pH tra il tessuto e la soluzione fissativa e per evitare artefatti

dovuti a differenze di osmolarità.

b. Tamponi maggiormente utilizzati:

i. PBS (Phosphate Buffered Saline solution);

ii. Tampone fosfato di Sorensen:

1. Fosfato bisodico 0.2 M + HCl 0.2 M;

iii. Tampone Cacodilato:

1. Cacodilato di Na 0.24 M + HCl 0.2 M;

2. Più stabile nel tempo, ma contiene arsenico.

​

4. Lavaggio

:

a. Dopo la fissazione i preparati devono essere lavati accuratamente con acqua

corrente, a parte quelli fissati con fissativi contenenti acido picrico e

bicromato di potassio;

b. L’operazione viene eseguita per rimuovere l’eccesso di fissativo che, non

avendo interagito con i componenti tissutali, è rimasto all’interno dei

campioni, e che potrebbe interagire con i reagenti impiegati nelle fasi

successive.

5. Disidratazione:

a. Prima di essere sezionati, i campioni devono essere infiltrati con mezzi

opportuni (paraffina, resine varie) che, solidificando, includono il materiale al

loro interno, consentendone il successivo sezionamento;

b. Tali sostanze includenti sono idrofobiche e, quindi, non possono infiltrare i

campioni contenenti acqua nei propri tessuti o cellule;

c. Sarà quindi necessario procedere con la disidratazione dei campioni, per

sostituire l’acqua con un mezzo che sia miscibile con le sostanze d’inclusione;

d. Può essere attuata mediante l’utilizzo di solventi organici, specialmente alcol

etilico;

e. Scala degli alcoli:

i. Etanolo 50%;

ii. Etanolo 70%;

iii. Etanolo 80%;

iv. Etanolo 95%;

v. Etanolo 100%;

f. I tempi della disidratazione possono variare in base alle dimensioni del

campione.

g. Chiarificazione:

i. Dal momento che l’etanolo non è miscibile con la sostanza che dovrà

infiltrarlo nella fase d’inclusione (paraffina), occorre sostituire

l’etanolo con un solvente intermedio che sia miscibile sia con l’etanolo

che con la paraffina;

ii. Il processo della chiarificazione rende più trasparenti i campioni;

iii. Gli agenti di chiarificazione maggiormente impiegati sono lo xilolo, il

toluene, il benzolo ed il cloroformio:

1. Xilolo: sostituisce rapidamente l’etanolo ed indurisce molto il

campione;

2. Toluene: sostituisce rapidamente l’etanolo ed indurisce

mediamente il campione;

3. Benzolo/Cloroformio: sostituiscono lentamente l’etanolo ed

induriscono poco il campione.

iv. Nella pratica comune, si immergono i campioni (disidratati in etanolo)

in: 1. Etanolo/Xilolo (50%/50%);

2. Xilolo puro (100%).

6. Inclusione:

a. Passaggio che consente la permanenza del pezzo chiarificato nel mezzo

d’inclusione per un tempo sufficiente a consentirne la penetrazione;

b. Procedura che consente di preparare il tessuto in modo tale da ottenerne

sezioni di spessore adatto al tipo di osservazione.

c. I principali mezzi utilizzati per l’inclusione sono:

i. Celloidina:

1. Impiegata per l’inclusione di pezzi di grandi dimensioni o di

organi particolarmente delicati (cervello);

2. Nota anche come nitrocellulosa o colloidone;

3. Miscela di mono e di-nitrocellulosa;

4. Utilizzata in soluzioni di etanolo o etere etilico.

ii. Paraffina:

1. Maggiormente utilizzata in microscopia ottica;

2. Preparazione di blocchetti di materiale incluso;

3. Miscela di idrocarburi saturi ad elevato peso molecolare,

insolubili sia in acqua che in etanolo; per questo occorre la fase

di chiarificazione tramite xilolo;

4. Miscela di idrocarburi alifatici C​ H​ ;

n​ 2n+2​

5. A t° ambiente è allo stato solido, ma diventa liquida se portata

a t° tra i 35 °C e i 70 °C;

6. Prima del suo utilizzo, dev’essere sciolta e filtrata per eliminare

eventuali impurità;

7. Per aumentarne la durezza spesso si utilizzano paraffine con

composti plastici, le quali presentano infiltrazioni ottimali e

maggiore consistenza al taglio.

iii. Metacrilati e resine epossidiche:

1. Epon, Araldite;

2. Liquide a t° ambiente;

3. Polimerizzano a 60-70 °C;

4. Insolubili in acqua, ma solubili in acetone;

5. Si preparano a partire da soluzioni di monomeri e da sostanze

plasticizzanti che migliorano la consistenza finale del polimero,

e da un acceleratore chimico per la reazione di

polimerizzazione.

