Biotecnologie delle specie arboree - Appunti

Un seme sintetico come è fatto? E' molto simile al seme delle gimnosperme dove l'embrione che ha un

endosperma che lo avvolge, è molto simile al seme sintetico che è fatto nell'accezione classica da un

emrione somatico all'interno di una capsula che è fatta di alginato di calcio perchè gli conferisce una certa

consistenza che può essere > o < e che è stato preparato aggiungendo anche un substrato nutritivo

contenente substrato minerale, sostanze ormonali, aminoacidi, vitamine in particolare sostanze ormonali a

seconda del tipo di sviluppo che si vuole che abbia l'espianto contenuto nel momento in cui questo seme

sintetico o artificiale, nel momento in cui queste capsule sono seminate per lo sviluppo; si definisce semina il

trasferimento del seme sintetico in un substrato in vitro o ex vitro che favorisca lo sviluppo dell'espianto quindi

nel momento in cui lo si mete nel substrato che fa si che si sviluppi l'espianto contenuto si parla di semina;

conversione: è la formazione di una plantula direttamente dall'organo incapsulato ad es. se contiene una

gemma o un embrione somatico; ricrescita tutte le volte che si dà luogo al recupero di un'attività

embriogenetica od organogenetica o proliferativa quindi comunque deve essere indotta ex novo. La finalità

per cui sono stati prodotti questi semi sintetici sono: unire vantaggi della micropropagazione con quelli della

propagazione gamica perchè se si pensa a un seme sintetico che contiene una gemma in pratica è un

sistema di micropropagazione, quindi riproduzione vegetativa che però essendo contenuto all'interno di un

seme unisce i vantaggi della propagazione gamica, cioè la semplicità di prendere il seme seminarlo e

ottenere la pianta; inoltre i semi sintetici sono materiale facilmente manipolabile che permette di essere

facilmente scambiato tra laboratori e poi per tecniche di crioconservazione quindi di conservazione del

germoplasma in azoto liquido.

Come si prepara un seme sintetico? Si parte con la preparazione dell'espianto da incapsulare quindi se si

tratta di embrioni somatici in coltura vengono prelevati questi embrioni somatci, se si tratta di gemme da

incapsulare vengono prelevate le gemme può essere utile fare un pretrattamento dell'espianto prima di

incapsularl, dopo di che si procede alla vera e propria incapsulazione che consiste nell'includere l'espiante

dapprima in una soluzione di alginato di sodio, un sale liquido, dopo di che mediante 2 metodi:

microgocciolamento o pipettazione queste goccioline liquide di alginato di sodio contenente l'espianto

vengono immerse in una soluzione a base di sale di calcio, si crea uno scambio tra il sodio e il calcio:

l'alginato di sodio è liquido e l'alginato di calcio è solido e quindi con quersto scambio la gocciolina che si era

formata e che era liquida si trasforma in una caspula solida e quindi si è creato il seme sintetico, dopo di che

queste capsule vengono separate e lavate e possono essere o utilizzate in conservazione oppure al

momento opportuno seminate per ottenere conversione o ricrescita. Vediamo queste 2 tecnologie: Il primo

metodo è il microgocciolamento: cosiste nell'avere un contenitore con un foro di uscita abbastanza piccolo

contenente l'alginato di sodio generalmente al 2%, insieme possono essere aggiunti il substrato che si vuole

es. ms, un quantitativo di sostanze ormonali a seconda delle finalità con cui si fanno i semi sintetici, il tutto

contenuto in un contenitore con un'uscita a becco che pemette che si formi la gocciola, man mano che si

formano queste gocciole prima di staccassi con la punta di un bisturi o con una palettina si prende un

embrione somatico e lo si inserisce per contatto all'interno della gocciola, si forma una goccia di alginato di

sodio contenente l'embrione somatico che va a cadere in un contenitore dove vi è un sale di calcio in genere

può essere nitrato di calcio o cloruro di calcio l'importante è che ci sia il calcio, dove queste gocciole restano

per un certo tempo dai 20 ai 30 minuti durante i quali si ha questo scambio del sodio con il calcio ed esce il

sodio dall'alginato e viene sostituito col calcio che determina l'indurimento della capsula, una volta che le

caspule si sono indurite vengono lavate con acqua sterile e possono essere ricoperti con polimeri per renderli

manipolibili e conservabili nel tempo.

L'altro metodo cosiste nel preparare gli espianti: embrioni somatici, gemme o segmenti nodali prima vengono

lavati in un substrato privo di calcio e passati in una soluzione di sodio alginato con una concentrazione

dall'1 al 5% più il substrato, > è la concentrazione del sodio alginato > sarà la durezza delle capsule che si

ottengono, quindi si vanno a prelevare le capsule con una pipettatrice a cui si è fatto un teglio nel becco in

cima per aumentarne il foro e si va ad aspirare un pò di questa soluzione di sodio alginato più substrato con

l'espianto all'interno del contenitore; si va a rilasciare in modo che l'espianto si vada a posizionare in fondo si

forma la goccia già contenente l'espianto che cade nella soluzione di substrato contenente cloruro di calcio

in concentrazione di 50-100 micromolare quindi poi il processo è lo stesso do prima. Il tempo di permanenza

