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Biotecnologie delle specie erbacee - Appunti

Appunti di Biotecnologie delle specie erbacee per l'esame del professor Pecchioni. Gli argomenti trattati sono i seguenti: RFLP, RADP: (sinonimo ap-pcr), Issr assomigliano al sistema rapid, l'abbondanza relativa di questo tipo di sequenze nel genoma dei vegetali.

Esame di Biotecnologie delle specie erbacee docente Prof. N. Pecchioni

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enzimi di restrizione che riconoscono questo tipo di siti; possiamo ricreare questo tipo di

siti trovandone almeno 3 basi creando un mis-mach in un primer però in mezzo altrimenti

crerebbe problemi alla pcr, prendendolo in mezzo è più facile che non ci siano problemi

alla reazione di amplificazione, adottiamo alcune condizioni di amplificazioni non troppo

stringenti e alla fine avremo una serie di frammenti la maggior parte dei quali conterrà la

base con il mis-mach che noi abbiamo aggiunto, e l'aggiunta di questa base consente la

creazione di un sito di restrizione nei 2 alleli (dove prima non c'era) poi uno dei due avrà

una o l'altra base alternativa perchè avrà l'snp nei 2 genotipi per cui l'enzima taglierà o non

taglierà cioè noi creiamo siti di restrizione modificando le prime 2 basi, nelle ultime 2 c'è il

polimorfismo usando questo tipo particolare tipo di enzimi di restrizione rari però ormai noti

si possono creare questi marcatori.

Un altro modo per vedere se c'è un allele o l'altro è ibridare il mio frammento di dna e

vedere se questo genotipo contiene l'allele e un genotipo contiene l'altro, un modo

potrebbe essere usare la nucleasi o un enzima di restrizione oppure usare questi primer

alleli specifici, un altro modo potrebbe essere fare una ibridazione però andando a usare

diverse tecniche di misura: una di queste tecniche è l'uso di ARRAY, altra tecnica

potrebbe essere l'uso di diversi tipi di florescenza o altri sistemi basate su sferette

codificate; possiamo usare diversi sistemi ad esempio una primer extentin cioè usiamo

una reazione di mini sequenziamento di cui andiamo ad allungare di poche basi un primer,

è un sistema di interrogatione comune, poi abbiniamo queste estensione di primer e

mettiamo diverse basi marcate con florescienti diversi nel mix di reazione, quindi se noi

abbiamo un allele o l'altro facciamo finire il primer poco prima dell'snp poi di lì inizierà la

reazione di sequenziamento poi a seconda della presenza di uno o dell'altro allele

allungheremo questo primer con l'uno a l'altra base marcata con coloranti fluorescenti

diversi, in questo modo avremo interrogato l'snp e abbiamo l'uno o l'altro colorante, questo

può essere accoppiato all'ibridazione cioè possiamo poi fare ibridare questo primer a

singolo filamento contro un arrey dove avremo la sua sequenza speculare in posizioni

diverse con gli alleli diversi e questo colorante verrà letto nella posizione in cui noi

sappiamo che c'è l'allele cioè a seconda della posizione nell'arrey alla quale questo primer

esteso è andato a ibridarsi noi sappiamo la presenza o meno di un allele o dell'altro, in

questo modo abbiamo accoppiato due modi di

interrogation sia la primer extention che l'ibridazione.

Quindi nella primet extention si tratta di aggiungere l'uno o l'altro dideossi nucleotide

marcato con un altro fluoresciente e leggerlo in vari modi, uno di questi modi di lettura

potrebbe essere un sequenziatore capillere perchè noi alla fine abbiamo un picco di uscita

colorato in una o l'altra maniera, di questo primer esteso che ci consente di leggere la

presenza di uno o dell'altro allele alternativamente e anche dell'eterozigote, non ci

consente di quantificare la frequenza di uno o dell'altro allele; non può essere corso su

normali gel perchè poi il prodotto di reazione è troppo corto.

C'è un altro sistema interessante che è simile, che è sempre una primer extention, viene

detta alternativamente anche minisequency parlando della metodica detta pairosiquensig

cioè in mais dove possiamo avere polimorfismi spaziati anche di poche decine di paia di

basi possiamo anche vedere polimorfismi a 2 snp consecutivi, la metodica del

pairosiqyuensig si basa su enzimi di proprietà con un enzima che si chiama sulfurilasi,

enzimi prodotti in vitro da una ditta svedese che produce anche la macchina e si basa su

una reazione di minisequenziamento a step di aggiunte di una base per volta, se dopo il

primer c'è una a avremo l'incorporazione di questo nucleotide e il rilascio di questo

pirofosfato che mi consente di produrre di energia sotto forma di atp e questo atp è poi

usato per fare avvenire la reazione luciferina, vengono usati 2 enzimi: uno la luciferasi e

l'altro la sulfurilasi nel mix di reazione per cui abbiamo la poduzione di luce, se la reazione

avviene il sistema è fatto in modo che venga rilasciato pirofosfato che viene trasformato in

atp da questo enzima sulfurilasi e poi usato per fare venire la reazione delle lucciole, cioè

