Riassunto Biotecnologie delle Specie Legnose

MMUNODIAGNOSI

relativamente semplice e rapida, dotata di elevata sensibilità, che utilizza piccole quantità di ANTISIERO

(soluzione contenente anticorpi specifici), non esige sofisticate apparecchiature e può essere impiegata sia

con un numero ridotto o con parecchi campioni da saggiare.

La tecnica ELISA consiste nel creare un legame tra antigene ed anticorpo (proteine specifiche che si

assicurano fortemente agli antigeni, formando complessi che vengono individuati ed eliminati dalle cellule

fagocite, proteggendo l’ospite dall’infezione) specifico in modo da evidenziarlo con una reazione colorata

ottenuta tramite reazione enzimatica. Le procedure ELISA attualmente usate si possono riunire in due

categorie principali:

 Procedure dirette: nelle quali l’antigene immobilizzato ad una matrice solida è rilevato tramite

l’anticorpo specifico coniugato con l’enzima.

 Procedure indirette: che si avvalgono di antisieri specifici non legati all’enzima, l’anticorpo che si

lega con l’antigene è evidenziato da un secondo anticorpo coniugato all’enzima che reagisce con le

globuline del primo antisiero.

Nella versione più comune, quella diretta a doppio strato di anticorpo DAS-ELISA (alta specificità, ha

bisogno di una coniugazione tra siero ed enzima).

L’anticorpo è adsorbito ad un supporto solido come i pozzetti di micropiastre, successivamente si aggiunge

il succo estratto dai campioni da esaminare, l’antisiero specifico coniugato con l’enzima ed il substrato per

l’enzima. Tramite successivi lavaggi l’anticorpo fissa al supporto solido le particelle virali eventualmente

presenti nel succo vegetale. In pratica la reazione positiva si riconosce ad occhio nudo dalla colorazione del

substrato, idrolizzato dall’enzima.

La procedura diretta a doppio strato di anticorpi è altamente specifica. La rilevazione di un ceppo di virus

con proprietà antigeniche affini è condizionata dalla sua relazione sierologica con il ceppo per il quale

l’antisiero è stato preparato. Questa qualità selettiva è vantaggiosa in circostanze in cui necessita

distinguere ceppi di un virus ma rappresenta un inconveniente qualora tutti i ceppi di virus debbano essere

Bruschi Pietro

evidenziati, per porre rimedio a questo aspetto sono state sviluppate procedure alternative di ELISA

indiretta che consentono di evidenziare un’ampia gamma di virus sierologicamente correlati.

M : I virus possono essere visualizzati da un microscopio elettrico o, per i virus che

ICROSCOPIA ELETTRONICA

hanno bisogno di bassa concentrazione, questo metodo può essere migliorato dall’immunomicroscopia

nella quale le particelle di virus sono decorate usando specifici anticorpi.

La visualizzazione di particelle virali con il microscopio elettronico è stata usata non solo per evidenziare la

presenza del virus, ma anche per stimarne la forma, dimensione e distribuzione.

Tecniche comunemente usate per rivelare particelle virali nella linfa consistono nell’ombreggiatura,

colorazioni negative, preparazione di repliche di superficie e microscopia a scansione.

Un importante metodo di rilevamento è costituito dall’osservazione diretta al microscopio elettronico del

prodotto dell’interazione anticorpo-antigene. Il T o ISEM (ImmunoSorbent Electron Microscopy):

RAPPING

griglie da microscopia preparate di fresco con un film di carbonio vengono fatte galleggiare per circa 30

minuti su una piccola quantità di antisiero diluito. Durante questo processo uno strato di proteine del siero

vengono adsorbite dal film, le griglie vengono poi dilavate su una soluzione tampone per rimuovere

l’eccesso e in fine vengono poste sulla sospensione del virus o dell’estratto di tessuto infetto per circa 1-2

ore.

Gli anticorpi precedentemente adsorbiti sulla griglia intrappolano le particelle virali omologhe e i virus

vengono visualizzati tramite la microscopia elettronica con procedure standard.

I : La scoperta di virus può avvenire anche con analisi del DNA. Ciò si può

BRIDAZIONE DI ACIDI NUCLEICI

effettuare tramite (sintesi di una sonda, tamponamento della pianta estratta

IBRIDAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI

su una membrana, ibridazione del tampone con la sonda) e tramite RT-PCR.

Mentre nella reazione sierologica ELISA si ha l’associazione fra l’antigene e l’anticorpo, nella ibridazione di

acidi nucleici si ha l’aggregazione fra due acidi complementari. Ai fini diagnostici la tecnica cDNA

rappresenta una metodologia per evidenziare gli agenti infettivi per i quali non si dispone un appropriato

antisiero.

Il metodo dell’ibridazione si basa sulla caratteristica che hanno due filamenti di acido nucleico a catena

singola di unirsi in corrispondenza delle sequenze nucleotidiche complementari formando un ibrido a

catena doppia. Il concetto di base consiste nel rivelare la presenza dell’acido nucleico del virus attraverso la

sua ibridazione con un filamento di acido nucleico ad esso complementare, opportunamente marcato per

poterlo facilmente mettere in evidenza.

Nel caso dei fitovirus il cDNA viene sintetizzato per via enzimatica utilizzando DNA polimerasi RNA-

dipendente o trascriptasi inversa e come stampo la sequanza di basi dell’RNA dell’agente infettivo; il cDNA

così ottenuto può essere a sua volta clonato in plasmidi batterici in modo da ottenere un’elevata quantità

di molecole da utilizzare come sonda.

