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Riassunto di Biologia Molecolare (prof. Raugei)

Riassunto completo del corso di Biologia Molecolare tenuto dai prof. Raugei, Fiaschi e Meacci. Il documento è scaricabile in formato word, tali appunti sono sufficienti per superare brillantemente l'esame orale. Appunti basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni del professore.

Esame di Biologia molecolare docente Prof. G. Raugei

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differenziate smettono di proliferare ed entrano in senescenza replicativa e l’accorciamento del

telomero sembrerebbe indicare l’invecchiamento cellulare.

ERRORI

L’attività di proof reading delle polimerasi, porta l’errore a 10-7. Ci possono essere però errori che

sfuggono alle polimerasi, creando dei mismatch o errori dovuti a danni chimici-fisici o dovuti ai

trasposoni.

Mismatch repair: è l’appaiamento scorretto fra basi. Mut-s scorre sul filamento e riconosce la

distorsione. Mut L riconosce il gruppo metile vicino a MUt S e si lega e MUT H si lega in quella

zona, tagliando il filamento non metilato e creando quindi un nick. Una esonucleasi taglierà creando

un gap che verrà risintetizzato da dna pol e poi la ligasi legherà il tutto.

Tautomeria cheto-enolica: Le basi del DNA esistono in conformazioni diverse, chiamate tautomerie

che cambiano per la disposizione degli elettroni. Ognuna delle basi ha un tautomero principlae e vi

permane per la maggior parte del tempo. Può essere però che cambi conformazione mentre sta

passando la dna pol e quindi verrà stabilizzata una base diversa. La timina ha tautomeria cheto-

enolica poiché si ha un doppio legame fra N e C con formazione di un gruppo OH, un gruppo

donatore che può stabilizzare una guanina. L’adenina invece ha tautomeria ammino-imminica .

L’adenina se ha un doppio legame con l’NH2 in posizione 6 passa alla forma imminica e stabilizza

una citosina.

RER: riparazione per escissione di ribonucleotide può succedere che la dna polimerasi aggiunga

ribonucleotidi piuttosto che desossinucleotidi. In questo caso, il ribonucleotide rappresenta un punto

di debolezza del filamento. In questo caso interviene RNAasi H2 che è un’endonucleasi che

inserisce un nick, poi interviene una esonucleasi che fanil gap, una dna polimerasi che risintetizza e

una dna ligasi che lega le posizioni risintetizzate.

Mutazioni chimiche delle basi azotate:

• deaminazione citosina: NH2 sostituito da un doppio legame con l’ossigeno. Si stabilizza un

uracile. Riparazione per sito abasico. Ovvero un’endonucleasi con sito AP

(purinico/pirimidinico) taglia un lega,e N-glicosidico e toglie una base, poi una esonucleasi

forma un gap, dna pol e dna ligasi.

• Deaminazione adenina: diventa ipoxantina che stabilizza una citosina. Riparazione sito

abasico

• Deaminazione 5-metil citosina: si stabilizza una timina, non riparabile, consegue

silenziamento genico.

• Ossidazione guanina: diventa oxoguanina, stabilizza una timina

• Deaminazione guanina: diventa xantina, stabilizza una timina

• Metilazione guanina in posizione O6: diventa una O6- metilguanina che stabilizza una

timina. Riparazione diretta con metiltransferasi.

N.E.R: riparazione per escissione di nucleotidi: esempio i dimeri di timina. Questi si possono

riparare in due modi: 1) in presenza di luce, enzima fotoliasi che ripara direttamente il danno. 2)

sistema UVRA;B;C;D. UVR A in assenza di luce riconosce la distorsione. UVR B si lega ad A e fa

piegare il DNA. Poi interviene UVR C che è un’endonucleasi che inserisce due nick e infine

interviene UVR D che è un’elicasi che crea un gap, funzione simile alle esonucleasi e poi la dna

polimerasi risargirà il danno e una ligasi legherà.

Double strand Break e riparazione NHEJ: si verifica un nick su un filamento che è tanto vicino al

filamento complementare che sembra sia un taglio sul doppio filamento. Si ripara con il sistema

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NEHJ, riparazione fra terminali omologhi. 1)legame tra proteine KU e terminali liberi 2)appaiamento

di zone omologhe 3) ricostituzione con perdita di basi

Test di Ames

E’ un test che serve per indicare se una sostanza può indurre mutazioni. Fu effettuato con il ceppo

della Salmonella che è mutato per l’His-. In genere, i ceppi batterici sono in grado di produrre da soli

le sostanze necessarie, ma per via di alcune mutazioni possono perdere questa capacità e quindi

diventare ad esempio His- che se crescono in terreni di coltura senza istidina muoiono. Quindi, fu

preso il ceppo His- e messo su una piastra con agar e isitidina. Poi fu presa carta assorbente con la

sostanza e posta sulla piastra. La sostanza si diffonde in maniera inversamente proporzionale al

centro della piastra. Viene poi fatta un’impronta della piastra su un’altra piastra che non contiene

istidina e se ci sono delle colonie, vuol dire che quei ceppi sono diventati His +. Probabilmente una

retromutazione ha reso di nuovo il ceppo His+.

