Appunti di Biologia Molecolare Fiaschi Raugei

Appunti del corso di biologia molecolare

(Lezioni del Prof. Raugei)

Lezione 1

Il DNA ha una sua direzionalità o polarità che dir si voglia: è molto importante la direzione 5'--> 3', lungo la quale usualmente si svolge la sintesi. Ricordiamo anche che DNA ed RNA sono molto simili: le differenze principali consistono nella presenza della timina e un - H in posizione 2' nel DNA, laddove nell'RNA abbiamo uracile (che si ottiene togliendo un gruppo -CH₃ dalla timina), e la presenza di un -OH in posizione 2'.

Concentriamo adesso la nostra attenzione sui legami ad idrogeno: si formano due legami ad idrogeno tra adenina e timina e tre legami ad idrogeno tra guanina e citosina. Si tratta di legami deboli – in generale, i legami deboli rivestono una grandissima importanza nelle interazioni molecolari; sono gli enzimi, che entrano in gioco nel metabolismo, ad agire soprattutto sui legami covalenti. Nella struttura del DNA sono importanti sia legami covalenti, nella costruzione della sua impalcatura di pentoso-fosfato-base azotata (quest'ultima intrattiene un legame N-glicosidico), sia i legami deboli, che tengono insieme le due catene a formare una doppia elica. La caratteristica del legame debole è quella di essere facilmente reversibile. Il legame debole tipicamente è spezzato tanto facilmente quanto facilmente può essere riformato. In effetti, i legami ad idrogeno che tengono insieme le due catene del DNA sono importanti, grazie a quest'ultima caratteristica, per numerosi processi che interessano questa molecola (es. trascrizione), mentre zone a doppio filamento intramolecolari invece danno la peculiare forma al tRNA.

Il legame ad idrogeno tipicamente coinvolge (1) un H legato ad un atomo elettronegativo come N, O o, più raramente, S e (2) un atomo con parziale carica negativa. Rottura e formazione di legami covalenti entrano in gioco solamente durante la replicazione. Nel normale funzionamento del DNA (cioè, il funzionamento in cellule in fase G) si rompono e si formano legami deboli. Per “normale funzionamento” si intende soprattutto la trascrizione, processo che implica la rottura di legami deboli preesistenti per l'apertura della doppia elica, e il nuovo instaurarsi di altri legami deboli per dirigere la sintesi dell'RNA – dal punto di vista di quest'ultimo, entrano in gioco anche legami covalenti, ma dal punto di vista del DNA sono coinvolti solo legami deboli.

Il DNA è, come abbiamo visto, una doppia elica. All'esterno abbiamo l'impalcatura di zucchero-fosfato, mentre all'interno sono poste le basi. Le basi sono orientate parallelamente al piano immaginario su cui poggia la molecola, e sono impilate una sopra l'altra. La doppia elica può esistere in diverse forme, si parla di DNA A, DNA Z e DNA B, dove quest'ultimo è quello più interessante perché fisiologicamente presente nelle cellule. La struttura a doppia elica del DNA B ha una particolarità: l'asse dei legami ad idrogeno non passa per l'asse della doppia elica. L'elica in qualche modo si avvolge intorno al suo asse, senza però toccarlo, perché i legami ad idrogeno che legano le due basi affacciate verso l'interno passerebbero per l'asse se i due zuccheri fossero a 180°; in realtà, gli zuccheri stanno a 120°. Quindi l'elica ha una sorta di andamento a zig zag, con la formazione di un solco maggiore e uno minore.

Interazione tra DNA e proteine

Questa nozione ci permette di introdurre un altro concetto. Il DNA è una molecola che funziona interagendo con proteine, che sono in grado di “leggerlo”. Un esempio è l'RNA polimerasi, che deve legarsi ad un promotore per iniziare la trascrizione: deve quindi esistere un meccanismo che renda le proteine capaci di riconoscere particolari sequenze del DNA ancora chiuso. Questo riconoscimento è reso possibile in quanto particolari posizioni delle basi azotate sono esposte all'esterno della molecola grazie alla presenza dei solchi a cui abbiamo accennato. Non è facile da visualizzare. Un osservatore esterno che si ponesse nel solco maggiore potrebbe osservare, a livello di una purina, le posizioni 6, 7 e 8. La posizione 6 permette di distinguere tra le due purine (l'adenina ha un -NH₂, la guanina un doppio legame con l'O), mentre le posizioni 7 e 8 non sono “diagnostiche”. Anche il solco minore consente delle esposizioni, a livello del carbonio in posizione 2. Le proteine hanno una conformazione tale da poter interagire selettivamente con certi gruppi funzionali, così da distinguere i nucleotidi. Per quando riguarda le pirimidine, solo la parte esposta nel solco maggiore permette di differenziare una citosina e una timina. La differenza è molto grande: la posizione 4 è diversa, inoltre la timina è metilata in posizione 5, dove la citosina ha solo un H. A livello del solco minore invece questa distinzione non può essere fatta.

