Riassunto di Biologia Molecolare (prof. Raugei)

Riassunto biologia molecolare, Prof Raugei

Struttura del DNA

Il DNA è l'acido desossiribonucleico ed è formato da una serie di nucleotidi legati fra loro da legame fosfodiesterico tra il 3'OH e il 5'fosfato. Un nucleotide è formato da uno zucchero a 5 atomi di C, un gruppo fosfato che deriva dall'acido fosforico e una base azotata legata tramite legame N-glicosidico allo zucchero. Le basi azotate, invece, sono 4 e si dividono in pirimidine e purine: le prime, hanno solo un anello, le seconde due anelli.

Basi azotate

Fra le pirimidine troviamo:

• La citosina con in posizione 4 l'NH₂ e in posizione 2 il doppio legame con l'ossigeno
• La timina che presenta in 5 un metile
• L'uracile che presenta in 4 un doppio legame con l'ossigeno e in 2 un doppio legame con l'ossigeno

Tra le purine troviamo:

• L'adenina con in posizione 6 l'NH₂
• La guanina che ha in posizione 2 l'NH₂ e in 6 il doppio legame con l'ossigeno

Legami e struttura del DNA

Le basi azotate sono legate fra loro da legame a idrogeno, ossia un legame fra l'H e un atomo più elettronegativo. L'H possiede carica parzialmente positiva ed è un atomo donatore, mentre gli atomi più elettronegativi presentano una parziale carica negativa e sono detti accettori. L'interazione è sempre fra accettore e donatori: più precisamente, ritroviamo un doppio legame a H tra A e T e un triplo fra C e G, il che le rende più stabili. Le basi azotate sono idrofobiche quindi permangono all'interno dello scheletro zucchero-fosfato.

Il DNA è a doppia elica ed esiste in tre forme A, B e Z. B è quello più rappresentato in natura, è sinistrorso, presenta un giro di 10.5 e le basi sono piegate di 6 gradi anche se si considerano relativamente parallele fra loro. Il DNA è la forma ridotta dell'RNA, in quanto quest'ultimo presenta un OH in più sul ribosio ed è a singolo filamento.

Assorbimento e denaturazione del DNA

Il DNA può essere quantificato tramite spettrofotometro, uno strumento che registra i picchi di assorbimento nello spettro di luce del visibile. Il DNA, presenta un assorbimento a 260 nm (come anche l'RNA). Le responsabili dell'assorbimento a questa lunghezza d'onda sono le basi azotate. Queste però, quando si trovano nella doppia elica, stanno all'interno e quindi per registrare quel picco è necessario prima denaturare il DNA ad alte temperature, così da formare singoli filamenti e così da esporre le basi azotate all'esterno, aumentando l'assorbanza. Questo fenomeno si chiama effetto ipercromico.

La temperatura di melting è la temperatura alla quale il 50% del DNA è denaturato. Non è una costante, bensì dipende dalla lunghezza del DNA e dal quantitativo di basi GC che presentano 3 legami a H e quindi sono più difficili da separare e quindi sarà richiesta una temperatura di denaturazione maggiore.

Funzione e caratteristiche del DNA

Fu fatto un esperimento per dimostrare la rilevanza fisiologica della TATA BOX. Furono presi frammenti di DNA in quantitativi diversi % di GC. In quelli con più alto contenuto %, per riuscire a denaturare, era necessaria una temperatura maggiore, mentre in quelli con quantitativo minore in % era sufficiente una temperatura minore perché erano presenti più coppie AT che avendo solo due legami a H, rappresentavano un punto di debolezza del filamento. Quindi il DNA si apre con più facilità in quel punto.

Le basi azotate non passano esattamente dall'asse centrale di simmetria della doppia elica del DNA, bensì passano avanti e dietro rispetto a quest'asse e quindi formano un solco maggiore e un solco minore. Questi solchi, sono essenziali per il riconoscimento del promotore nella trascrizione da parte di fattori proteici esogeni, in quanto questi solchi presentano differenti gruppi chimici che indicano se siamo in presenza di coppie AT TA o GC CG. Il solco maggiore è quello più informativo. Nella coppia GC abbiamo la sequenza AADH₁ (accettore, accettore, donatore, idrogeno) e in quella CG abbiamo HDAA. In AT abbiamo ADAM (accettore, donatore, accettore, metile) e in TA MADA.

Enzimi e taglio del DNA

Sul DNA abbiamo diversi enzimi che intervengono come nucleasi, tagliandolo. Esistono esonucleasi che tagliano o in 5' o in 3' o endonucleasi, che tagliano all'interno del legame fosfodiesterico. Ci sono particolari enzimi batterici, chiamati enzimi di restrizione, che tagliano in specifiche sequenze con simmetria centrale, chiamate sequenze palindromiche, che sono le stesse se lette da destra a sinistra e viceversa. L'enzima di restrizione più studiato è quello ECOr1 che riconosce sequenze GAATTC e che taglia sempre creando il nick, fra la G e l'A.

Gli enzimi di restrizione, tagliando, possono formare o estremità piatte, blunt, o estremità coesive, sticky ends. Associato al taglio di restrizione, c'è sempre un sistema di protezione messo in atto dal batterio che è quello di metilazione. In pratica, se un virus cerca di inserire il proprio DNA esogeno all'interno del batterio per riprodurvisi, questi enzimi di restrizione lo tagliano, riconoscendo quelle sequenze palindromiche. Il problema è che potrebbero tagliare anche il DNA batterico, quindi in questo caso agisce un altro enzima, la DAM metilasi che metila (ad esempio in ECOr1) la prima adenina della sequenza palindromica GAATC, in modo che l'enzima non tagli il DNA batterico.

