Riassunto completo patologia Generale Bernardi

Deregolazione del calcio

Il Ca è lo ione con l’equilibrio fra ambiente intra ed extracellulare più lontano e quindi l’entrata massiva nell’ambiente intracellulare causa eventi importanti. La concentrazione tollerata è di 0,5-1 microM (1000 volte minore di quella extracellulare).

Se si ha un aumento eccessivo di Ca questo entrerà nei mitocondri causando una lesione con conseguente mancata produzione di ATP, inoltre possono essere lesi i lisosomi con conseguente rilascio di enzimi nel citoplasma con lesioni inizialmente reversibili ma che sfociano in necrosi.

La cellula necrotica inizialmente tipicamente si gonfia per alterazione dell’equilibrio osmotico dovuto a enzimi che agendo su altre proteine aumentano l’osmolarità intracellulare scindendole in più proteine. Il rigonfiamento infine rompe la membrana cellulare.

Il riversamento nell’ambiente extracellulare di costituenti intracellulari stimola l’innesco della flogosi.

Necrosi

Necrosi: morte cellulare accidentale dovuta ad eventi lesivi di vario genere. Essendo una morte accidentale causa l’innesco flogistico. In una cellula che va incontro a necrosi sono osservabili caratteristiche modificazioni:

• Il citoplasma diventa fortemente eosinofilo in conseguenza all’aumento dei gruppi legati dal colorante per la massiccia idrolisi;
• Rigonfiamento degli organuli;
• Picnosi è la prima lesione morfologicamente significativa ed è caratterizzata dal nucleo che diventa piccolo e compatto;
• Carioressi in cui il nucleo è compatto ma frammentato;
• Cariolisi ossia la digestione da parte degli enzimi del nucleo stesso.

La lesione nucleare è di fondamentale importanza perché fa da spartiacque fra lesione cellulare reversibile e irreversibile. Infatti quando il nucleo viene lesionato vengono meno tutti i processi di trascrizione e si può considerare la lesione irreversibile.

Biochimica della necrosi

• Crisi bioenergetica. Il danno mitocondriale dovuto all’evento lesivo iniziale causa una lesione che se prolungata diventa irreversibile. Questa soglia omeostatica è diversa da tessuto a tessuto in base al tipo di metabolismo che quest’ultimo utilizza, ossia un metabolismo aerobio o anaerobio. Si parla di danneggiamento mitocondriale calcio dipendente.
• La carenza di ATP determina un mancato funzionamento della pompa Na/K con conseguente accumulo intracellulare di Na con conseguente aumento osmotico che causa il rigonfiamento cellulare;
• La carenza di ATP dovuta al danno calcio dipendente ha come conseguenza anche l’attivazione delle fosfolipasi intracellulari che attaccano i fosfolipidi di membrana causando la disorganizzazione della membrana e il rilascio di acidi grassi liberi che sono agenti impermeabilizzanti per i protoni (aumentano l’osmolarità intracellulare);
• Il danno di membrana causa un ulteriore aumento del Ca citosolico che raggiunge la soglia di attivazione delle proteasi calcio dipendenti (calpaina ed endonucleasi) che nel momento in cui lisano il nucleo rendono la lesione irreversibile;
• Un meccanismo di compenso che la cellula mette in atto è l’attivazione delle heat shock proteins che se la lesione è di bassa intensità e di durata breve permettono il recupero delle funzioni grazie al compenso degli equilibri energetici, ionici e osmotici.

Tipi di necrosi

• Necrosi coagulativa tipica degli infarti, l’evento iniziale è il mancato apporto di ossigeno con conseguente crisi bioenergetica ed eventi conseguenti. Questo tipo di necrosi si presenta come una zona opaca e densa. Microscopicamente è iper-eosinofila per l’aumento dei gruppi legati dall’eosina in seguito a idrolisi.
• Necrosi colliquativa è una necrosi caratterizzata dal rammollimento della zona necrotica dovuto all’azione dei neutrofili che vengono richiamati in loco per la rimozione dell’agente lesivo. Può formarsi anche un ascesso ossia una raccolta semiliquida di detriti cellulari e derivati da neutrofili. Questo tipo di necrosi è tipica di Streptococcus pyogenes.
• Necrosi caseosa è caratterizzata da consistenza di formaggio fresco ossia un materiale fresco, noduloso e friabile. È tipica del Mycobacterium tuberculosis.
• Necrosi grassa avviene tipicamente nel pancreas in quanto un evento necrotico in questo organo causa il rilascio di fosfolipasi, idrolasi acide e proteasi che portano all’alterazione lipidica con formazione di materiale opaco e untuoso.