ossidare la luciferina in ossiluciferina che è quella che fa emettere luce, produciamo

chemioluminescenza; se ci fossero 2 a consecutive avremmo un picco di altezza doppia

perchè significa che ne ha messe 2, vengono messe 2, alla fine il computer ricrea la

sequenza in base ai picchi di emissione, se invece doveva esserci una a e abbiamo

aggiunto una c non abbiamo nessuna emissione di luce perchè la reazione non è

avvenuta; la cosa è molto precisa e ha costi molto elevati, dall'intensità del picco è

possibile capire la frequenza di un allele nell'inademplato cioè è molto precisa la

misurazione della luca che viene fuori per cui se faccio un pool di 10 genotipi posso dire

un 30% dell'allele a e del 70% dell'allele b senza sbagliare anzi posso verificare la

presenza di un allele anche con più campioni; questo puà essere utile in certe analisi di

popolazioni o linee.

Un altro gruppo di interrogazione si basa sulla OLA che sostanzialmente si basa su una

ligasi, sull'idea di disegnare un primer a monte del polimorfismo e 2 primer alternativi a

valle a seconda dell'allele, la reazione di ligazione avverrà quando questi saranno

perfettamente complementari all'allele dell'snp, usiamo sempre come templato l'amplificato

di pcr quindi denaturiamo poi aggiungiamo queste probe da qui in avanti i metodi di

magiorment quali potrebbero essere? Coloranti fluorescienti; ibridazione, o altrimenti potrei

usare la FRET: se è avvenuta la reazione di ligazione potremmo meterli uno alla volta e se

è avvenuta la ligazione abbiamo un primer lungi il doppio.

Una variante della OLA è il sistema invader, invasore che si basa su un enzima di

proprietà che si chiama clivasi, che riconosce un sito triplex uno sbaglio nella replicazione

del dna per cui si viene a formare un triplo filamento e in corrispondenza di esso taglia il

dna in quel punto; utilizzando questa proprietà dell'enzima hanno inventato questo primer

invasore che crea questo stato temporaneo di trilpex, l'oligo invader finisce direttamente

sul polimorfismo snp e poi abbiamo uno o l'altro allele dell'snp, se l'allele nnon si appaia

sull'snp non abbiamo taglio, se è quello giusto abbiamo tentativo di appaiamento, la clivasi

riconosce che c'è qualcosa che non va e opera un taglio, nel sistema invader usiamo una

flap endonucleasi cioè abbiamo aggiunto a questi oligo che riconoscono i 2 alleli un altro

oligo non complementare che è il cosiddetto flap e a questo punto abbiamo interrogato e

riconosciuto l'allele; il prodotto di questo riconoscimento è questo oligo che viene chiamato

flat e a questo punto possiamo fare le solite cose es. un'ibridazione oppure avremmo

potuto usare una metodica tipo fret, nel sistema invader c'è una metodica di tipo fret che

però viene fatta riconoscere facendo agire nuovamente la clivasi, facendo ibridare di

nuovo il flap e poi facendo di nuovo creare il dna dalla clivasi.

La FRET (fluorensce resonance energy transfer) è una proprietà fotochimica, nel senso

che sono 2 coloranti fluorescenti che per un sistema di risonanza chimica non riescono a

emettere fluorescenza se le 2 molecole sono vicine, se le due molecole sono vicine si dice

che vanno in risonanza, quindi non emettono fluorescenza, l'unico modo di far funzionare

il colorante fret è quello di separarlo dal suo compagno, se lo seperiamo emette

fluorescienza; un colrante lo chiamiamo f e l'altro q come quencer cioè quello che ci

interessa è l'emissione di fluorescenza del colorante f, il quencer funziona solo da

stoppatore; quando sono vicini non emettono luce, questo sistema fret è usato anche nel

sistema invaderper il riconoscimento di questo flap, la fret è usata anche dal sistema

taqman cioè l'emissione di fluorescenza in risonanza.

Il sistema TAQMAN o 5' nucleasi, consiste in una particolare polimerasi che si chiama

taqman che ha un'attività esonucleasica in 5' , produciamo una probe taqman la facciamo

ibridare al nostro snp (ibrida solo se c'è l'allele giusto), se ibrida facciamo avvenire una

reazione di extention a partire da un primer che sta in 5' e la taqman come trova ibridato la

probe rompe questo doppio filamento tagliando la taqman, se in questa probe taqman noi

avevamo mosso i 2 coloranti l'f e il q rompendo questo oligo l'f e il q si separano e

abbiamo emissione di luce, è un sistema potente l'unico problema è il costo della probe

taqman potrebbe essere utile se dovessimo vedere pochi sno in una popolazione umana o

di piante molto estesa es per andare a vedere se c'è il gene in predisposizione di una

malattia.