Tutto questo fa sì che una certa sequenza di DNA sia riconoscibile grazie ai gruppi chimici esposti a livello del solco maggiore (sia per purine che per pirimidine) o del solco minore (solo per le purine), offrendo siti di lettura anche per il DNA chiuso. Ci sono poi delle sequenze aminoacidiche, conservate in molte proteine diverse, che sono tanto diffuse da consentire, qualora vengano ritrovate su proteine dalla funzionalità ignota, di dedurre con una certa sicurezza che queste abbiano a che fare con il DNA. Queste strutture sono essenzialmente di tre tipi:

• Elix-Turn-Elix; ovvero, una zona costituita da un dominio ad α-elica, seguita da una corta sequenza aminoacidica senza una struttura secondaria particolare, che permette una certa libertà di piegamento, seguita a sua volta da una seconda α-elica. In genere queste proteine sono dei dimeri. Le α-elica sono le zone della proteina che prendono contatto con i gruppi chimici esposti a livello dei solchi.
• Zinc Fingers, una struttura curiosa, dove si hanno delle zone quasi a forma di “dita”, che si inseriscono nelle scanalature del solco maggiore e del solco minore prendendo contatto con i gruppi chimici esposti. Si tratta di una struttura di tipo terziario, dove uno ione zinco si coordina con gruppi -SH di cisteine, formando le “dita”. Le cisteine per ogni dito in genere sono quattro: due sono separate da 3-4 aminoacidi circa, poi è in genere presente un loop (qualche decina di aminoacidi), e infine le altre due, sempre vicine tra loro. Questa struttura è piuttosto peculiare, ed è spesso ripetuta a distanze regolare (ognuna rappresenta un dito) permettendo così di riconoscere gli zinc fingers già a livello della struttura primaria. Si possono trovare fino a 9 zinc fingers.
• Leucyn Zipper (cerniere a leucina); in realtà questa struttura non serve tanto per interagire con il DNA, quanto per formare dimeri. La struttura sfrutta interazioni tra leucine, che è un aminoacido dotato di una lunga catena di tipo idrocarburico, quindi apolare. Questo significa che formerà facilmente interazioni di tipo Van der Waals con altre leucine. In genere, le strutture di tipo leucyn zipper coinvolgono delle α-eliche, in cui tra le leucine sono interposti aminoacidi in numero tale da far sì che queste sporgano tutte dalla stessa parte dell'α-elica. In genere ci sono 3,5 aminoacidi per ogni giro di α-elica, per un totale di 7 aminoacidi per ogni 2 giri. È facile immaginare come le leucine siano presenti ogni 7 aminoacidi, così da risultare impilate una sopra l'altra. Alla fine, si hanno due α-eliche, con una fila di leucine su un lato, che si interagiscono tra loro attraverso interazioni di tipo idrofobico.

Ricordiamo inoltre che in genere le proteine che interagiscono con il DNA sono cariche positivamente (hanno cioè un punto isoelettrico di tipo basico) – al contrario della gran parte delle altre proteine, cariche negativamente. Ovviamente la carica positiva facilita di per sé l'interazione con il DNA, dato che quest'ultima molecola è carica negativamente: una proteina carica negativamente genererebbe interazioni di tipo repulsivo.

Metabolismo del DNA

Il funzionamento del DNA, come abbiamo visto, coinvolge essenzialmente legami deboli; tuttavia, il DNA ha un suo metabolismo: viene prodotto e può essere anche catabolizzato. In genere in un organismo quest'ultima attività viene evitata. A differenza di tutte le altre molecole (proteine, RNA, etc.), che sono in gran parte “usa e getta”, il DNA tende ad essere mantenuto. La replicazione del DNA è infatti di tipo semiconservativo, il che significa, tra l'altro, che da qualche parte nel nostro organismo due cellule probabilmente contengono uno dei due filamenti di DNA che si trovava nello zigote da cui ci siamo originati.

Il catabolismo del DNA entra in gioco soprattutto quando ci nutriamo: quasi sempre ingeriamo anche cellule, il cui DNA deve essere digerito. Deve esistere quindi una classe di enzimi in grado, all'occorrenza, di smantellare la struttura del DNA. Si tratta di idrolasi (quindi in grado di agire a livello del legame fosfodiesterico), nucleasi (agiscono sugli acidi nucleici), fosfodiesterasi (agiscono su un legame fosfodiesterico). Si possono poi distinguere esonucleasi, endonucleasi, desossiribonucleasi, ribonucleasi, etc. La classificazione è comunque molto varia.

