Riassunto Biotecnologie delle Specie Legnose

Introduzione alle biotecnologie

Biotecnologie: Tecniche che permettono la produzione o modifica di sostanze o prodotti; il miglioramento delle piante o la creazione di micro-organismi per usi specifici grazie all’utilizzo di organismi viventi o parti di questi.

Le piante legnose sono caratterizzate da un alto livello di eterozigosità (organismo costituito dalla presenza di una coppia di alleli diversi – uno dominante ed uno recessivo) dovuta a:

• Apomissia (Capacità di formare un embrione senza fecondazione);
• Lunghi periodi giovanili (Durante i quali le piante non producono frutti);
• Sterilità maschile/femminile/dioica (Organi maschili e femminili portati su due piante distinte);
• Autoincompatibilità (Promuove la variabilità genetica; le piante per autoimpollinazione non riescono a sviluppare il seme, a fecondarsi perché il meccanismo viene interrotto) gametofitica (nell’ovulo non avviene meiosi ma si formano pseudospore diploidi) o sporofitica (l’embrione ha origine da cellula sporofitica non fecondata).

Biotecnologia tradizionale

La domesticazione delle piante è iniziata circa 10.000 anni fa in un ristretto numero di luoghi e riguardo un ristretto numero di specie: grano, orzo, riso, miglio, mais, patate, fagioli. Tutte specie che come caratteristiche principali avevano il valore nutrizionale, la mietitura, la possibilità di immagazzinamento ed adattamento all’ambiente.

I metodi tradizionali utilizzano le ibridazioni per introdurre geni all’interno di una singola specie o da specie strettamente correlate. Il problema è che per introdurre un solo gene si finisce per avere uno scambio totale, e quindi ne vengono introdotti molti altri oltre a quello scelto.

La pratica della domesticazione ha permesso l’evoluzione della civiltà: aumento della produzione di massa nutritiva, fissazione di caratteristiche utili assieme all’eliminazione di quelle inutili, aumento dell’uniformità della coltura. Tuttavia questo metodo non è esente da difetti: ridotto adattamento alla variabilità ambientale, aumento suscettibilità a stress biotici o abiotici, variabilità genetica ridotta.

Biotecnologia avanzata

La moderna biotecnologia permette di spostare i geni singoli, quindi senza trasportare geni indesiderati, e permette di farlo anche tra specie tassonomicamente molto lontane. Le piantine transgeniche derivate dagli zigoti e dalla nucella hanno una fase giovanile molto corta dimostrando la stabilità e l’ereditarietà dei tratti genetici.

La coltura del tessuto delle piante (PTC) si basa sulla totipotenza delle piante (capacità di rigenerare un intero individuo a partire da un tessuto) e comprende una serie di tecniche usate per mantenere o far crescere cellule, tessuti od organi vegetali in condizioni sterili su un mezzo di coltura nutriente di composizione nota.

Questo insieme di tecniche ha portato ad un nuovo metodo di produzione di piante, la micropropagazione, la quale presenta numerosi vantaggi:

• Propagazione clonale (aploide) di massa;
• Piante libere da patogeni (i meristemi sono generalmente esenti da virus);
• Trasferimento dei geni (resistenze a patogeni o sostanze, modifica della crescita, ecc.);
• Induzione e selezione di mutageni;
• Sintesi di prodotti secondari;
• Criostockaggio del germoplasma.

Genetica mendeliana e molecolare

Selezione delle linee pure

Mendel selezionò delle linee pure per ciascun carattere; in pratica fece germinare i semi acquistati e, una volta che i fiori avevano raggiunto la maturità sessuale, lasciò che si autoimpollinassero. Questa operazione, svolta per varie generazioni, alla fine gli permise di selezionare solo quelle piante che mostravano stabilmente il carattere voluto. Gli organismi di questo tipo, in genetica, rappresentano le cosiddette linee parentali pure e vengono siglate con la P maiuscola.