Le ultime 2 classi di magiorment sono l'uso della spettrometria di massa e l'uso delle

sfere codificate; questi 2 sistemi vogliono superare una limitazione imposta dalle

chimiche dei normali sistemi di misura, per superare questo limite dobbiare arrivare a un

sistema in cui gli stati possibili di misura sono infiniti o comunque molto vicini a quel

numero e le possibilità che sono state sondate una è una combinazione di pigmenti

contenuti in sfere codificate, tale che ci consenta di leggere diverse lunghezze d'onda di

emissione luminosa combinando insieme diversi tipi di sferette per ottenere letture molto

precise con una gamma molto ampia dell'emissione di luce e questo sistema è stato

sondato dal sistema luminex, questi sistemi sono di solito abbinati a un citimetro di flusso

che serve per contare i cromosomi, un altra possibilità è quella del peso che hanno

diverse molecole cioè usare diversità di massa, e ne posso ipolizzare tantissime e

possiamo verificare quale è il peso in uscita di uno o dell'altro allele e in questo modo

possiamo leggere tantissimi alleli a tanti snp diversi in una volta sola, l'obiettivo finale è

quello di multiplexare cioè fare avvenire più reazioni nella stessa unità di tempo. In un

sistema che sichiama mas-array o il mas-tag si basano su questa possibilità di

combinazione di diversi pesi, il sistema mas-array senza aggiungere nessun colorante

fluorescente misura i diversi alleli a seconda che sia stata inserita l'una o l'altra base

nucleotidica cioè noi facciamo avvenire una primer extention, il primer è di 20 paia di basi

che hanno un peso differente tra un allele e l'altro a seconda che abbiano inserito all'ultima

base una a o una t senza più aver bisogno di un emissione di luce, questi sistemi che si

basano sulla luca hanno problemi di messa a punto in modo preciso, i sistemi di massa

funzionano in modo molto preciso anche se molto costosi però sono quelli che emettono il

maggior numero di polimorfismi snp detectati, interrogati al giorno.

APPLICAZIONI : una applicazione con l'uso dei marcatori è costruire una mappa

genetica, una mappa genetica serve a identificare quali sono i marcatori utili, cioè quali

sono i marcatori molecolari legati a loci, porzioni del genoma utili per la produzione

vegetale, possiamo andare a fare un fenotipo migliorato introducendo direttamente il gene,

se non sappiamo quale sia la base genetica di quel fenotipo dobbiamo andare ad

individuare nel genoma quale sia la posizione del locus responsabile del fenotipo un

marcatore vicino poi introducendo il gene al buio, lo scopo ultimo delle mappe genetiche è

andare a individuare un marcatore associati nel genoma e per sfruttare questa

associazione per introdurre questi geni utili e sfruttare questa associazione per introdurre

questi geni utili, in questo modo introduciamo qualcosa che esiste già in natura , è una

metodologia non invasiva sotto questo punto di vista ed essere meglio accetta

dall'opinione pubblica.

Per arrivare a identificare marcatori associati a geni utili fino ad oggi dovevamo passare

attraverso le mappe genetiche e anche oggi possiamo passare attraverso le creazione di

mappe genetiche anche se oggi esistono un paio di alternative, una più sfruttata; le mappe

genetiche sono una rappresentazione del genoma che si basa su distanze tra marcatori

ricostruite in base a frequenze di ricombinazione tra marcatori molecolari quindi per

definizione per produrre una mappa genetica dobbiamo creare una ricombinazione e poi

dobbiamo andarli a seguire questi eventi con i marcatori molecolari basandoci sulle noti

leggi di Mendel, sapendo che alla base di questo stanno la legge della segregazione

indipendente dei caratteri cioè se 2 marcatori stanno su 2 cromosomi diversi ritroverò una

popolazione segregante, cioè dopo che ho creato l'evento di ricombinazione troverò in una

popolazione segregante con uguale frequenza i tipi parentali come i tipi ricombinanti

perchè questi 2 marcatori molecolari essendo su 2 cromosomi diversi si assortiscono in

modo indipedente, essendo casuali i rapporti di frequenza sono uguali. Dobbiamo quindi

produrre l'evento di ricambinazione e dobbiamo disporre di una popolazione segregante,

dobbiamo avere sperimentalmente gli individui o i tessuti quindi dobbiamo disporre di

questi dna genomici che provengono da questi individui. Se invece questi 2 marcatori

sono associati avremo più frequenti gli alleli parentali che non gli alleli ricombinati, cioè i 2

alleli paterni o materni piuttosto che un assortimento; perchè un individuo possa essere

segregante abbia dal parentale materno A e dal parentale paterno b deve esserci stato un

crossing over in mezzo e la rarità di questo crossing over è tanto maggiore quanto più i 2

marcatori sono vicini. Mappe genetiche si possono alternativamente chiamare mappe da

linkage, mappe di associazione; per andare a vedere se c'è associazione facciamo una

semplice conta cioè andiamo a contare quanti sono i ricombinanti tra i 2 marcatori cioè

andiamo a verificare quale è la segregazione degli alleli dei 2 marcatori della popolazione

segregante e andiamo a contare quanti segreganti esistono tra questi 2 marcatori e quindi

possiamo fare normali test statistici come il chi quadro per devere se siamo in una

condizione di associazione o segregazione indipendente; se ce ne saranno tanti di

ricombinanti possiamo testare lìesistenza di un assortimento indipendente, se invece di

ricombinanti ce ne saranno pochi saremo nel caso dei marcatori associati. Poi andremo a

fare dei test a tre punti, la frequenza di ricombinazione entro certi limiti è additiva, cioè se

un marcatore è distante 5.000.000 di paia di basi avrà 5 ricombinanti, se è distante