Ad ogni modo, è particolarmente importante la distinzione tra esonucleasi ed endonucleasi. Sono esonucleasi quegli enzimi che, avendo un filamento con entrambe le estremità libere, tagliano il primo legame fosfodiesterico dopo il primo o l'ultimo nucleotide: esistono infatti le esonucleasi 5' (che iniziano a digerire il DNA a partire dall'estremità 5'), e le esonucleasi 3' (che iniziano a digerire il DNA dall'estremità 3'). Il taglio di tipo P, di gran lunga il più comune, taglia tra il 3' e il fosfato, lasciando attaccato il gruppo fosfato al 5'; il taglio di tipo T, molto più raro, taglia tra il 5' e il fosfato, lasciando attaccato il gruppo fosfato al 3'. Le endonucleasi sono enzimi che tagliano il legame fosfodiesterico all'interno della catena. Anche in questo caso, esistono tagli di tipo P e T, ed esistono endonucleasi specifiche per RNA e DNA, così come endonucleasi aspecifiche. In entrambi i casi, l'azione è soltanto su uno solo dei due filamenti di DNA.

In sintesi, si tratta di due classi di enzimi che hanno lo scopo di frammentare il DNA a scopi catabolici, ottenendo un pool di dNTP, monomeri che consistono di deossinucleosidi dei quattro tipo possibili (nel caso del DNA) proprio come le proteasi catabolizzando le proteine portano ad ottenere un pool di aminoacidi. La differenza tra endonucleasi ed esonucleasi è anche nella specificità riguardo alla sequenza di basi azotate di DNA.

Rottura e riparazione del DNA

Come si può immaginare, il DNA può essere danneggiato. Uno dei danni più tipici che può subire questa molecola è la rottura di un singolo legame fosfodiesterico, cosa che di solito è, fortunatamente, priva di conseguenze. La rottura in sé infatti non è un grosso danno, in quanto il DNA è una doppia elica che trova stabilità nella interazione tra i due filamenti singoli. La struttura della molecola non viene turbata dal nick; la sua struttura stessa garantisce, attraverso i legami ad idrogeno, che la conformazione rimanga inalterata; i nick sono in genere riparati da ligasi. Un filamento di appena 20 nucleotidi implica decine di legami ad idrogeno. Se, tuttavia, il nick avviene in corrispondenza di un altro nick, oppure molto vicino, si può verificare un danno gravissimo: una soluzione di continuità nella doppia elica; i legami a idrogeno non sono abbastanza numerosi da garantire l'integrità. Tuttavia, in condizioni normali, è estremamente improbabile che avvenga una cosa del genere.

L'azione di una endonucleasi si esplica su uno dei due filamenti, casualmente, introducendo dei nick, che possono o meno portare ad una rottura. Le endonucleasi in genere non riescono a frammentare il DNA sino a portare al singolo monomero; in genere frammentano il filamento in oligomeri, e poi delle esonucleasi finiscono il lavoro. Tuttavia, per la funzionalità del DNA, anche una singola rottura è un evento disastroso. Esiste poi una classe particolare di endonucleasi che hanno la caratteristica di essere estremamente specifiche riguardo alla sequenza di taglio: sono le endonucleasi di restrizione. Questi enzimi tagliano la doppia elica con due nick ravvicinati (uno su un filamento e uno sull'altro) in corrispondenza di particolari sequenze. In altre parole, se si mettono in contatto questi enzimi con un filamento di acido desossiribonucleico di sequenza conosciuta, saremo in grado di predire i punti in cui saranno creati i nick, e il numero di pezzi in cui verrà tagliata la molecola. Questi enzimi sono stati, e anche se in misura minore, ancora sono, un importantissimo strumento per l'ingegneria genetica; sono utilizzate spesso per rompere il DNA in modo da poter inserire delle sequenze desiderate all'interno delle molecole. Sono presenti in moltissimi batteri, che esprimono questi enzimi per difendersi dagli attacchi mediati dal DNA. Tipici agenti di questi attacchi sono virus, come i batteriofagi. Questi infettano la cellule trasferendo il proprio materiale genetico all'interno di esse e sfruttando i loro apparati metabolici per riprodursi. Diviene intuibile come avere degli enzimi di restrizione in grado di frammentare certe sequenze aiuti i batteri a difendersi.