Trascrizione

Nei procarioti, trascrizione e traduzione sono accoppiate per rispondere velocemente agli stress

ambientali e anche perché nei procarioti abbiamo un genoma più corto e l’assenza del nucleo. Negli

eucarioti invece, se si ha trascrizione di un certo mRNA, non è detto che questo venga per forza

tradotto.

I geni strutturali sono quei geni che vengono trascritti e che sono compresi tra un promotore e un

terminatore. Non abbiamo la trascrizione simultanea di tutti i geni ma si parla di trascrizione per

singolo gene. Nei procarioti, abbiamo il promotore, questa sequenza ha delle sequenze consenso

ricche di A e T che nei procarioti si chiama Prignow box. E’ qui che verrà aperto il DNA. La RNA

polimerasi procariotica è solo una e ha un fattore, chiamato sigma, che riconosce due zone, una a

-35 basi dal punto in cui inizia la trascrizione e una a -10 basi di inizio dalla trascrizione. Il fattore

sigma si lega alla -35 e la -10 si apre. La RNA polimerasi non ha bisogno di inneschi e ha attività

processiva, e utilizzerà un solo filamento del DNA, mentre l’altro è detto filamento senso e ha la

stessa sequenza di basi dell’RNA neosintetizzato. Alla fine del gene, si ha una sequenza chiamata

terminatore. Nei procarioti, la terminazione si svolge così: viene sintetizzata una forcina con uno

stelo ricco in CG che presentano tre legami a H che sono stabili, seguita da una sequenza di poli-U.

La forcina è ingombrante e disturba il legame fra la RNA pol e il DNA. Quando poi la RNA pol

destabilizzata incotra poli-U, quella sequenza che è un punto di debolezza nel filamento, la rna pol

si stacca. Ci sono ache proteine, chiamate proteine rho, che possono aiutare a staccare la RNA

polimerasi con consumo di ATP.

Nei procarioti per la regolazione genica si parla di operoni, ovvero un insieme di geni che vengono

regolati in maniera coordinata. Infatti nei procarioti si parla di mRNA policistronico, ovvero un RNA

che può portare alla formazione di più proteine a partire dallo stesso mRNA. Furono studiati due

operoni: l’operone LAC e l’operone TRP. L’operone LAC si basa sul fatto che, in presenza di lattosio

sia abbia la trascrizione di quegli enzimi che servono alla sintesi del lattosio per ricavare energia (B

galattosidasi, permeasi) e che in assenza di lattosio non si abbia la trascrizione. Questo perché

l’operone LAC, nella regione a valle del promotore, presenta una regione chiamata operatore a cui

si lega il repressore quando non c’è lattosio. Se nel messo esterno invece si ha lattosio, il

repressore che ha più attività per il lattosio rispetto all’operatore, si lega al lattosio, cambia

conformazione e si stacca dall’operatore permettendo all’RNA polimerasi di trascrivere. Si possono

avere anche livelli di trascrizione basale, dovuti a un secondo messaggero L’AMPc, che deriva per

ciclizzazione dell’ATP tramite adenilato cilasi. Questa molecola, è inversamente proporzionale alla

quantità di glucosio. Questa molecola, inoltre è la responsabile del legame della proteina Cap al sito

CAP che permette la trascrizione dell’operone LAC. Quindi, ci possono essere più scenari possibili.

Potrebbero esserci alti livelli di glucosio, bassi livelli di AMPc, nessun legame fra proteina CAP e

sito cap, ma presenza di lattosio e quindi assenza di repressore; in questo caso però la trascrizione

non è efficace. Potrebbe esserci alti livelli di cAMP, bassi di glucosio, ma assenza di lattosio:

avremmo comunque il legame fra proteina CAP e sito CAP, ma il repressore sarebbe legato

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all’operatore e quindi niente trascrizione. Una trascrizione efficace quindi dell’operone LAc si ha

quando si hanno alti livelli di AMPc e presenza di lattosio.