10.000.000 di paia di basi avrà 10 ricombinanti in quella popolazione questo perchè la

frequenza di crossing over è proporzionale alla lunghezza, a questo punto possiamo

ordinare le distanze dalla più piccola alla più grande mettendo in fila questi marcatori, il

test a tre punti ci consente di verificare lìipotesi dellìordine di questi marcatori, in che

modo? Verificando, introducendo un terzo marcatore e contando quanti siano i

ricombinanti tra le diverse coppie es. a e b sono associati, poi noi facciamo un test tra

un'altra coppia: b e c e anche questi sono associati, però quale sarà l'ordine, sarà abc, bac

o cab o cba? L'ordine lo possiamo stabilire ancora una volta contando i ricombinanti

sottoponendoli a test statistici di accettabilità del dato cioè noi contiamo i ricombinanti tra a

e b: sono 5 su 100 genotipi, tra a e c sono 3, questo significa che c è più vicino ad a di b

cioè a e c sono più strettamente associati che non a e b; poi andiamo a testare i

ricombinanti tra c e b sono 8, quindi b è più lontano da c che non da a, quindi il modello

fitta con l'ordine cab non starebbe assieme con qualsiasi altro ordine. L'unico problema è

quando ci troviamo un marcatore non sufficientemente spaziato e ci troviamo di fronte a

buchi in questo caso possiamo ricostruire i buchi solo quando abbiamo messo dei

marcatori ricombinanti in mezzo altrimenti non riusciamo a ricostruire il cromosoma però di

fatto andando avanti a triplette ricostruiamo la sequenza dei marcatori posti sull'intero

cromosoma. Abbiamo unità di mappa cioè unità di misure delle distanza tra marcatori che

sono le percentuali di ricombinazione che vengono tradotte in centimorgan, considerando

che 1% di ricombinazione significa un centimorgan unità di misura introdotta da Margan.

Identificazione del carattere utile: una volta fatta la mappa da linkege per identificare

dove è il gene responsabile di un fenotipo es. il fenotipo del colore possiamo trattare

questo gene come un semplice marcatore, cioè dentro a una popolazione segregante

trattiamo il dato in base ai genotipi parentali di partenza come normali marcatori dandogli

una classificazione (vedi esempio lucidi) e in questo modo sono stati identificati tantissimi

caratteri utili e quindi introgredibili. Se il fenotipo è controllato da più geni la cosa si

complica molto, ci sono segregazioni attese se abbiamo una popolazione segregante che

ha una F2 se è codominante ci aspettiamo una segregazione del tipo 1-2-1 cioè 25%

come il parentale A, 50% eterozigoti e 25% come il parentale; se invece fosse dominante il

carattere avremo 75% come il parentale A e 25% come il parentale B e questi sono i casi

più semplici.

Dalla genetica classica molti mutanti o geni notoi sono conosciuti per essere posizionati

sul cromosoma di una specie se bnoi sappiamo che hvm33 è un mutante o un bene noto

per essere sul cromosoma 3 e che hvm62 fosse un altro gene noto per essere sul

cromosoma 3 delle triticee allora sapremo che questo pezzetto del 3 è quello del

cromosoma 3, sono i cosiddetti marcatori ancora o loci ancora e questa mappa ci

consentono di ancorarla a cromosomi noti cioè sappiamo che l'orzo ha 7 cromosomi,

uomo 46 cromosomi etc., più è nota la genetica meglio è e più siamo in organismi diploidi

meglio è, se dovessimo creare in oganismi poliploidi è tutto più complicato sia dalla

ridondanza dei loci perchè sono presenti magari in più copie sia dal numero di marcatori

necessari per creare una mappa completa di 64 cromosomi o comunque un numero molto

elevato come in cipolla o giglio; lievito 1 cromosoma è l'eucariote più piccolo, più siamo in

numeri ridotti più è facile creare un quadro del suo genoma anche dal punto di vista della

ricombinazione. Nelle piante esistono diverse popolazioni sperimentali cioè segreganti

usate alcune per es. hanno delle sigle es. F2 che è l'autofecondazione della generazione

F1, la cosa più semplice da fare nelle piante, il problema consiste nal fatto che nel

genotipo F2 è effimero, cioè è ricombinato, abbiamo mescolalato i 2 genomi, nell'F1 era

tutto eterozigote e autofecondandosi ha prodotto tanti individui F2 tutti ricombinanti ma

sono presenti solo per la durata della loro vita, o riusciamo a congelare ed estrarre tanto

dna genomico da fare tutte le nostre analisi di tutti i nostri marcatori oppure se non

riusciamo questa generazione ci sfugge abbiamo solo una fotografia istantanea, se

vogliamo fare una misura di caratteri è molto difficile farlo perchè non abbiamo più la

materia prima. Glescamotage sono diversi: una è quella di diploidizzare il polline F1 o F2

per ottenere i doppi alpoidi cioè individui ricombinanti totalmente omozigoti cioè andiamo a

prelevare delle microspore pes es. le diploidizziamo con colchicina, facciamo coltura di

callo aploide e otteniamo le piante che rigenerano.; se ne rigeneriamo tante piantine

abbiamo tanti ricominanti che derivano tutti dall'incrocio iniziale.