EcoR1 è stato uno dei primi enzimi di restrizione scoperti e attualmente è uno dei meglio conosciuti; è stato fondamentale per la comprensione della struttura di questi enzimi, e della struttura della sequenza che viene riconosciuta. Il nome di questi enzimi è costituito da un acronimo che deriva dal nome del batterio da cui sono stati isolati. EcoM1 deriva da Escherichia coli, ceppo R, 1 in quanto è stato il primo ad essere scoperto (finora ne sono stati caratterizzati 4); HinD3 deriva da Haemophilus influentiae, etc. Ognuno di questi enzimi ha un suo sito di restrizione (le sequenze nucleotidiche specifiche che sono in grado di riconoscere), la cui struttura è peculiare: deve essere infatti a simmetria centrale; sono dei palindromi, in sostanza. Il sito di restrizione riconosciuto da EcoR1 ad esempio è questo: 5'-G A A T T C-3' 3'-C T T A AG-5'. Questa struttura fa sì che su due filamenti ci sia esattamente la stessa sequenza (letta secondo 5'-->3'). Grazie alla loro simmetria centrale le due sequenze sono identiche. Questo sito di restrizione come vediamo ha 6 basi di riconoscimento; altri siti sono solo a 4 basi di riconoscimento.

Il taglio della endonucleasi può essere di due tipi. Un primo tipo (è il caso di EcoR1) prevede che la endonucleasi tagli un certo legame fosfodiesterico (es. quello tra la G e la A, vedi freccia) sia su un filamento che sull'altro: quindi la endonucleasi riconosce uno dei due filamenti e taglia tra G ed A; in un secondo momento, riconosce la stessa sequenza sull'altro filamento ed effettua il secondo taglio.

Nel caso che abbiamo visto sopra, saremo in una situazione di due nick ravvicinati su due filamenti: pochi legami ad idrogeno tengono insieme la doppia elica in seguito all'inserimento dei due nick. Un secondo tipo di taglio prevede che i due nick avvengano in corrispondenza dello stesso legame fosfodiesterico.

Il taglio del primo tipo tipicamente produce le cosiddette estremità coesive: i legami ad idrogeno non sono sufficienti per tenere insieme i due monconi, ma esiste una certa complementarietà, che rende “appiccicosi” le due estremità, anche se il legame, di fatto, non può tenere insieme la doppia elica. Nel tempo, ci possono essere tuttavia degli istanti in cui questo legame diviene stabile. Il taglio del secondo tipo invece porta alle estremità piatte: in questo caso, i due monconi non hanno possibilità di riunione, dato che non si formano legami ad idrogeno.

L'importanza di questi enzimi sta anche nel fatto che si formano delle estremità coesive specifiche, che potranno essere riunite da delle ligasi, enzimi che in pratica effettuano un'azione antagonista rispetto alle endonucleasi, restaurando i legami fosfodiesterici e revertendo l'azione di taglio. Notare tuttavia che si può riunire il DNA tagliato da un solo enzima di restrizione; far agire due diverse endonucleasi di restrizione significherebbe compromettere la compatibilità delle estremità coesive.

Utilizzo delle endonucleasi

Un'altra cosa interessante da notare riguardo l'utilizzo di endonucleasi e ligasi è che, se separiamo una molecola di DNA in due monconi utilizzando EcoR1, possiamo poi sfruttare una ligasi per unire queste estremità ai monconi di una molecola di DNA di origine diversa, tagliata con lo stesso enzima di restrizione, formando una nuova molecola di DNA. Questo è il principio su cui si basa la tecnica del DNA ricombinante: mettere insieme frammenti di DNA che in natura non si incontrerebbero mai, creando per esempio plasmidi batterici con geni umani, etc. Nel nostro organismo, la ricombinazione genica avviene praticamente solo a livello della gametogenesi e nelle cellule deputate alla produzione di anticorpi. In generale, la ricombinazione del DNA proveniente da organismi diversi è possibile perché, dal punto di vista chimico, il DNA è identico in tutte le forme di vita. Quello che cambia tra gli organismi è soltanto la sequenza.

A questo punto, adesso che abbiamo esaminato a grandi linee gli enzimi di restrizione, sorge spontanea una domanda. Gli enzimi endonucleasici sono enzimi potenzialmente pericolosi, come tutti gli enzimi litici in generale. Per esempio, nella necrosi dovuta ad ipossia, il contenuto lisosomiale viene riversato al di fuori dei lisosomi, liberando pericolosissime proteasi e anche nucleasi; la necrosi è quindi anche dovuta alla digestione degli acidi nucleici. Come possono quindi le...