Riassunto completo e dettagliato di Istologia, programma d'esame

Istologia

I principali costituenti della cellula

Le proteine: le proteine assumono diverse disposizioni spaziali in base alla presenza di legami particolari, problema per il preparato istologico, in quanto per prepararlo cambiamo la reale conformazione proteica (ad esempio con la denaturazione). Tuttavia, conoscendo gli effetti delle sostanze utilizzate, quale alterazione viene prodotta, si può comunque studiare il preparato istologico. Le proteine le troviamo anche libere nei liquidi circolanti, oppure complessate per dare una funzione particolare (forma = struttura).

I lipidi: i trigliceridi sono la costituente principale delle membrane cellulari, barriere altamente selettive e dinamiche, che non sono solo l’involucro della cellula, ma ne mantengono una composizione chimica specifica, diversa dall’ambiente extracellulare. I lipidi contribuiscono a mantenere questa differenza tra ambiente intracellulare e extracellulare. Vi sono differenti classi di lipidi (la sfingomielina in particolare si trova soprattutto nelle membrane cellulari dei neuroni). La differente concentrazione e presenza di lipidi nelle membrane cellulari caratterizza le differenti cellule.

I glucidi: vi sono differenti tipi di zuccheri (ad esempio glucosio, galattosio e fruttosio); il principale è il glucosio, presente nel sangue, viaggia da un ambiente all’altro ed è la principale fonte di energia per tutte le cellule del nostro organismo (al secondo posto i lipidi e al terzo le proteine). Il glucosio può passare da un ambiente all’altro con estrema facilità, contrariamente ad altre possibili fonti di energia che sarebbero disponibili in tempi molto più lunghi.

Talvolta si formano delle strutture intermedie: glicoproteine, glicolipidi ecc., variabilità delle strutture chimiche molto elevata.

Gli acidi nucleici: DNA e RNA, caratterizzati soprattutto dal diverso tipo di zucchero (desossiribosio e ribosio); vengono chiamati acidi nucleici in quanto il DNA è esclusivamente situato all’interno del nucleo, salvo una piccola quantità presente nei mitocondri, che hanno un DNA proprio. L'RNA lo si può trovare sia nel nucleo sia nel citoplasma; l'RNA è quindi in grado di superare la membrana del nucleo per passare nel citoplasma e svolgere le sue funzioni. Il DNA è ciò su cui la cellula basa le sue attività vitali.

Acqua: componente indispensabile per la vita.

Sali e ioni: come il sodio, il cloro e il potassio (cloro carico negativamente, sodio e potassio positivamente), lo zinco, il rame, il calcio (fondamentale per la trasmissione dell’impulso nervoso, per la contrazione muscolare, fondamentale costituente delle ossa — calcio tipico di alcuni tessuti).

Organizzazione della materia vivente

• Virus e fagi: “privi di vita autonoma” hanno bisogno di altri per la loro replicazione e sopravvivenza.
• Procarioti: sono in grado di vita autonoma, possono svolgere da soli il loro ciclo vitale completo; sono a volte presenti in ospiti ma possono farne a meno.
• Eucarioti: sono in grado di vita autonoma e abbiamo una cellula compartimentata, con strutture organizzate — salto di qualità rispetto ai procarioti, struttura più complessa.
• Pluricellulari (metozoi e metafiti): NB i batteri non si assemblano tra di loro a creare strutture più complesse.
• Unicellulari (protozoi e protofiti)

Le cellule quindi possono assemblarsi fino a costituire tessuti, che si assemblano a formare organi, che si assemblano a formare sistemi e apparati (gli organi hanno funzioni diverse ma tutti collaborano a uno stesso fine).

Le cellule

La cellula è una minima quantità di materia vivente capace di vita autonoma; è la più piccola unità gerarchica, strutturale e funzionale che costituisce gli organismi viventi (NB i globuli rossi non sono cellule). Il tessuto è il secondo livello di organizzazione gerarchica, formato da cellule strutturalmente identiche tra di loro (ad esempio muscolo formato da fibre muscolari). I tessuti poi si assemblano tra loro (tessuti diversi) a formare organi (anche tessuti identici ma in quantità diversa danno vita a organi diversi). Gli organi si assemblano infine a formare apparati, che poi danno luogo all’organismo.