Se una pianta non si riesce ad autofecondare è inutile fare doppi aploidi nel senso che se

ha bisogno del polline di un'altra pianta per riprodursi anche in questo caso avremo delle

fotografie istantanee; le riles sono la stessa cosa cioè senza passare per coltura di tessuti,

le colture in vitro noi le facciamo autofecondare le F2 tante volte fino a 8 generazioni e

dopo tante generazioni il livello di omozigosi è pressochè completo perchè gli alleli in

gioco si restringono, una volta che dei 2 alleli ne abbiamo perso uno questo è perso per

sempre, le riles sono un modo povero per fare dei doppi aploidi cioè seminando e

raccogliendo il seme su quelle piante tenendole in isolamento in modo che non arrivi

polline dall'esterno. I backross cioè il reincrocio qui la condizione è diversa nel senso che

abbiamo un F1 prodotta dall'incrocio dei 2 parentali tutto eterozigote, se noi questa F1 la

reincrociamo con uno dei 2 parentali avremmo che tutti i loci segregheranno con rapporti

di 1 a 1 cioè 50% rimarranno eterozigoti e 50% omozigoti perchè il polline di quell'F1 avrà

o l'allele parentale o l'altro; se ha l'allele di quello che andiamo a incrociare questo locus

sarà omozigote se invece ha l'allele dell'altro parentale resterà eterozigote; facendo AXB

avremo F1, facendo ancora AXB avremo 2 classi di polline 50% avrà l'allele A e 50% avrà

l'allele B e quelli che hanno l'allele B andranno a fecondare una pianta AB per cui avremo

un omozigote B, quelli che hanno l'allele A andranno a fecondare una pianta AB e

otterremo un individuo eterozigote per quel marcatore, per cui la segregazione attesa nel

backross è del 50 e 50 di 1 a 1.

Nelle piante arboree gli schemi sono diversi, abbbiamo i cosiddetti schemi tipo testcross;

se abbiamo 2 eterozigoti in partenza come possono essere 2 piante arboree, creano l'F1,

ci dobbiamo aspettare segregazione dei diversi alleli in rapporti sempre di 1 a 1, ogni allele

è presente al 50%; questo anche se è una pianta erbacea autoincompatibile, se noi

volessimo potremmo fare un reincrocio, ma non con uno omozigote, lo facciamo di nuovo

con un eterozigote per cui avremo sia situazioni di 1 a 1 che situazioni di 3 a 1, 3 a 1

quando l'allele è presente in entrambi i parentali; il caso delle piante arboree

autoincompatibili è quello più difficile, il caso più facile è quello delle piante

autocompatibili.

C'è la possibilità di baipassare le mappe di linkage per identificare i geni utili? Si, lo

vedremo.

Abbiamo perlato delle mappe di linkege: ci consentano di andare ad associare uno o due

marcatori molecolari con i loro rispettivi alleli ad un locus cioè ad un posto del genoma

responsabile di un carattere utile sia che abbia una genetica qualitativa che quantitativa,

l'importante è identificare un fenotipo di cui non abbiamo niente oltre a quello ci forniscono

formazioni importanti sulla dimensione del genoma in termini genetici di centimorgan

anche perchè l'unità di misura è quella. Per finire le mappe di linkage dobbiamo ripartire

dal loro fattore limitante che è passare attraverso una ricombinazione in una popolazione

segregante cioè noi ogni volta che vogliamo stidiare un carattere dobbiamo costruirci una

popolazione segregante ad hoc, e questo è un limite oltre al fatto che l'altro limite è questo

che per identificare quali sono i marcatori associati a quel gene abbiamo una serie di

informazioni ridondanti come avevamo nelle discovery degli snp, per l'informazione

ridondante una prima scorciatoia è quella della market segregant antanalisis che è

l'utilizzo di marcatori casuali senza avere nota la posizione sul genoma per identificare i

marcatori associati a un locus utili: creiamo comunque ricombinazione cioè passiamo

attraverso una popolazione segregante quindi abbiamo una serie di genotipi che sono

ricombinati e che noi andiamo a testare per presenza o assenza del carattere cioè

andiamo comunque a fare il test del genotipo come nell'analisi di linkage, questo è servito

molto per studio delle resistenze, noi costituiamo i cosiddetti 2 balk cioè facciamo

estrazione di dna genomico e uniamo in misura equimolare questi dna genomici perchè se

noi in questo balk uno abbiamo messo tutti i genotipi resistenti a una malattia significa che

saranno ricombinati in tutte le altre parti del genoma, meno che al locus dove abbiamo il

bene di resistenza; e lo stesso dobbiamo pensare per il balk 2 cioè se sono tutti suscettibili