Ibridazione F1

Successivamente incrociò tra di esse le piante che mostravano i due caratteri antagonisti, utilizzando come principio lo studio di un solo carattere alla volta. Prima che i fiori raggiungessero la maturità sessuale rimosse gli stami e le antere (strutture riproduttive maschili che producono il polline, cioè i gameti maschili), lasciando al suo posto lo stigma (struttura riproduttiva femminile).

Una volta che i fiori delle piante con il carattere antagonista erano maturi, vennero prese le antere e, con l'aiuto di un pennello, furono cosparsi di polline gli stigmi dei fiori appartenenti all'altra linea parentale. Ciò viene detta impollinazione incrociata e porta alla formazione degli ibridi. Sulle piante che risultavano da questa impollinazione, cioè la prima generazione filiale (F1), Mendel vide che si manifestava un solo carattere. Da questa prima parte della sperimentazione deriva il principio della dominanza: in un incrocio tra due linee pure, la progenie si manifesta sempre con un solo carattere, detto dominante.

Autoimpollinazione F1

Per capire che fine avesse fatto il carattere antagonista, Mendel fece autoimpollinare le piante della F1. Egli vide che le caratteristiche "scomparse" nella F1, riapparivano in minima parte nella F2, sempre nello stesso rapporto di 3:1 circa. Il carattere che compare al 25% nella seconda generazione filiale viene detto recessivo.

Mendel capì che la comparsa e la scomparsa dei caratteri era dovuta al fatto che essi venissero determinati da fattori discreti e che questi fattori si potessero separare. L'intuizione geniale fu quella di pensarli presenti in coppie e che queste coppie si separassero durante la formazione dei gameti.

Oggigiorno sappiamo che questi fattori discreti, cioè finiti, responsabili dell'espressione dei caratteri fenotipici sono i geni alleli, presenti in due varianti sui cromosomi omologhi. Queste varianti vengono dette alleli. L'allele dominante per un carattere viene indicato con una lettera maiuscola (lettera che richiama in qualche modo l'espressione di quel carattere: ad esempio R potrebbe indicare il colore rosso dei petali di un fiore); quello recessivo viene indicato con la stessa lettera, ma minuscola (ad esempio r, anche se presenta petali bianchi). Se i due alleli sono entrambi dominanti o entrambi recessivi, l'organismo è detto omozigote per quel determinato carattere; nel caso in cui ci sia concomitanza degli alleli, cioè uno dominante e l'altro recessivo, viene detto eterozigote.

Questo assetto genetico, presente quindi nel genoma di ogni organismo, viene detto genotipo. La maniera con cui gli alleli si manifestano viene definita fenotipo.

Leggi di Mendel

• Legge della dominanza (o legge dell'omogeneità di fenotipo): gli individui nati dall'incrocio tra due individui omozigoti che differiscono per una coppia allelica, avranno il fenotipo dato dall'allele dominante.
• Legge della segregazione (o legge della disgiunzione): ogni individuo possiede due fattori per ogni coppia di alleli, uno paterno e uno materno. Quando si formano i gameti, i fattori si dividono e ogni gamete possiede uno solo dei fattori.
• Legge dell'assortimento indipendente: gli alleli posizionati su cromosomi non omologhi si distribuiscono in modo casuale nei gameti.

Genetica molecolare

L'informazione genetica risiede nei cromosomi e quindi essenzialmente nel DNA. Poiché in ogni posizione in un filamento ci possono essere 4 diversi desossiribonucleotidi, ognuno di essi contiene 2 bit di informazione.

Prima ancora della divisione cellulare, l'informazione di un frammento di DNA viene ricopiata in un filamento di RNA con un processo di trascrizione (senza modifiche); l’RNA messaggero trasporta l'informazione ai ribosomi che producono le proteine.

Il ribosoma, nell'attuare la sintesi proteica, deve interpretare una sequenza di nucleotidi e produrre una sequenza precisa di amminoacidi. Nelle normali proteine vi sono circa 20 tipi di amminoacidi: ogni amminoacido per essere determinato richiede tra 4 e 5 bit di informazione (in quanto 2⁴=16 e 2⁵=32). Per rappresentare un amminoacido serve quindi una sequenza di 3 nucleotidi (tripletta).