Unità di misura utilizzate in microscopia ottica ed elettronica

• Millimetro: 1mm 10^-3 m
• Micrometro: 1μm 10^-6 m
• Millimicron o nanometro: 1nm 10^-9 m
• Angstrom: 1 Å 10^-10 m

Dimensioni nell’ambito biologico

• 0.1 mm e oltre: anatomia organi occhio e lente
• Da 100 a 10 μm: istologia tessuti diversi tipi di microscopio ottico
• Da 10 a 0.2 μm: citologia cellule
• Inferiore a 0.2 μm: ultrastruttura organuli cellulari microscopio elettronico
• Inferiore a 1 nm: struttura molecolare e colorazioni, marcature atomica

Il protoplasma: è l’ambiente in cui si svolgono tutte le reazioni chimiche della cellula (elementi maggiori fino al 98,5%: O, C, H, N, Ca, P; elementi minori 0,8 %: S, K, Na, Cl, Mg, Fe; elementi in tracce 0,7%: Cr, Co, Cu, F, I, Mn), in cui il costituente principale è comunque l’acqua, il solvente principale degli esseri viventi. NB: le cellule non sono quasi mai sferiche.

La superficie apicale della cellula ha delle specializzazioni di membrana, che la distinguono dalle altre superfici deve assorbire le sostanze dall’esterno, quindi abbiamo ad esempio microvilli, per aumentare la superficie di assorbimento. Il nucleo è spostato verso la superficie basale della cellula, ed è circondato dal reticolo endoplasmatico rugoso e poi vi è quello liscio. L’apparato di Golgi è circondato da vescicole ecc.

Metodi per lo studio dei campioni biologici

Osservazione di tessuti in vivo (come si comporta nel suo ambiente):

• Colorazioni vitali
• Colorazioni sopravitali
• Colture in vitro

Osservazione di tessuti fissati e colorati:

• Preparati stabili
• Metodi istochimici
• Metodi immunoistochimici (anticorpi diretti contro certe componenti della cellula ma che reagiscono in maniera mirata solo contro quelli che contengono l’antigene)
• Autoradiografia

Esempio: il blu Trypan marca le cellule necrotiche, più sono blu più lo stato di necrosi è avanzato.

Microscopio ottico

• Tavolino
• Stativo
• Oculari
• Obiettivo
• Fonte luminosa (regolabile)
• Condensatore (deve concentrare il fascio di luce sul preparato)
• Viti per la messa a fuoco del campione

Il potere di risoluzione è la distanza minima interposta tra due punti affinché questi possano essere riconosciuti distinti; il limite di risoluzione di un microscopio ottico generico è di 0,2 μm. R = λ / 2n sin(α) (lunghezza dell’onda trasmessa) poiché non posso variare la lunghezza d’onda della mia fonte luminosa, per diminuire R (ovvero aumentare il potere di risoluzione) posso solo aumentare l’apertura numerica. Il fascio luminoso si disperde ben oltre i limiti del campione, quindi crea un problema; più l’obiettivo ha una grande capacità di ingrandimento, più mi devo avvicinare al campione per osservarlo, altrimenti non riesco a metterlo a fuoco (se al posto dell’aria metto l’olio, l’indice di rifrazione cambia, quindi la luce passa in maniera diversa e mi permette una definizione maggiore).

Ingrandimento: rapporto tra dimensione dell’immagine vista al microscopio e la dimensione dell’oggetto. L’ingrandimento totale dipende dall’ingrandimento dell’obiettivo x l’ingrandimento degli oculari.

Contrasto: dipende dalle differenze di assorbimento della luce; posso intervenire colorando.

Passaggi per la preparazione

1. Prelievo del tessuto vivo
2. Fissazione del tessuto il prima possibile (ad es tramite la formaldeide)
3. Disidratazione con una serie graduata ascendente di soluzioni di alcool
4. Inclusione (metterlo in una sostanza che mi permetta di utilizzarlo ad esempio con la paraffina)
5. Taglio delle sezioni con la lama d’acciaio del microtomo
6. Montare sul vetrino
7. Eliminazione della paraffina con xilene o toluene
8. Reidratazione con scale discendenti di alcool
9. Colorazione delle sezioni
10. Disidratazione tramite serie graduate ascendenti di alcool

Fissazione

• Chimica: soluzioni isotoniche, pH fisiologico 7,4
• Fisica: ghiaccio secco o azoto liquido (-170°C) più rapido, anche se l’osservazione è più difficile; si usa soprattutto in sala operatoria.