Dopo un primo ciclo di duplicazione, avremo un'emi-metilazione, che è sempre una protezione, dove avremo il filamento stampo metilato e quello nuovo non metilato. Poi dopo un altro ciclo, la dam metilasi metilerà le posizioni non metilate, producendo una metilazione completa. Gli enzimi di restrizione, sono anche usati nella tecnologia del DNA ricombinante. Si prende un frammento target di DNA tagliato da un enzima di restrizione. Poi si prende un vettore, un plasmide per esempio e si taglia con lo stesso enzima di RE. In entrambi si formano estremità coesive. Si inserisce il dna target all'interno del vettore, poi si avrà la ligazione. La ligazione è veicolata da DNA ligasi che ha una lisina che lega AMP al fosfato 5' con formazione di 5'ADP+ AMP. Poi si forma il legame fra il 3' OH il P con ATP che diventa AMP più piro fosfato. Infine avremo il trasferimento e la trasformazione di questo dna ricombinato all'interno di un batterio.

Replicazione del DNA

La replicazione del DNA è di tipo semiconservativa, ovvero entrambi i filamenti di DNA servono da stampo per il DNA di nuova sintesi. Nei procarioti, esiste una sola origine di replicazione mentre negli eucarioti ne possono esistere di più. Nei procarioti la replicazione inizia in ORIc, dove sono presenti sequenze consenso, ovvero sequenze estremamente conservate, ma non identiche fra loro che presentano o 13 nucleotidi ripetuti 3 volte o 9 nucleotidi ripetuti 4 volte. Queste sequenze consenso sono ricche di A e T.

A questo punto, intervengono dei fattori proteici. Il primo ad intervenire è DNA a che si lega in queste sequenze con la formazione di un complesso ottamerico. Poi interviene un'elicasi DNA B che rompe i legami a H facendo sì che si apra il DNA con la formazione di una forcella replicativa. Proteine SSBP (single strand building proteins) terranno i singoli filamenti fermi. La DNA polimerasi III, che sintetizza in direzione 5'-3', non può iniziare ad attaccare i desossinucleotidi senza un 3' OH libero. Per questo, sono posizionati due primer a RNA (due per ogni filamento), che forniscono il 3'OH, substrato necessario per la polimerizzazione della DNA polimerasi. La DNA polimerasi può sintetizzare un filamento in maniera continua, e uno a sintesi discontinua.

La sintesi avviene a livello di un grosso complesso enzimatico chiamato replisoma, che prevede la DNA pol, l'elicasi e delle proteine primasi. Queste primasi sono essenziali per il filamento a sintesi discontinua poiché forniscono gli inneschi a RNA necessari per la sintesi discontinua, con formazione di questi frammenti di Okazaki che vengono sintetizzati dalla DNA pol e sono frammenti compresi fra innesco ed innesco. Poi una proteina erase, toglie gli inneschi e una ligasi unisce il tutto. La sintesi procede alla stessa velocità sia nel filamento a sintesi lenta che in quello veloce, questo perché quello a sintesi lenta viene piegato a 180°, formando delle anse che contengono il frammento di okazaki. Poi, una volta sintetizzato, il complesso scorre di circa 1000 basi e si forma un'altra ansa e così via.

Nei procarioti esistono 3 polimerasi. La III coinvolta nella sintesi, La I non è l'enzima principale della replicazione, il cui ruolo spetta alla DNA polimerasi III (nota per questo anche come replicasi). Svolge invece:

• Una funzione di riparazione dei danni del DNA, riempendo brevi regioni a singolo filamento;
• Un ruolo accessorio durante la replicazione, consistente nel sostituire i ribonucleotidi (RNA) con deossiribonucleotidi (DNA), sul filamento lagging, una volta che sono stati rimossi gli inneschi dei frammenti di Okazaki.

L'enzima consiste in una singola catena polipeptidica che, mediante trattamento proteolitico, può essere suddivisa in due frammenti. Il maggiore, chiamato Frammento di Klenow, è dotato dell'attività polimerasica 5'-3' e dell'attività esonucleasica 3'-5' (correzione di bozze); viene di norma utilizzato nelle reazioni di sintesi in vitro. Il frammento più piccolo possiede anche un'attività 5'-3' esonucleasica, che determina l'escissione di nucleotidi a valle dell'enzima. La DNA pol I ha la forma di una mano.

DNA polimerasi II

La DNA polimerasi II non risulta essenziale per la replicazione del DNA. La sua azione è indotta da danni al DNA. Ha attività polimerasica 5'→3'. La DNA polimerasi II è capace di riempire i gap (buchi) di DNA, che hanno quindi una singola elica, senza bisogno di un primer a RNA; svolge quindi una funzione di "gap filling", ovvero riempie zone della molecola di DNA non complete. Queste zone non devono superare le 100 coppie di basi. Ha alta fedeltà di scrittura, ovvero commette pochi errori, ma per questo ha bassa processività, e non può quindi essere utilizzata nella normale sintesi.

La sintesi di questa polimerasi è indotta durante la fase stazionaria di crescita della cellula. È una fase in cui possono capitare errori di sintesi di DNA, fra cui piccoli gaps, buchi, che bloccano la DNA polimerasi III, la quale svolge la stragrande maggioranza della sintesi con la sua elevata processività.