L’operone TRP invece è l’operone che contiene il set di geni necessari per gli enzimi per sintetizzare

l’a.a TRP. Se abbiamo già alte concentrazioni di TRP, il TRP si lega al repressore, che si attiva e va

a legarsi all’operatore, in maniera tale da impedire la trascrizione. Se ci sono basse quantità di TRP,

il repressore è inattivo e si ha trascrizione.

La trascrizione eucariotica, invece, si differenzia principalmente da quella procariotica per la fase di

inizio e di terminazione. Nella fase di inizio, infatti abbiamo sempre il promotore con le sequenze

consenso ricche di A e T, questa regione si chiama TATA Box e si trova a -25 basi dall’inizio della

trascrizione. Qui, abbiamo TFIID che ha come subunità TFB che riconosce la TATA BOX. Poi arriva

l’RNA polimerasi con TFIIH e altri TF e tutti questi elementi formano un complesso chiuso. Ci sono

poi elementi di regolazione che influenzano i fattori di trascrizione e sono attivatori e repressori. Il

complesso del mediatore media fra attivatori / repressori e il complesso di trascrizione. L’RNA

polimerasi ha una coda che nel momento in cui inizia la trascrizione vera e propria, viene fosfrilata

da TRFIIH, sui residui di SER e TRE della coda della RNA pol. Poi, grazie a un’elicasi, si formerà un

complesso aperto. Ci sono molti elementi in Cis, quindi sul DNA, che vengono influenzati da

elementi o fattori in Trans rispetto al DNA. Esistono elementi basali in Cis, come la TATA BOX e altri

prossimali al promotore che influenzano l’attività rna pol e che sono sempre in cis come la CAAT

BOX e la GC BOOX. Ci sono anche elementi distali, distanti dal promotore, che potenziano la

trascrizione, come gli enhancer a cui si legano fattori in trans trascrizionali. Un esempio di questa

regolazione è quella degli ormoni lipofili. Gli ormoni lipofili, penetrano all’interno della cellula poiché

il loro recettore si trova nel citoplasma. Quando l’ormone si lega al recettore, questo cambia di

conformazione, diventa un fattore trascrizionale ed è capace di migrare nel nucleo legandosi ad un

enhancer. Un esempio di recettore del genere, è il GRE, che presenta 3 domini diversi, uno per

legarsi all’ormone, uno per legarsi all’enhancer e uno che agisce sul promotore, attivando la

trascrizione. Questa proteina è a forma di Zinc Finger, ovvero le cui dita sono ripiegate più volte e

presentano in ciascun dito cisteine che coordinano lo zinco bivalente.

La terminazione della trascrizione eucariotica, è diversa da quella procariotica. Infatti la formazione

dell’estremità 3’ sembra essere attribuita a un’endonucleasi. Sembra che alla fine dell’mRNA ci sia

una sequenza detta di poliadenilazione . Questa sequenza viene riconosciuta da dei fattori che

effettuano un taglio per endonucleasi con formazione del 3’. Questa esonulceasi, va più veloce

dell’RNA polimerasi e a un certo punto collidono e l’RNA pol si stacca e si forma il 3’. Poi un

enzima, detto poli-A polimerasi, aggiunge adenosina al 3’.

Infine, al 5’ del pre-mRNA formato, c’è il CAP, un cappuccio di 7-metil guanosina che viene aggiunto

sia per proteggere da digestione esonucleasica che per sito di riconoscimento per l’attacco al

ribosoma. Più precisamente al terminale 5’ trifosfato, una guanosina si lega con legame 5’-5’ il

fosfato beta si lega al fosfato alpha della guanosina creando un ponte trifosfato. E poi metilazione

della guanosina in posizione 7.

In seguito a questi due eventi di capping al %’ e poliadenilazione al 3’, abbiamo lo splicing che darà

fine al processo di maturazione dell’mRNA. L’mRNA eucariotico presenta moltissimi introni,

sequenze non codificanti e queste devono essere rimosse per poi unire gli esoni, sequenze

codificanti. Si ha sempre un esone-introne-esone. Tra esone-introne abbiamo il primo sito di

splicing, responsabile del primo evento di taglio e tra introne-esone abbiamo il secondo sito di

splicing, responsabile del secondo evento di taglio. Il primo evento di taglio è la transesterificazione,

ovvero viene tagliato il legame fosfodiestere lasciando un 3’OH. L’introne si ripiegherà a cappio (o

aiutato dallo spliceosoma o da solo, come autosplicing) e il secondo evento di taglio manderà via il

cappio. Così gli esoni potranno riunirsi. Si parla anche di splicing alternativo, ovvero che dà alla

formazione di proteine diverse. Un esempio di splicing alternativo è l’exonskipping della troponina

alpha e beta, una proteina del muscolo striato e liscio che presenta un trascritto primario con 5

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esoni. Nella troponina alpha viene saltato l’esone 4 che rimane intrappolato in un introne e nella

beta il 3.