Apoptosi

Apoptosi: tipo di morte cellulare programmata, viene attivata quando una cellula ha finito il suo compito o viene infettata da agenti patogeni. Essendo programmata la cellula mette in atto una serie di eventi che permettono la rimozione della cellula stessa senza innesco della flogosi.

Ciò è possibile grazie all’espressione sulla porzione esterna della membrana di fosfatidilserine che vengono riconosciute dal sistema macrofagico che rimuove i residui cellulari. La cellula prima di essere fagocitata va incontro a processi di autodigestione mediati da enzimi chiamati caspasi (cysteinyl aspartate-specific proteinase).

Esistono molti tipi di caspasi, alcune coinvolte nel sistema immunitario, ma quelle coinvolte nell’apoptosi possono essere divise in iniziatrici (caspasi 8 e 9) e caspasi effettrici (caspasi 3).

Vie dell’apoptosi

• La via estrinseca che viene attivata dai segnali extracellulari che agiscono su recettori di morte trimerici, i cui ligandi sono TNF e Fas. Il recettore una volta legato il ligando libera il DD (death domain) che tramite la proteina adattatrice FADD lega questo complesso ed è in grado di attivare la procaspasi 8 a caspasi 8 che a sua volta porterà all’attivazione della caspasi effettrice 3.
• La via intrinseca che viene attivata dal rilascio di citocromo c da parte dei mitocondri, quest’ultimo è solubile nella zona intermembrana e in caso di danno alla membrana esterna viene rilasciato e determina l’attivazione della caspasi 9 che a sua volta attiva la caspasi 3.

Le due vie comunicano e vengono regolate da:

• Comunicano tramite la proteina BID che viene proteolizzata dalla caspasi 8 con formazione di t-BID che agisce a livello della membrana esterna mitocondriale facilitando il passaggio del cytC;
• Bax e Bad sono due proteine che stimolano il rilascio del cytC;
• Bcl-2 inibisce il rilascio di cytC ed è per questo che mutazioni in cui si ha una sua overespressione portano a fenotipo tumorale;
• Le IAP (inhibitors of apoptosys proteins) legano il sito attivo delle procaspasi 9 e 3 inibendo quindi la loro attivazione e lo stimolo apoptotico;
• Le proteine cFLIP sono proteine che possiedono un dominio DD e fanno da specchietto per le allodole per FADD in quanto non possedendo un dominio catalitico non attivano la procaspasi 8 e portano alla morte del segnale.

Caspasi

Le caspasi vengono divise in caspasi apicali e in caspasi effettrici:

• Le caspasi apicali vengono attivate dal legame con una piattaforma di ancoraggio in quanto quest’ultima lega due procaspasi che per prossimità diventano una il substrato dell’altra con conseguente liberazione della caspasi attiva. La procaspasi 9 si attiva attraverso un enzima convertasi specifica che prende il nome di Apaf-1, che in condizioni basali è ripiegata su se stessa. Quando viene legata dal cytC si libera il suo dominio HUB che si irrigidisce in presenza di ATP e permette l’autoassemblaggio di 7 Apaf con i rispettivi cytC, legati al WD domain, a formare una struttura circolare. La zona centrale di questa struttura circolare è la sede di ancoraggio di 2 procaspasi 9 (apoptosoma) che per prossimità si autoattivano con liberazione delle caspasi attive, perché ci sia l’attivazione è necessaria ATP;
• Le caspasi effettrici vengono attivate dalle caspasi apicali attive e agiscono direttamente sui loro bersagli che porteranno all’attivazione del processo apoptotico. Una caspasi effettrice inoltre non può attivare una caspasi apicale e ciò comporta che la cascata delle caspasi sia lineare e non esplosiva.

Mitocondri e apoptosi

I mitocondri oltre al cytC, contenuti nei sacculi, contengono:

• SMAC/DIABLO che sono inibitori delle IAP e quindi una loro liberazione nel citoplasma permette al processo apoptotico di procedere;
• ENDONUCLEASI G che sono caratteristiche perché una volta rilasciate tagliano la cromatina in un processo caspasi-indipendente e rappresentano quindi una via diretta per il taglio della cromatina.

Quando arriva un segnale di morte extracellulare si ha l’attivazione della caspasi 8 che porta alla formazione di tBID che insieme a BAX o BAD porta alla formazione sulla membrana esterna di un canale che permette la fuoriuscita del cytC, quest’ultimo però essendo contenuto nei sacculi esce in modo quantico.