Il codice genetico è la regola di corrispondenza tra le triplette di nucleotidi necessari ad un ribosoma per produrre un amminoacido e gli amminoacidi stessi. Tutte le sostanze organiche non semplicissime presenti in un organismo sono proteine o sono prodotte dalle proteine enzimatiche: i geni determinano quindi la composizione dell'individuo.

Regolazione genica

La regolazione genica è il processo che permette ad una cellula di esprimere un determinato gruppo di geni in un contesto e di silenziarne altri.

Per esempio, una cellula nervosa di coniglio ha lo stesso genoma di una cellula muscolare dello stesso coniglio, eppure le due cellule sono diverse, sia a livello funzionale che morfologico. Questo è dovuto al fatto che non tutti i geni sono sempre espressi: la cellula nervosa ne attiverà alcuni silenziandone altri, e lo stesso farà la cellula muscolare con altri geni. Questo porta a sottolineare che le cellule di uno stesso organismo che fanno parte di tessuti diversi presentano lo stesso genoma ma differente proteoma, cioè una differente serie di proteine prodotte a seguito dell'espressione selettiva di un gene o gruppo di geni.

Progettazione laboratorio di micropropagazione

Un laboratorio di micropropagazione richiede uno spazio dedicato alquanto limitato; nella maggior parte dei casi si deve operare un riadattamento di strutture preesistenti piuttosto che crearle ex novo. Per iniziare sarebbe preferibile una struttura sviluppata su un singolo piano con rapido accesso ai comparti, dato che un laboratorio di colture di tessuti richiede frequenti movimenti tra le diverse zone; inoltre un adeguato isolamento termico della struttura deve essere assicurato.

Il flusso dell’aria ed il controllo della temperatura dovrebbe differenziarsi da stanza a stanza e sarebbe auspicabile un regime di pressione positiva all’interno dell’intero stabilimento, o almeno nelle camere sterili (preparazione substrati, camera di crescita). L’aria deve essere filtrata tramite filtri in vetro o sistemi elettrostatici.

Con i lavaggi si produce una grande quantità di acque di scarico, per cui bisogna adottare un sistema di trattamento adeguato. Infine, un generatore autonomo di corrente è molto utile per evitare inconvenienti derivanti da black-out, soprattutto nelle camere di crescita dove la sospensione dell’attività del climatizzatore può portare la temperatura interna delle cellule a valori molto elevati con conseguenze nefaste per le colture.

Stanza per la preparazione dei substrati

• Il pavimento e le pareti devono essere a superficie liscia per evitare l’accumulo della polvere e per facilitare le pulizie.
• Le finestre dovrebbero essere sigillate.
• I piani di appoggio da laboratorio devono essere in materiale antiacido.
• È necessario avere sia acqua di acquedotto (deionizzata tramite il passaggio attraverso resine di scambio – usata per il risciacquo della vetreria) che acqua purificata (tramite un apparato di distillazione ad osmosi inversa) per la preparazione dei substrati e per il lavaggio della vetreria.
• È necessario un frigorifero per lo stockaggio di soluzioni e prodotti deperibili.
• Una bilancia tecnica (kg – g-100) ed una bilancia analitica (g-10000 – g-100000).
• pHmetro per misurare la concentrazione idrogenionica del substrato.
• Un’ampia dotazione di vetreria per miscelare (beute a tronco di cono, beaker cilindrici) e per misurare i volumi (cilindro graduato, matraccio, pipette graduate o tarate).
• Agitatori con piastra scaldante, magnetici e meccanici (per mantenere il substrato in agitazione durante la preparazione).

Stanza di lavaggio e sterilizzazione

Quest’area dovrebbe essere in comunicazione con la stanza di preparazione substrati dato che vi deve pervenire il materiale appena preparato per la sterilizzazione. La stanza dovrebbe essere allestita con materiali tolleranti l’umidità derivante dall’autoclave e da un eventuale lavavetreria; è inoltre necessaria la presenza di uno o più lavandini per il lavaggio dei contenitori più grossi.