7. Inclusione:

a. Passaggio che permette d’impregnare il campione in un materiale abbastanza

duro ed omogeneo tale da poter essere tagliato in fette molto sottili;

b. Polimerizzazione:

i. Paraffina: t° 4 °C;

ii. Resina: 60-70 °C;

c. Le resine epossidiche (Epon ed Araldite) polimerizzano in modo omogeneo

con una eccellente conservazione della morfologia, ma a causa della loro

elevata reattività possono interagire con le strutture cellulari durante la

polimerizzazione;

d. I metacrilati polimerizzano in modo non uniforme e non co-polimerizzano

con i componenti cellulari. Possono causare una modificazione della

morfologia;

i. Il metil-metacrilato si usa per materiali duri, come ossa, midollo osseo

o denti;

ii. Il glicole metacrilato ha un’ottima capacità di penetrazione, e permette

l’inclusione di pezzi anche molto voluminosi.

8. Sezionamento:

a. Viene effettuato tramite l’utilizzo del microtomo:

i. Microtomo rotativo: usato in microscopia ottica;

ii. Ultramicrotomo: usato in microscopia elettronica.

b. Il principio di funzionamento è la presenza di un braccio oscillante su cui si

monta il blocchetto con il campione; esso, ad ogni oscillazione, scivola contro

la lama, sistemata con un angolo adatto per il sezionamento. Ad ogni

passaggio il braccio viene avvicinato alla lama di una distanza pari allo

spessore della sezione desiderata.

9. Sparaffinatura:

a. Eliminazione del materiale di inclusione;

b. Immersione in xilolo (100%) o xilolo/etanolo (50%/50%).

10. Reidratazione:

a. Scala degli alcoli inversa:

i. Etanolo 100%;

ii. Etanolo 95%;

iii. Etanolo 80%;

iv. Etanolo 70%;

v. Etanolo 50%;

vi. Acqua distillata.

11. Colorazione:

a. I coloranti sono a base acquosa, pertanto si elimina lo xilolo tramite passaggi

in etanolo;

b. Colorazione con un colore brillante di certe componenti tissutali;

c. Contro-colorazione del resto del tessuto con un colore contrastante.

d. Colorazioni:

i. Chimiche:

1. Reazione tra colorante e substrato;

2. Evidenziano molecole come zuccheri e lipidi;

3. Olio Rosso (O.R.O.):

a. Olio Rosso disciolto in soluzione di alcool etilico ed

etere;

b. L’alcool etilico e l’etere estraggono i lipidi dalle cellule,

e l’Olio Rosso si deposita al loro posto.

4. P.A.S.:

a. Usato per gli zuccheri;

b. Acido periodico di Schiff, ossida i gruppi CHOH-CHOH

degli zuccheri;

c. Reagisce con il composto fucsina-acido solforoso e

conferisce una colorazione fucsia.

ii. Fisiche:

1. Precipitazione di metalli sulle strutture biologiche;

2. Es: impregnazione argentica:

a. Sali d’argento + sostanza riducente liberazione di Ag

→

metallico che si deposita sulle strutture biologiche

argentofile (come le fibre nervose).

iii. Chimico-fisiche:

1. Meccanismo di assorbimento elettrico;

2. Il substrato ed il colorante hanno cariche diverse e formano sali

fra loro;

3. Ematossilina/Eosina:

a. Ematossilina: affinità per le molecole cariche

negativamente (DNA, RNA ed alcune proteine);

b. Eosina: affinità per molecole cariche positivamente

(proteine del citosol).

c. Se una porzione di tessuto o di una cellula si colora di

blu/porpora, viene detta basofila;

d. Viene colorata dall’ematossilina;

e. Nuclei e ribosomi generalmente sono basofili.

f. Se una porzione si colora di rosso/arancio/rosa, viene

detta acidofila;

g. Viene colorata dall’eosina;

h. Spesso sono proteine del citosol:

i. I fluidi presenti nei tessuti o negli spazi interstiziali non

si colorano con Ematossilina/Eosina (sangue, linfa…);

j. Si riconoscono queste zone come ampi spazi bianchi;

k. Anche i lipidi non si colorano.

l. Colorazione eosina/ematossilina:

i. Ematossilina (2-10 minuti);

ii. H​ O distillata (pre-lavaggio);

2​

iii. H​ O corrente (post-lavaggio);

2​

iv. Eosina (30 secondi-1 minuto);

v. H​ O distillata (lavaggio finale).

2​

4. Reazione PAS (Acido Periodico di Schiff):

a. Evidenzia i carboidrati;

b. Usata per sostanze ricche di zuccheri;

c. Pre-trattamento con acido periodico, che fa ossidare i

gruppi 1,2-glicol degli zuccheri in gruppi aldeidici);

d. Colorazione dei gruppi aldeidici con il reattivo di Schiff