saranno ricombinati ovunque meno che li, quindi se noi individuassimo qualsiasi

marcatore in linkage con questo gene nel balk 2 andremo ad amplificare con l'allele del

parentale suscettibile; abbiamo 2 parentali: resistente e suscettibile, proviamo diversi

marker e il 99% avranno tutti e 2 gli alleli dei parentali, in quei rari marcatori casuali essere

associati al gene resistenza abbiamo una presenza di un allele del parentale resistente nel

patterner dei resistenti e l'allele del parentale suscettibile nel patterner suscettibile,

mettiamo sempre come testimoni i 2 parentali che hanno 2 caratteri fenotipici diversi,

quindi in questo modo identifichiamo marcatori semplicimente con 4 amplificazioni ogni

marcatore e quindi ci risparmiamo molto lavoro, lo svantaggio è che siamo andati alla

cieca dal punto di vista della posizione, non lo possiamo sapere perchè non abbiamo fatto

l'analisi di linkage, sappiamo solo che abbiamo trovato tre marcatori associati al carattere

cioè al locus di resistenza; nel caso poi che la specie avesse una genetica nota, mappe

genetiche a disposizione possiamo inserire questi marcatori ottenuti con l'adsa in un'altra

popolazione segregante per vedere in quale regione del genoma siamo.

L'altro limite è più difficile da superare, è quello della costruzione di gruppi di ricombinanti,

popolazioni segreganti ad hoc; poter fare un mappaggio di associazione cioè trovare

marcatori associati a geni utili senza dover passare a popolazioni di segreganti può essere

utilissimo se ci troviamo a dover lavorare con pazienti ospedalieri, persono non

imparentate e noi vogliamo capire quale è il marcatore associato a quella malattia

genetica, nelle piante è un vantaggio più limitato nel senso che per molte specie è più

facile in pochi anni raggiungere la preparazione di una mappa genetiche, però a volte

anche nelle piante abbiamo una serie interminabile di dati raccolti in un gruppo di

germoplasmi, in questo modo sarebbe molto utile poter associare marcatori a loci di

caratteri utili senza dover passare dalla ricombinazione, come si fa questo? In 2 modi, uno

con il radiation hibrid mapping e uno con l'association mapping che si basa sul linkage

disequilibrium; anche se radiation hibrid mapping è stato proposto anche per le piante con

il nome di happy mapping in realtà nelle piante non è che funzioni così bene, la strada più

seguita è stata l'altra. Radiation hibrid mapping si fa così: si fanno colture cellulari in cui

noi provochiamo delle rotture nei cromosomi, con delle radiazioni provocando perdite di

pezzi di cromosomi, per far sopravvivere queste cellule come si fa? Sono preticamente

ibridomi, sono genomi alpoidi dentro a cellule che hanno metà patrimonio genetico di uno

e mezzo dell'altro es. uomo-topo in modo che noi possiamp poi riconoscere i 2 genomi;

poi andiamo a vedere se i 2 marcatori sono associati e poi facciamo dei saggi con dei

marcatori molecolari; se i 2 marcatori sono associati saranno sempre assenti nella coltura

dove è stato spezzato il cromosoma es. 1 braccio lungo e sempre presenti in tutti gli altri

pannel, in basa quindi alla copresenza e alla coassenza noi andiamo a determinare

l'associazione creando rotture e in base a test statistici verifichiamo copresenza e

coassenza e quindi la maggior e minore associazione, il vantaggio è che invece di avere

piante in campo abbiamo colture cellulari o piastre da 96, questo nei vegetali è meno

usato perchè comunque non abbiamo le grosse limitazioni come abbiamo nell'uomo per

produrre ricombinazione.

Mappaggio di caratteri quantitativi o qtl: possiamo andare a mappare dei geni o qtl

dentro a un genoma, per identificare i marcatori associati e per introdurre questi beni

attraverso i marcatori oppure per andare a identificare quali sono i geni responsabili del

fenotipo qualitativo e quantitativo; il fenotipo non ha una base genetica nota dobbiamo

prima andare a identificare quali e quanti geni sono, dove sono nel genoma, quali sono i

marcatori associati e così via...

Qtl significa quantitative trade locus, in una popolazione segregante si distribuiscono

normalmente, non in classi discrete come il fiore bianco e rosso, ma è per es. un peso dei

frutti: genotipo frutto piccolo e genotipo frutto grande se facciamo una popolazione

segregante abbiamo una distribuzione continua sempre anche se può essere più o meno

spostata verso uno dei 2 parentali, inoltre è influenzata dall'ambiente non solo da un fatto

genetico per cui più geni concorrono in modo additivo al carattere, il carattere è

mascherato dall'ambiente, in più non conosco quanti geni contribuiscono al carattere;

questa è una situazione abbastanza complessa dal punto di vista genetico, prima

dell'arrivo dei marcatori molecolari questo tipo di caratteri non poteva essere affrontato da

un punto di vista molecolare, ma con la selezione oppure cercando di capire applicando

dei modelli quanti fossero i geni coinvolti nel carattere, l'avvento di mappe linkage ha

consentito di scomporre questa segregazione continua nei suoi determinanti genetici, cioè

qtl è uno dei loci che contribuiscono al carattere quantitativo, che li controllano. Analisi qtl

consente di determinare quanti loci contribuiscono a quel carattere, non solo mi consente

l'uso di marcatori molecolari andare a capire quali sono i loci che hanno un effetto

maggiore rispetto ai loci che hanno un effetto minore, cioè scomporre la varianza nei pesi

dei vari loci.