La sterilizzazione (rimozione di ogni forma di vita, cellule, spore o virus) si può ottenere tramite filtrazione (membrane di acetato/nitrato di cellulosa assieme a sistemi di aspirazione o pressione) o tramite vapore ad alta temperatura (generalmente utilizzate le autoclave, grossi contenitori a pressione che consentono alle resistenze interne di portare l’acqua a 120°C permettendo una efficace sterilizzazione del materiale e dei substrati).

Area di trasferimento

In questa camera avviene la lavorazione ed il trasferimento su piastra di coltura del materiale vegetale, per cui l’igiene deve essere molto accurata: la stanza deve essere dotata di pressione positiva con aria ultrafiltrata, le pareti devono essere rifinite con vernici lucide e i pavimenti con linoleum per facilitare la pulizia. Può essere importante l’uso di lampade al vapore di mercurio per sterilizzare l’ambiente quando non viene utilizzato (l’ozono generato da queste lampade costituisce però un pericolo per la salute degli operatori e può danneggiare i materiali plastici).

La struttura più importante dell’area è la cappa a flusso laminare, un dispositivo costituito da un bancale su cui può lavorare uno o due operatori. Una pompa aspira l’aria da sotto il bancale o da sopra la cappa, prima passa per un prefiltro per rimuovere la polvere e poi un filtro HEPA che assicura l’allontanamento di agenti inquinanti trattenendo particelle piccolissime, infine la spinge verso l’apertura di lavorazione a ridosso dell’operatore (frontalmente o dall’alto). Questo sistema assicura un ambiente sterile sul bancale e l’operatore può effettuare i trasferimenti senza rischi di inquinamento.

Può essere utile un lavandino per lavarsi le mani e per gettare le soluzioni sterilizzanti. I vasi di coltura possono essere riposti in appositi carrelli multi-piano mobili.

Camera di crescita o cella climatica

Questa zona è dedicata alla crescita delle colture preparate nell’area di trasferimento (è preferibile disporre di più celle climatiche per avere differenti cicli di temperatura e di luce). In questi ambienti è necessario disporre di pressione positiva e trattamento/condizionamento dell’aria (assoluta assenza di finestre) trattandosi di zone strettamente controllate al fine di ottenere i parametri ottimali alla crescita delle plantule; inoltre sarebbe opportuno dotare l’area di un gruppo di continuità elettrica per evitare gli effetti nefasti di un blackout.

Vengono creati appositi sostegni con ripiani dove vengono riposti i vasi di coltura. Possono essere sia stabili che carrelli mobili, al di sopra dei quali vengono montate delle lampade al neon “growlux” a spettro solare controllate da un sistema a fotoperiodo (un dispositivo che consenta l’accensione e lo spegnimento delle luci in modo da riprodurre l’alternanza giorno/notte).

Strutture accessorie

• Serre per ospitare il materiale prima (piante madri) e dopo la coltura in vitro (acclimatamento);
• Zone per la rimozione dei substrati e la pulizia delle piante pronte;
• Zone di stockaggio per materiali e prodotti;
• Zona di imballaggio del prodotto;
• Uffici e zone amministrative dell’azienda.

Propagazione in vitro

Nel 1939 tre ricercatori riuscirono a coltivare indefinitamente tessuto calloso di carota e tabacco ed anche a rigenerare tale tessuto. Una delle ragioni del successo di queste colture fu l’uso di regolatori di crescita: la scoperta dell’acido indolacetico (IAA) (Went - 1926) procurò i mezzi necessari per l’induzione del callo da tessuti differenziati.

Venne poi scoperta una citochinina isolata da DNA idrolizzato che prese il nome di kinetina (Skoog e Miller - 1957) la quale poteva indurre il differenziamento in cauli dei calli di tabacco mostrando i sin