Se a ciò si aggiunge il rimodellamento della membrana interna, transizione di permeabilità, permette un massiccio rilascio di cytC, questo rimodellamento se eccessivo può portare ad una rottura della membrana esterna con conseguente rilascio di CytC, SMAC/DIABLO e Endonucleasi G.

L’apoptosi può procedere perché l’ATP necessaria viene fornita da mitocondri che rimangono funzionanti. In caso in cui però manchi ATP un evento inizialmente apoptotico può trasformarsi in necrosi con conseguente flogosi.

Morfologia apoptosi

• Il volume cellulare tende a contrarsi, contrario della necrosi, a causa della proteolisi dei filamenti actinici;
• L’aumento dell’attività transglutaminasica porta alla formazione di cross-link fra proteine diminuendo il potere osmotico e favorendo l’ulteriore perdita d’acqua;
• Si ha la degradazione regolata della cromatina nel processo che prende il nome di laddering con conseguente contrazione nucleare;
• La cellula continua la sua fase di contrazione formando BLEBS che permettono la facile eliminazione dei residui da parte del sistema macrofagico che rimuove i cosiddetti corpi apoptotici.

Per quanto riguarda la membrana l’evento tipico dell’apoptosi è l’esposizione sulla membrana esterna delle fosfatidilserine, tipicamente sulla membrana interna, grazie all’inibizione della flippasi che viene inattivata dalla caspasi 3. Quest’ultima inoltre stimola il rilascio di citochine che portano i macrofagi in loco per la rimozione dei corpi apoptotici.

A livello nucleare avviene:

• La caspasi 3 taglia la lamina che è una componente della membrana nucleare e quindi la sua rimozione facilita l’accesso agli acidi nucleici;
• La caspasi 3 taglia le ICAD che quindi non inibiscono più le CAD (caspase activated DNAse) che tagliano il DNA in unità nucleosomiali precise;
• La caspasi 3 infine taglia l’enzima PARP che ha la funzione di riparare il DNA e viene inibita anche la topoisomerasi.

DNA mitocondriale

Il DNA mitocondriale è un doppio filamento circolare di circa 17000 basi che codifica per 37 geni fra cui quelli che codificano per la NADH deidrogenasi, per la citocromo ossidasi e per il citocromo b. In tutto sono codificate 13 proteine di cui 11 sono della catena respiratoria e 2 dell’ATP sintetasi.

Effetto soglia mitocondriale

Il DNA mitocondriale si replica tramite la DNA polimerasi gamma che nonostante abbia un sistema di riparazione integrato commette una quantità di errori maggiore rispetto alla replicazione nucleare e questo porta il DNA mitocondriale ad avere un numero di mutazioni maggiori.

Nel caso le mutazioni coinvolgano geni si avranno dei mitocondri con fenotipo malato e visto che, nella replicazione cellulare, i mitocondri segregano in modo casuale, in cellule diverse possono esserci in proporzioni variabili mitocondri sani e altri malati.

Con effetto soglia si intende quel fenomeno per cui finché la popolazione di mitocondri sani riesce a sopperire alle mancanze di quelli malati il fenotipo è normale mentre quando questa soglia viene superata prevale il fenotipo malato.

Reversibilità fosforilazione ossidativa

Quando si ha un calo di ossigeno, ipossia, manca l’accettore finale di elettroni e quindi si ha un blocco della catena respiratoria e di conseguenza della produzione di ATP, si arriva alla situazione in cui la concentrazione di ATP citoplasmatico è maggiore di quello mitocondriale e si ha quindi che invece di avere un flusso in uscita dal mitocondrio si avrà un flusso in entrata, il mitocondrio diventa ladro di ATP.

L’ATP sintetasi funziona in entrambi i sensi e quindi si avrà il consumo di ATP con pompaggio dei protoni verso l’esterno.

La cellula però continua nella sua produzione di specie ridotte e si ha quindi un eccesso di elettroni che cominciano a sfuggire dalla catena respiratoria con conseguente formazione di ROS.

Danno da riperfusione

Si è osservato che dopo un evento ischemico la riperfusione porta ad un danno maggiore così tramite l’esperimento di Kaltenbach si è scoperto essere la catena respiratoria mitocondriale la causa del danno. L’esperimento infatti prevedeva di utilizzare il cianuro che legando l’eme blocca la citocromo ossidasi e si è visto che non si veniva a creare danno da riperfusione.