è dai 15 ai 30 minuti, > è il tempo di permanenza più dure saranno le capsule, questo influisce poi sulla

futura semina e germinazione di questi semi sintetici perchè più sono duri puù si possono avere problemi di

germinazione; quello che influisce sulla durezza della capsule sono la concentrazione di alginato di sodio e il

tempo di permanenza nel substrato contenente il cloruro di calcio e poi si separaro in un contenitore con un

filtro le capsule. Oltre a sodio alginato sono state usate in qualche caso anche altre sostanze: callaginina, un

gelificante o addirittura il gel rise che a concentrazioni elevate forma capsule dure, però il sistema più diffuso

è la combinazione sodio alginato con sali di calcio. La durezza delle cellule è funzione della durezza

espressa in kg di resistenza per capsula, funzione del tempo in cui stannoin soluzione 100 kgmolari di

cloruro di calcio, si passa da 5 minuti a 0.12 kg per capsula fino ad arrivare a 0.78, 6 volte > se stanno per

30 minuti; un altro aspetto interessante è quanto grande vogliamo fare queste capsule, funzione anche di

quanto è grande l'espianto che si deve inserire, ci possono essere gemme o embrioni somatici molto grandi

e bisogna riuscire a fare una capsula idonea per contenerli e si vede che a seconda del taglio che si fa sulla

pipetta si possono ottenere capsule via via di dimensioni >, ma fino a un certo punto perchè arrivati auna

apertura di un taglio di 4.4 mm dove si ottiene una capsula di 5 mm di diametro, quando si va ad aumentare

non si riesce più ad aumentare la grandezza delle capsule, quando il foro diventa troppo grande non ci sono

più adeguate forze di coesione nella goccia che si forma e questo vuol dire che se gli espianti sono > a 4

mm diventa difficoltoso fare un seme sintetico idoneo.

Le principali applicazioni delle specie arboree che si sono avute in questo settore sono: embrioni somatici,

questa tecnica è stata sviluppata abbondantemete nel pino americano pinus teda e anche sell'abete rosso

sono 2 sistemi che danno ottimi sistemi di embriogenesi somatica, con formazione di molti embrioni e questa

tecnica dei semi sintetici è stata sviluppata per le applicazioni di propagazione quindi avere dei semi

contenenti questi embrioni somatici che possono poi essere scambiati tra laboratori, commercializzati,

seminati poi di nuovo in vitro per roittenere la piantina, oppure è stata sviluppata anche su latifoglie, vite,

olivo, ippocastano a fine di conservazione.

Non solo gli embrioni somatici possono essere utilizzati per formare embrioni somatica, anche cosiddette

strutture unipolari cioè delle gemme apicali o gemme ascellari proveniente da materiale in vitro isolate e

preparate, utilizzate per costituire un seme sintetico, in questo caso quello che si svilupperà sarà il

germoglietto che poi dovrè essere fatto radicare e le applicazioni su specie arboree actinidia, betulla, melo,

gelso, olivo quindi la seconda applicaziuone principale del seme sintetico dopo gli embrioni somatici sono

l'incapsulazione di gemme o segmenti nodali poi in realtà vi sono poi anche altre esperienze come

microbulbi, microtureti, rizomi, meristemoidi, aggregati cellulari, protocorpi... e tutte le forme di propagazione

naturale delle piante tipo rizomi, protocorpi sistemi di moltiplicazione delle bulose e quindi materiale utilizzato

per l'applicazione agli embrioni somatici. Due applicazioni sperimentali interessanti recenti: - un es. di

procedura messo a punto con segmenti nodali di melo, segmenti nodali sta a significare che da del materiale

coltivato in vitro, da dei germogli vengono preparati dei segmenti uninodali cioè tagliati il fusticino che

contenga una o due gemme, prima di fare il seme sintetico hanno fatto un trattamento di preinduzione delle

radici l'idea di questa procedura è: quando ho lo sviluppo del seme sintetico avrò un germoglietto dopo devo

fare la radicazione, ma se io gli faccio un trattamento rizogeno prima a questo materiale quindi si formano i

primordi delle radici (trattamento rizogeno con auxine), questo materiale avrà già degli abbozzi radicali quindi

vengono fatti poi con la procedura che abbiamo visto i semi sintetici che contengono il materiale, questi

segmenti nodali utilizzati da questi semi sintetici possono essere utilizzati in conservazione, quando si

andranno a seminare si formeranno i germoglietti e si svilupperanno le radici che erano state preindotte,

applicazione molto elegante e carina che permette di avere un seme sintetico che in pratica è come un vero

e proprio seme pur partendo da un segmento nodale, una gemma; - un'altra applicazione è su un porta

innesto di melo m26, qui addirittura l'espianto diventa un qualsiasi espianto cioè in questo caso hanno fatto

semi sintetici con porzioni di foglie addirittura facondo dei dischetti fogliari, delle striscioline di foglie sempre

di melo oppure macerando il materiale per fare il seme sintetico, qui lo scopo è avere un seme sintetico con

del materiale che poi verrà utilizzato per induzione di callo, classicamente l'agrobacterium è uno dei sistemi

che si applica sulle specie arboree, o lamine fogliare, uno può fare questo materiale, conservarlo sotto forma

di semi sintetici e utilizzarlo quando vuole seminando questi semi sintetici che contengono questo materiale

vegetale, in questo caso invece di avere la conversione del materiale cioè lo sviluppo del germoglio si ha

una ricrescita del materiale perchè non farà altro che produrre o ca