Gli introni non sono presenti nei procarioti e ci sono due ipotesi sul fatto che questi si fossero

sviluppati prima nei procarioti e poi negli eucarioti (intron earlier) o se questi siano prerogativa degli

eucarioti (intron late). La più accreditata è la prima, poiché i procarioti per rispondere più

velocemente agli stress ambientali hanno preferito mantenere nel corso dell’evoluzione un genoma

più corto, rinunciando quindi agli introni. Inoltre gli introni sono fondamentali negli eucarioti perché

questi, aumentando di numero, hanno impedito che si dovessero formare più geni, quindi gli introni

fanno sì che i geni mantengano lo stesso numero all’interno di un organismo, riuscendo comunque

a produrre una grade variabilità proteica.

Esistono mutazioni regolative che colpiscono lo splicing o la trascrizione. Se si hanno mutazioni

nello splicing, gli introni vengono mantenuti e si produrrà mRNA aberrante. Invece, mutazioni a

livello trascrizionale, si hanno per esmpio nella malattia della beta Talassemia, poiché vengono

prodotte meno proteine Beta rispetto ad Alfa e quindi il globulo rosso talassemico trasporta peggio

l’ossigeno. Un altro tipo di mutazioni trascrizionali, sono a livello della TATA Box. In questo caso il

DNA non sia apre.

Cromatina

La cromatina è formata da DNA avvolto su gruppi di proteine, chiamati istoni, formando un

nucleosoma . Gli istoni sono H2A, H2B, H3,H4 e si aggregano formando un ottamero, intorno al

quale il DNA si avvolge in modo sinistrorso. Gli istoni sono proteine basiche, estremamente

conservate, che presentano residui di LYS che sono positive e che quindi interagiscono con il DNA

che è carico negativamente. Gli istoni subiscono un pattern di modificazione che cambia da istone a

istone, è un vero e proprio codice istonico. Le modificazioni più comuni sono l'acetilazione, ovvero

l’aggiunta alle lisine di acetile proveniente dall’acetil coenzima A, che fa sì che le lys diventino

negative e perdino stabilità i nucleosomi, così che la cromatina diventi trascrivibile, o le metilazioni,

in cui il donatore di metile è il S metiladenosina, la fosforilazione che fa sì che si aggiunga qualcosa

di negativo alla SER. Sono comunque tutte modificazioni reversibili.

Ci sono vari livelli di organizzazione della Cromatina e del DNA. Abbiamo il DNA nudo, il DNA a filo

di perle, le anse a 30 nm e la fibra a 300 nm. L’ansa a 30 nm si ha il confine tra eucromatina ed

eterocromatina. Se si addensano sempre di più fino ad andare verso i 300 nm, si ha eterocromatina

che non è trascrivibile, mentre se si va dai 30 nm e si rilassa sempre più, si ha l’eucromatina che è

accessibile e trascrivibile. A livello di una singola ansa di 30 nm si ha quindi lo smantellamento di un

singolo nucleosoma, che si smantella prima in tetramero e poi due dimeri. Quando si riforma ilo

nucleosoma, prima si unisce il tetramero e poi i due dimeri e in presenza di DNA si avrà di nuovo

l’ottamero.

Inibitori della trascrizione

Antibiotico: blocca specificatamente la trascrizione nei batteri

Alfa-amantina: si lega fortemente alla RNA pol II eucariotica, è un veleno

Actinomicina D: è attiva in tutti gli organismi, blocca la trascrizione

Interferenza a RNA

Se negli eucarioti avviene la trascrizione, non è detto che avvenga la traduzione di quel mRNA.

Esistono infatti, meccanismi endogeni che fanno sì che venga bloccata la traduzione di un certo

mRNa o che questo venga tagliato. Questo meccanismo prende il nome di Interferenza a RNA ed è

veicolato da un particolare RNA trascritto nel nucleo che è il miRNA. Nel nucleo infatti vengono

prodotte lunghe sequenze di pri-miRNA che presenta delle forcine. Poi, un enzima DROSHA, lo

taglia in molecole più piccole a doppio filamento, i pre-miRNA. Questi pre-miRNA vengono poi

esportati nel citoplasma dove incontrano DYCER che taglia le forcine formando i mi-RNA e dei 2

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AUTORE

ciemme.

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10 mesi fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze biologiche
SSD:
Università: Firenze - Unifi
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher ciemme. di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biologia molecolare e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Firenze - Unifi o del prof Raugei Giovanni.

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