Il fissativo ha il compito di bloccare il metabolismo cellulare, prevenire l’autolisi della cellula, uccidere gli eventuali organismi patogeni, formare dei legami crociati con le molecole (cross-linking rafforzamento del collagene) o denaturare le proteine fissando le componenti tessutali. La scelta del fissativo chimico: il problema del fissativo chimico è che cambia la struttura delle proteine che vanno incontro a coagulazione, polimerizzazione, indurimento (utile per il sezionamento); i fissativi hanno un “livello di assorbimento” differente, si sceglie in base alla natura dei costituenti e a quali strutture particolari vanno preservate; si cerca di preservare il più possibile la natura del campione.

- Formalin: (formaldeide al 37 %) non altera significativamente la struttura delle proteine, però non fissa i lipidi e nemmeno ioni o piccole molecole come amminoacidi, nucleotidi, glucosio, glicogeno, proteoglicani ecc.

- Tetrossido di osmio: preserva le membrane nucleari e crea maggior contrasto utile per l’osservazione al TEM

- Gluteraldeide e paraformaldeide: formano reticoli più stretti di quelli della formaldeide, permettono quindi di osservare anche i piccoli acidi nucleici

Inclusione

L’inclusione serve a indurire il campione per poterlo tagliare in sezioni finissime (5-15 μm). Per poter effettuare l’inclusione occorre prima disidratare il campione utilizzando soluzione a concentrazione crescente di alcol, e poi chiarificare, ovvero sostituire all’alcol lo xilolo o toluolo. Infine si può impregnare il campione nella sostanza includente, come ad esempio la paraffina.

• Paraffina: miscela di idrocarburi solidi, soprattutto alcani
• Resina epossidica (per le sezioni di 50-150 μm)

A questo punto si può tagliare il campione con un microtomo e reidratare i campioni con soluzioni a concentrazione decrescente di alcol e poter poi effettuare la colorazione.

Il colorante

• Basico: (es. ematossilina, blu) colora bene le sostanze acide ad esempio gli acidi nucleici quali il DNA, RNA, ribosomi ecc; mostra il nucleo e le zone di citoplasma che producono proteine.
• Acido: (es. eosina, rosa) colora bene le sostanze basiche, mitocondri, componenti del citoplasma per la sintesi dei lipidi.

Posso usare entrambi i componenti insieme colorante ematossilina-eosina — EE: ematossilina-eosina

• Orceina o resorcina: evidenzia bene le fibre elastiche (blu scuro)
• Colorazione di Azan Mallory: evidenzia fibre collagene e connettivi (blu scuro)
• Impregnazioni argentiche: fibre reticolari e membrane basali
• PAS (acido periodico reattivo di Schiff): carboidrati e macromolecole di carboidrati (blu e rosa)
• Blu di toluidina: granuli dei mastociti (porpora)
• Reazione di Fuelgen: DNA (rosso magenta)

Per ottenere informazioni sulla funzione delle cellule e sui componenti di un tessuto, si può utilizzare una vasta serie di tecniche

• Istochimica: coloranti specifici, digestione enzimatica (accoppiata alla colorazione per confermare l’identità di una sostanza), enzimoistochimica (reagenti di cattura fissano il prodotto di un enzima in modo da poterlo localizzare).
• Immunocitochimica: uso di anticorpi legati a un fluoroforo come la fluoresceina o coloranti fluorescenti; si possono utilizzare anticorpi monoclonali o anticorpi policlonali (anticorpi di uno stesso antigene ma diversi tra loro). Si possono distinguere una immunofluorescenza diretta o una immunofluorescenza indiretta (anticorpo primario riconosciuto a sua volta da un anticorpo secondario).
• Tecniche di ibridazione: si crea una sonda marcata con isotopi, fluorofori o antigeni (come la digossigenina); la sonda può essere una sonda di DNA o di RNA e si possono usare più sonde contemporaneamente (FISH).
• Autoradiografia: piccole molecole, come amminoacidi o nucleotidi, vengono marcati con degli isotopi radioattivi (P³², S³⁵, H³) iniettati in cellule o animali vivi; a questo punto si preleva il tessuto e si osserva come queste molecole sono state incorporate in strutture più grandi immergendo il campione in una emulsione fotografica.

