Riassunto di citoistochimica

AEC:

◆ Non cancerogena;

● Origina un precipitato rossiccio solubile nei solventi organici.

● Fosfatasi alcalina:

➔ Si ottiene dall'intestino di bue;

◆ I substrati sono gli esteri fosforici α-naftilfosfato e naftanolo AS-TR fosfato;

◆ Il cromogeno è un sale di tetrazolio;

◆ Conferisce una colorazione rossa.

◆ Inibizione di enzimi endogeni

Alcuni enzimi utilizzati come traccianti possono essere presenti nel tessuto da analizzare;

È necessario inibire l'enzima endogeno senza danneggiare le proprietà antigeniche.

● Blocco delle reazioni non specifiche:

Saturazione dei siti di legame aspecifici:

● Siero di vitello (FCS);

○ Siero Albumina Bovina (BSA), 2-5% per 20-30 minuti;

○ Siero non immune per 10-20 minuti.

○ Blocco della perossidasi endogena:

● H​ O​ allo 0,3% per 5-30 minuti;

○ 2​ 2​4 parti di metanolo e 1 di H​ O​ al 3%.

○ 2​ 2​Blocco della fosfatasi alcalina endogena:

● Acido acetico al 20% per 15 minuti a 4°C.

°C.○Trattamento del materiale

I campioni bioptici da sottoporre ad indagini immunoistochimiche vengono trattati● secondo le normali procedure per l’allestimento delle sezioni per la diagnosticaistomorfologica, cioè:

Fissazione:

• Preserva le proprietà antigeniche;
• Mantiene le molecole antigeniche nella loro posizione originale.

Disidratazione e chiarificazione;

Inclusione in paraffina;

Taglio al microtomo.

Procedure di ripristino dell’antigenicità

I processi a cui sono sottoposti i campioni dal momento del prelievo all’effettuazione● della reazione possono danneggiare l’antigenicità, rendendo:

• Inaccessibile l’antigene all’anticorpo;
• Modificando parzialmente l’antigenicità;
• Modificando in modo irreversibile l’antigenicità.

La reattività immunologica può essere ripristinata rompendo i legami crociati formati● dalla formalina con un trattamento enzimatico

Il testo formattato con tag HTML sarebbe il seguente:

o con alte temperature.

Trattamento enzimatico:

• Gli enzimi proteolitici rompono i legami aldeidici rendendo i siti antigenici disponibili per il relativo anticorpo;
• Quelli maggiormente utilizzati sono:
  • Pepsina;
  • Proteasi XXIV;
  • Tripsina;
  • Proteinasi K.
• L'incubazione con uno di questi enzimi può avvenire a temperatura ambiente o a 37 °C per un periodo temporale variabile (5-30 minuti), edipende:
  • Dalla concentrazione;
  • Dalla durata della fissazione;
  • Dallo spessore della sezione;
  • Dal tipo di enzima.

Trattamento termico:

• Effettuato tramite:
  • Forno a microonde;
  • Pentola a pressione;
  • Bagno termostatato;
  • Autoclave.

PCR (Polymerase Chain Reaction)

Componenti della reazione di PCR:

• Sequenza di DNA target;
• DNA-polimerasi termostabile (Termophilus aquaticus, Taq-Polimerasi);
• Due oligonucleotidi (15-25 bp) specifici per la sequenza target;
• dNTPs.

Cicli termici:

1. Denaturazione (94-96 °C);
2. Annealing (50-65 °C);
3. ...

PCR e possono essere separati utilizzando l'elettroforesi. Estensione (72 °C). Il processo di duplicazione non procede all'infinito, poiché esso è limitato da: ● quantità dei primers; ○ attività della Taq-Polimerasi; ○ reannealing dei filamenti. ○ "Effetto plateau": resa effettiva. ➔ Raggiunto il plateau, non si osserva più un incremento nei prodotti di reazione. ● n​Resa teorica: 2​ ; ● n​P= (2)​ T: ○ Il prodotto (P) incrementa esponenzialmente con il numero di cicli di ■ PCR (n); Il prodotto di PCR dipende da T, numero di copie di template di ■ partenza. RT-PCR convenzionale Retrotrascrizione dell'RNA in cDNA: ● Oligo d(T); ○ Random esameri; ○ Primer specifico per il gene. ○ Amplificazione del cDNA tramite PCR: ● Tradizionale reazione multiciclica suddivisa in 3 fasi: ○ Denaturazione; ■ Annealing; ■ Estensione. ■ Separazione elettroforetica dei prodotti di PCR (ampliconi): ● Gli ampliconi sono ottenuti dopo uno specifico numero di cicli di

amplificazione;Vengono fatti migrare su un gel di agarosio.

Vantaggi:

• Velocità e facilità d'uso:
• In poche ore si possono ottenere milioni di copie della sequenza di DNA target;
• Sensibilità:
• Virtualmente è possibile utilizzare il DNA di una singola cellula come template (contaminazione);
• Robustezza:
• Amplificazione possibile anche utilizzando DNA di bassa qualità.