Fare analisi di qtl è come andare a fare un'analisi di associazione di marcatore gene

qualitativo, in quel caso trattavamo il carattere qualitativo come possedere una o l'altra

fase allelica, in questo caso non lo possiamo fare quindi partiamo dai marcatori cioè

scomponiamo la popolazione segregante per ciascun marcatore nelle 2 o 3 classi

alleliche, facciamo il caso della situazione ottimale, marcatore codominante: per ciascun

marcatore avremo una segregazione quindi avremo i genotipi eterozigoti, che portano gli

alleli dell'uno e dell'altro parentale, ci sono programmi al calcolatore che raggruppano i dati

del carattere quantitativo, cioè i dati fenotipici per classi di genotipi che possiedono l'uno o

l'altro allele a quel marcatore e si fa questo conteggio per ogni locus di ogni marcatore,

quindi dobbiamo avere una mappa completa a intervelli di 5 cernimorgan che non mi

consentono di perdere informazioni a cause dei doppi ricombinanti.

Per un locus additivo ci dobbiamo aspettare che la classe eterozigote abbia un

comportamento intermedio, a questo punto abbiamo trovato un marcatore che è associato

al carattere, cioè abbiamo trovato un marcatore capace di scomporre la popolazione nei 3

gruppi che sono statisticamenti diversi per fenotipi, riassunto: io prima faccio una analisi

dei marcatori in una popolazione segregante e misuro il fenotipo, poi il softwer mi assegna

un valore di significatività, il programma in base alla distanza in centimorgan l'ipotetica

posizione del locus, siccome è un'analisi statistica mi darà anche un intervallo

confidenziale; vogliamo identificare l'intervallo con più probabilità con 2 marcatori insieme.

Con un intervallo piccolo di 5 centimorgan evitiamo i falsi negativi dopo ricombinazione, è

difficile che abbiamo doppi ricombinanti mentre se invece facciamo uno per uno l'abbiamo

solo una possibilità di ricombinazione e quindi gli effetti dei qtl vengono sottostimati.

I qtl sono solo una entità statistica nel genoma, la sua posizione può essere anche più

labile nel sense che essendo legati all'ambiente il qtl che ha una posizione certa deriva da

analisi fenotipiche fatte in più anni, in più ambienti e che è sempre in quell'intervallo

genomico, di fatto significa che i qtl più sicuri sono quelli che hanno un peso maggiore sul

carattere perchè quelli che hanno un peso minore sono più difficili da andare a identificare

e questo è un limite.

Perchè produrre questi marcatori? Per una serie di applicazioni, una di queste l'analisi qtl,

una via per ottnere un fenotipo desiderato, una delle vie infatti se il nostro obbiettivo è

questo è la via non ogm in cui abbiamo un fenotipo a base genetica sconosciuta e noi

introduciamo un carattere semplicamente attraverso il marcatore se c'è, si parlava di qtl

segregazione di caratteri quantitativi e di come con i marcatori si possono associare dei

marcatori molecolari a un locus in cui ci sia il gene o più geni responsabili di caratteri

quantitativi. Un carattere quantitativo dovrebbe sempre essere misurato in più ambienti e

località, è un carattere misurato con pesi, indici il problema è che un numero io lo posso

rilevare in una maniera in ambiente, mantre in un altro ambiente posso avere un effetto

vivers o e quindi questo numero può essere minore o maggiore, dobbiamo liberarci dalla

varianza ambientale ripetendo le misure in più ambienti e in più anni verificando quei pochi

geni che funzionano sempre in tutti gli ambienti.

Il fatto che io abbia identificato un locus a bese genetica ignota per un carattere qualitativo

o per un carattere qnt mi pone un problema di tipo pratico: con questo bene lo introduco

senza vederlo cioè attraverso i marcatori e in questo caso faccio della selezione assistata

(marker assisted selectin) oppure vado a tentare di clonarlo sena avere nozioni preventive

su di lui semplicemente per la sua posizione nel genoma e lo faccio passando da una

mappa genetica basata sulla ricombinazione a una mappa fisica in cui andiamo ad

ancorare i marcatori molecolari a dei grossi frammenti di dna, grandi inserti, all'interno dei

quali ci saranno tante sequenze, ma ci sarà anche il mio gene; cioè passando dalla mappa

genetica alla mappa fisica io posso clonare per posizione, il clonaggio per posizione non fa

parte del programma è stato tolto, il clonaggio per posizione è molto appetibile per il

clonaggio dei qtl, se un qtl ha un effetto grande sul carattere, posso pensare di clonarlo.