Una importante tecnica diagnostica che si serve del metodo dell’ibridazione è quella cosiddetta del “dot-

blot hybridization”. Le sue fasi consistono nell’applicare una piccola quantità di estratto vegete da saggiare

in una matrice solida e ivi fissarlo tramite calore, questa vien poi esposta alla sonda marcata. In questa fase

le molecole si appaiano con le molecole di acido nucleico del patogeno ad esse complementare per formare

molecole ibride di DNA-RNA le quali vengono poi rilevate in maniera appropriata: se si opera con una sonda

marcata con P32 si rileva la radioattività sulla membrana tramite radiografia, se si utilizza invece una sonda

legata a biotina la risposta è data da una reazione colorimetrica.

Bruschi Pietro

P C R (PCR): La reazione a catena della polimerasi è una procedura che consente la

OLYMERASE HAIN EACTION

moltiplicazione di frammenti di acidi nucleici (“template”) dei quali si conoscano le sequenze nucleotidiche

in vitro; questo si rivela molto utile quando le cellule sono troppo poche per essere evidenziate da altre

metodiche. È possibile quindi amplificare la quantità di virus per rivelarne o meno la presenza.

Viene preparata una provetta con al suo interno: una minima quantità del segmento di DNA del virus, una

quantità opportuna di nucleotidi liberi per costituire i nuovi filamenti, opportuni inneschi detti primer

complementari alle estremità 5' e 3' dei due filamenti del segmento da riprodurre, un enzima DNA

polimerasi termo-resistente (TAQ polimerasi) ed altri elementi di supporto (Cloruro di Magnesio) necessari

alla DNA polimerasi.

La provetta viene inserita in una macchina capace di innalzare ed abbassare la temperatura ciclicamente,

qui raggiunge prima una temperatura di 95° alla quale il DNA viene denaturato (ovvero separa i due

filamenti dell’elica). A questo punto la temperatura si abbassa attorno ai 70° per favorire l’annidamento dei

primers nelle regioni compatibili del DNA, che andranno a rappresentare la sequenza d’inizio che si vuole

amplificare. I primers fanno in modo che la TAQ polimerasi trovi un sito preciso a cui legarsi e da cui

procedere con la sintesi di nuovi filamenti, associando i nucleotidi giusti.

Al termine del ciclo ognuno dei due filamenti di DNA sarà stato copiato per formare due molecole di DNA

(in parte) a doppio filamento. Man mano che i cicli vengono ripetuti (fino a 30-40 volte) aumentano

esponenzialmente le molecole di DNA target senza filamenti aggiuntivi, mentre quest’ultimi vanno

scomparendo.

La tecnica della RT-PCR è una variante e consiste nella sintesi di una molecola di DNA a doppio filamento a

partire da uno stampo di RNA (poiché la maggior parte delle infezioni sono date da RNA-virus) tramite un

enzima di trascrittosi inversa. La molecola di DNA sintetizzata mediante il processo di retrotrascrizione è

definita cDNA.

In fine vengono visualizzati i frammenti moltiplicati tramite l’elettroforesi su gel d’agarosio: il campo

elettrico funge da setaccio di peso molecolare spingendo il campione a correre lungo le maglie del gel verso

l’estremità opposta. I frammenti più piccoli corrono più in fretta, quindi a fine corsa si troveranno più

lontani dall’origine (la visualizzazione del DNA è permessa da un colorante caricato nel gel, che emette luce

fluorescente quando irradiato con UV). Bruschi Pietro

RISANAMENTO DA VIRUS

Il risanamento da virus si basa per lo più sulla sensibilità alle alte temperature da parte dei virus e sulle

proprietà del meristema delle piante.

Il meristema apicale permane in uno stato di attività di divisione cellulare per tutta la fase vegetativa della

pianta eccetto che per i periodi di dormienza. Questo meristema se coltivato in vitro su un adatto mezzo

nutritivo ed in condizioni ambientali ottimali, si accresce e genera una pianta intera con caratteristiche

genetiche identiche alla pianta madre.

In alcune specie, ogni meristema in coltura dà luogo ad una sola pianta, mentre in altre l’accrescimento del

meristema produce un certo numero di piante costituendo un efficiente metodo di propagazione massale.

In taluni casi può determinare l’insorgenza di tessuto indifferenziato da cui possono originarsi piante da

gemme avventizie; occorre pertanto verificare la rispondenza genetica.

La produzione di piante esenti da virus segue generalmente questa procedura:

1) Prelievo delle piante infette;

2) trattamento a calore;

3) coltura meristematica / microinnesto;

4) formazione dei germogli (test sul virus – moltiplicazione germogli);

5) radicazione dei germogli;

6) trasferimento delle piante nel suolo;

7) ultimo test sul virus;

8) propagazione di piante esenti da virus.

C : La tecnica di risanamento da virus tramite coltura di meristemi si basa su una

OLTURA DI MERISTEMI

disuniforme distribuzione dei virus nella pianta, la concentrazione di particelle virali incrementa

allontanandosi dall’apice.

Non è ancora chiaro il meccanismo per cui il meristema apicale contiene pochi o nessun virus: la mancanza

di un sistema vascolare, l’elevata attività metabolica e l’elevato contenuto auxinico possono essere

d’ostacolo al movimento e alla proliferazione di virus.

Fattori che influiscono sul risanamento da virosi tramite la coltura di meristemi:

1) Dime