Accumulo di succinato nell’ipossia

Durante l’ipossia si è notato che si ha un accumulo di succinato, tramite esperimenti con glucosio marcato si è appurato che il succinato non deriva dal ciclo di Krebs ma bensì dall’accumulo di substrati, in particolare l’accumulo di aspartato-ossalacetato che visti gli elevati livelli di NADH invece di procedere nell’ossidazione viene convertito in malato che a sua volta forma fumarato, inoltre durante l’ischemia per il calo dell’ATP si ha l’inversione del ciclo dell’urea con formazione di fumarato a partire dall’aspartato.

RET (reverse electron transfer)

Meccanismo che avviene al momento della riperfusione dopo un evento ipossico che ha causato l’accumulo di succinato. Quando l’ossigeno torna disponibile la quantità di succinato è tale da causare l’inversione del flusso di elettroni nella catena respiratoria attraverso la succinico deidrogenasi ed il complesso I.

Questo causa la formazione di anione superossido O2- che tramite reazione di Haber-Weiss, di cui la seconda parte è la reazione di Fenton che avviene con perossido di idrogeno, porta alla formazione di radicale idrossile OH- che essendo molto reattivo porta a danni cellulari.

Transizione di permeabilità

Nella cellula quando l’ATP cala le pompe sodio potassio non possono più funzionare e nemmeno l’uptake del calcio da parte del reticolo sarcoplasmatico e quindi il calcio citoplasmatico viene preso dai mitocondri dove però insieme alla produzione dei ROS per la RET causa l’apertura del poro di transizione di permeabilità che si trova sulla membrana interna che indirettamente danneggia quella esterna per via del rigonfiamento mitocondriale.

Questo fenomeno è reversibile se si utilizza un chelante del calcio e se si fornisce il citocromo c che nel frattempo è uscito. Questo poro si mantiene chiuso quando è in presenza di un potenziale elevato, di magnesio e nucleotidi, con solfidrili ridotti e se è presente ciclosporina A e protoni.

Necroptosi

La necroptosi è un tipo di morte cellulare necrotica programmata ed è morfologicamente identica alla necrosi. Avviene in seguito al blocco della morte apoptotica tramite meccanismi di deubiquitinazione a livello recettoriale.

I protagonisti di questa via sono:

• TNF che lega il suo recettore;
• Il recettore TNFR1;
• RIPK1 che è un partner che forma il recettore trimerico e che normalmente in seguito al legame di TNF viene ubiquinato. Questa ubiquitinazione porta all’attivazione della via di sopravvivenza cellulare tramite assemblaggio del complesso IKK formato da IKK-alpha, IKK_beta e NEMO che portano all’attivazione della via di NfKb. La sua deubiquitinazione invece funge da segnale per l’attivazione della via apoptotica in quanto si ha la formazione del complesso II, formato da TRADD, FADD, CYLD uno deubiquitinasi e caspasi 8, che viene avvicinato dalla seconda caspasi che media la rimozione di CYLD, RIPK1 e l’attivazione della caspasi che porterà all’innesco della via apoptotica;
• Se manca l’attivazione della caspasi 8 perché questa viene inibita dalle IAP e quindi non si ha l’inattivazione di RIPK1 che, essendo una chinasi, media la fosforilazione di RIPK3 e innesca un processo a cascata di auto e etero fosforilazioni che portano alla formazione di una catena di RIPK3 a formare microfilamenti, si ha attivazione tramite fosforilazione anche di MLKL dopodiché i filamenti si allungano fino a raggiungere la membrana plasmatica e ciò funge da innesco della necroptosi. Si ha infatti il rilascio di ROS e l’aumento della concentrazione di calcio citosolico che portano alla morte cellulare e al rilascio di DAMPS che attiveranno una risposta infiammatoria;
• Nel caso in cui venga attivato il programma della necroptosi ma ci sia inibizione delle IAP, per esempio da parte di Smac/DIABLO, si avrà la formazione di un complesso anomale che prende il nome di IIb e che contiene oltre a RIPK1, TRADD, FADD e la caspasi 8 anche RIPK3. Questa via porta all’apoptosi nonostante sia partita come necroptosi.

I possibili meccanismi che possono portare all’innesco della necroptosi sono:

• PTP ossia il poro di transizione di permeabilità, attivato da aumento del Ca e ROS, causato dalla sua eccessiva apertura che porta a deplezione di ATP e NAD+;
• Ferroptosi in cui l’innesco è dato dalla disregolazione dello scambiatore cistina/glutatione che ha la funzione di aumentare i livelli citoplasmatici di glutatione. Il meccanismo è ferro-dipendente e tramite chelanti può essere inibito. Il danno deriva dalla mancanza