Il microscopio elettronico

Il microscopio elettronico (SEM, TEM) usa un fascio di elettroni (bobine magnetiche, schermo fluorescente) che bombarda il campione molto sottile con un fascio di elettroni per esaminare l’ultrastruttura del tessuto; le immagini sono in bianco e nero. Esamina come quel fascio viene deflesso in maniera differente dalle strutture presenti nel campione, diverse dal punto di vista chimico e fisico (TEM). Se uso un SEM, sempre elettronico ma a scansione, posso avere l’idea della tridimensionalità (sempre in bianco e nero); il fascio di elettroni scorre in parallelo, non perpendicolarmente. Il TEM ingrandisce più del SEM, ma non dà caratteristiche sulla sua tridimensionalità. Il microscopio a trasmissione e quello a scansione danno informazioni diverse; hanno però in comune che non utilizzano la luce ma un fascio di elettroni collimato (bande di elettroni parallele tra di loro, rettilinee, che si muovono alla stessa velocità). Viene creato il vuoto in modo tale che il fascio di elettroni arrivi sul preparato in maniera retta; se il fascio non è ben collimato possono avvenire delle aberrazioni. Per preparare il campione per il microscopio elettronico occorre creare delle fettine ultrasottili (si utilizza un ultramicrotomo); per poter fare questo occorre usare dei fissativi molto più potenti; il più utilizzato è il tetrossido di osmio, che fissa bene il preparato rendendolo rigido e inoltre funge anche da colorante, permettendo di ottenere un contrasto tra le strutture che permette una buona osservazione dal microscopio. Per l’inclusione, che permette la formazione di un blocchetto che permetta il taglio, non viene usata la paraffina ma delle resine sintetiche (resina a base di Epon o di Araldite).

Per indicare il campo che viene messo a fuoco si usa il termine “spot” che può essere largo o stretto; se lo spot size è stretto abbiamo una risoluzione maggiore, ma se devo visualizzare dei campi di maggiore estensione lo spot size largo è più indicato (se poi devo vedere meglio una parte precisa posso analizzarla in maniera più dettagliata con uno spot size più stretto). Anche nel caso della microscopia elettronica vale il discorso della profondità di campo; è possibile mettere a fuoco il campione a profondità diverse; se aumento la profondità di campo ottengo però un minor dettaglio (dipende sempre da cosa si vuole analizzare). Minore è l’apertura della lente obiettivo e maggiore è la distanza di lavoro WD, maggiore è la profondità di fuoco.

La cellula

La cellula è caratterizzata da una forma, delle dimensioni, una struttura e ultrastruttura, e un rapporto forma/funzione. Una cellula ha una membrana cellulare, un citoplasma con tutti i suoi componenti, un nucleo dotato di membrana che lo separa dal citoplasma (NB, le piastrine non sono cellule, e nemmeno i globuli rossi quando manca uno dei tre elementi non è più una cellula). Lo zigote è la cellula progenitrice che porta alla formazione di tutte le altre cellule e tessuti e organi. Lo zigote è quindi fatto da cellule ognuna delle quali è totipotente, infatti è in grado di trasformarsi in tutte le cellule di tutti i tessuti dell'organismo, compresi quelli extraembrionali. Lo zigote poi forma tre tessuti embrionali: ectoderma, mesoderma e endoderma. L’ectoderma è il tessuto embrionale che si forma per primo, mentre l’endoderma “aspetta” e il mesoderma non c’è ancora. Questi tessuti sono pluripotenti, hanno già delle specificità. Con una restrizione progressiva poi si formano cellule multipotenti, come tutte le cellule del sangue, quelle delle ossa ecc (le cellule diventano sempre più specializzate, sempre meno in grado di trasformarsi in tante cose diverse); si passa quindi da una multipotenza, in cui le cellule possono ancora differenziarsi in vari modi, all’unipotenza, elementi che possono dare origine solo a cellule uguali a se stesse e che non potranno più modificare il loro percorso evolutivo (granulociti, linfociti, mastociti, epatociti...). Le cellule staminali sono cellule tra multi e pluripotenza, possono avere corsi evolutivi diversi (se prendo delle cellule staminali e le metto insieme a cellule miocardiche, queste diventano cellule miocardiche, c’è ancora la possibilità di fargli prendere una strada diversa; ciò che comanda sono i segnali che invia e che riceve dall’ambiente che la circonda. Tutte le cellule hanno gli stessi geni, ma solo alcuni sono stati attivati, anche una cellula del miocardio ha i geni necessari.