Svantaggi:

• Solo sequenze note:
• È necessario conoscere la sequenza del DNA da amplificare per sintetizzare i primers;
• Dimensioni e quantità limitate:
• Dimensioni medie dell'amplicone (0,1-5 kb);
• Quantità limitata rispetto alle tecniche di clonaggio;
• Proofreading:
• Taq-Polimerasi manca dell'attività 3' 5' esonucleasica;
• 20 cicli di reazione su un frammento di 1 kb produrranno circa il 40% di frammenti con una mutazione puntiforme.

PCR Real-Time:

Misura l'amplificazione in tempo reale

durante la fase esponenziale della PCR, quando l'efficienza d'amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati rispetto alla PCR tradizionale "end point". RT-PCR quantitativa Rilevamento della fluorescenza associata all'amplificazione; - Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosio; - Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computer. Chimiche fluorescenti della RT-PCR La fluorescenza si genera durante la PCR per effetto di diverse possibili reazioni chimiche; Le chimiche principali sono basate sia sul legame di coloranti fluorescenti che si intercalano nella doppia elica di DNA (SYBR Green), sia sull'ibridazione di sonde specifiche. SYBR Green: - Utilizza una molecola fluorescente non specifica che si lega al solco minore del DNA; - All'inizio del processo di amplificazione, la miscela di reazione contiene il DNA denaturato.

primers e la molecola fluorescente;

Dopo l'annealing dei primers, si legano poche molecole fluorescenti a doppia elica;

Durante l'estensione si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all'aumento del numero di copie dell'amplicone.

Vantaggi:

• Metodica semplice:
• Possibilità di utilizzare primers in uso in qualitativa;
• Poco costosa;
• Non-specifica:
• La molecola fluorescente si lega casualmente a tutte le doppie eliche, includendo i dimeri di primers;
• E' necessario ottimizzare la metodica per evitare la formazione di prodotti aspecifici.

Curva di dissociazione:

Dopo l'amplificazione, i campioni vengono riscaldati e la variazione dell'energia di fluorescenza viene monitorata per generare una curva di dissociazione.

Sonde TAQ-MAN

La RT-PCR si può realizzare mediante l'impiego:

• Coloranti intercalanti:
• SYBR Green;
• Si legano in maniera aspecifica a tutto il DNA;
• Sonde d'ibridazione:

Specifiche per il frammento d'interesse:

• Marcate con molecole fluorescenti.
• Esistono diversi tipi di sonde:
• Dual-Labeled (sonde Taq-Man);
• Molecular beacons;
• Scorpion;
• Sonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer).
• Sonda TAQ-MAN è un oligonucleotide che, come i primers della PCR, viene disegnato per essere complementare alla sequenza bersaglio da amplificare;
• La sonda è disegnata in modo da ibridarsi all'interno del frammento amplificato nella reazione di PCR.
• Presenta all'estremità 5' un fluoroforo "Reporter" ed all'estremità 3' una molecola "Quencher":
• 5' Reporter (R): fluorocromo ad alta energia che emette fluorescenza;
• 3' Quencher (Q): fluorocromo a bassa energia che spegne la fluorescenza del Reporter;
• Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di R perché i fotoni di R vengono assorbiti da Q.

Applicazioni dellala manipolazione e lo studio delle cellule in condizioni controllate;● Forniscono un modello sperimentale per studiare processi biologici;● Consentono la produzione di grandi quantità di cellule per scopi di ricerca o➔ applicazioni terapeutiche;● Sono utilizzate per testare l'efficacia di farmaci e terapie;● Consentono lo studio dei meccanismi di malattie e lo sviluppo di nuove➔ terapie;● Sono utilizzate per la produzione di vaccini e prodotti biotecnologici;● Consentono lo studio dell'interazione tra cellule e agenti patogeni o tossici;● Sono utilizzate per la produzione di tessuti e organi artificiali in ambito di➔ medicina rigenerativa;● Consentono lo studio dell'effetto di fattori ambientali sulle cellule.l'analisi dei meccanismi cellulari e molecolari del fenomeno in esame; ● Controllo ambientale; ● Economicità e rapidità di risposta; ● Disponibilità. ● Svantaggi: Sistemi semplificati rispetto ad un organismo integrato; ● Condizioni di esposizione alle sostanze diverse da quelle in vivo; ● Difficoltà di correlare le concentrazioni in vitro con quelle in vivo; ● Le sostanze inoculate possono interagire con il terreno di coltura. ● Esempi di indagine Ambito Controllo della crescita e del metabolismo, Biologia cellulare analisi del differenziamento ed ingegneria tessutale (coltura e produzioni in vitro di porzioni di tessuto). Studio dei promotori e degli enhancer, di Biologia molecolare espressione genica e di interi genomi. Analisi dei mutanti e test di Genetica complementazione. Mappaggio, trasfezione con DNA esogeno. Diagnosi cliniche cariologiche. Citogenetica Caratterizzazione dei tumori. Oncologia Test di citotossicità. Farmacologia Produzione diproteine ricombinanti e di Immunologia
anticorpi monoclonali.
Tecniche sterili o asettiche
Attuate per impedire la contaminazione accidentale dovuta a microbi provenienti da
● fonti esterne;
Attuate per impedire la contami