Per fare un clonaggio di posizione vado a fare un clonaggio diretto attraverso il mappaggio

fine, è un mappaggio genetico con marcatori fatto su popolazioni ampie, fine perchè vado

a raffinare la posizione del mio gene di interesse che mi dà il mio fenotipo del mio locus

d'interesse perchè uso tanti ricombinanti però sempre è un mappaggio genetico; posso poi

passare al mappaggio fisico per clonaggio diretto ed è possiblile perchè esistono librerie di

inserti larghi fino a 150 kgbasi che si chiamano librebie bac, verrori particolari mantenuti in

coli però sono praticamente un intero cromosoma batterico addizionale che vengono

mantenuti in questo particolare ceppo di coli, per il clonaggio diretto dobbiamo inentificare

quegli inserti larghi che portano il nosrto marcatore molecolare ottenuto dal mappaggio

fine, nella migliore delle hp abbiamo 150 kgbasi da sequenziare e sono ancora fattibili, poi

potrei da tutti questi geni scegliere quelli più probabili e rimapparli e vedere se

cosegreghegano; però potrei anche baipassare questo sistema utilizzando lo stesso il

mappaggio fine con un gene candidato cioè se io suppongo che il mio carattere sia

basato su un certo metabolismo posso scegliere il mio candidato, candidato ad essere lui

il responsabile del fenotipo, cioè sospetto che sia quel gene lì, allora produco dei marcatori

li inserisco nella mappa fine e a questo punto se il gene candidato va a mappare col

fenotipo su 2000 piante, quindi se io su 2000 piante non ho un ricombinante tra gene

candidato e fenotipo significa che ho un candidato molto molto buono, l'approccio gene

candidato mi può fare risparmiare la produzione della libreria bac, il mantenimento di tutti i

cloni della libreria bac, il controllo di mx e my su tutti questi cloni, il sequenziamento di

150kgbasi, andare a pescare quali sono i geni, andare a vedere se i beni... ho risparmiato

un anno abbondante di lavoro a sono arrivato all'obbiettivo molto più rapidamente;

naturalmente la prova che questo sia il mio gene non è definitiva, io ho una

cosegregazione di un candidato con un fenotipo su 2000 piante, è un indizio molto

pesante la prova definitiva quale è, che il mio gene candidato sia il gene del locus che

causa il fenotipo? Con un test di complementazione tra genomi cioè si prende il candidato,

si fa un transgenico per il candidato e quindi in un genotipo che è meno per quel carattere,

se quello è un gene resistente il primo è suscettibile lo trasformo col candidato; ci metto

sopra il patogeno e se il mio suscettibile mi diventa resistente cioè cambia il fenotipo ho

candidato che cosegrega su 2000 piante, ho fatto l'ogm che è resistente è la prova

definitiva che il mio candidato è lui o di un suscettibile o di un mutante cioè io mi sono

prodotto un mutante meno, per sapere che una mutazione è quell'enzima io prendo un

mutante meno lo incrocio col più e se ottengo nella progenie dei più vuol dire che era

quello l'enzima deputato (nei lieviti). Qua il test di comlementazione è facendo il

transgenico: transgenico del mutante meno o del genotipo suscettibile mi riottengo un

genotipo più cioè carattere utile. Altra prova anche se sempre un pò indiretta è che in

queste librerie mutanti in cui io posso riconoscere la sequenza mutata perchè ho un pezzo

di tdna e un pezzo sdel gene mutato, cioè un pezzo di tdna che si è andato a inserire nel

mio gene mutato quindi non fa più mrna, la mutazione è nata da quello, non fa più

proteina, io però posso andare a prendere una sequenza ai lati, in questa libreria di

mutanti che a ogni mutante corrisponde una sequenza di inserzione, quindi faccio una

ricerca di omologia in banca dati, in queste sequenza e questi mutanti trovo omologia

significa che in quel mutante che è meno io ho interrotto questo gene candidato quindi

cosegrega ed è anche stato prodotto il mutante meno, naturalmente questo non è un ogm

è solo un mutante quindi non è una prova definitiva, anche se è una prova molto forte. Il

clonaggio per posizione mi consente di andare a produrre degli ogm; l'approccio del gene

candidato può affiancare o sostituire almeno in fase finale l'approccio di clonaggio per

posizione per assegnare una sequenza a un fenotipo, siamo molto facilotat oggi nella

ricerca di geni candidati perchè esiste per esempio una sequenza completa del genoma di

riso, di arabidopsie e molti di questi geni iniziano ad essere annotati, cioè gli viene

assegnata una putativa funzione o per verifica diretta o indiretta per omologia con geni di

topo, mammifero etc., da quelle sequenze che hanno una funzione annotata posso

trovarmi un omologo alla mia sequenza, usando un approccio di candidato funzionale.

Oppure posso usare dei candidati funzionali, cioè posso fare delle cosiddette mappe

funzionali, cioè posso prendere in un num di sequenze espresse in un data base, da

quelle sapere che sono espresse, sviluppo dei marcatori e uso solo quelle per produrre

una mappa funzionale; una mappa funzionalre è una mappa di sequenze che hanno una

funzione, essendo una mappa genetica fatta con metodi classici di pcr o altri sistemi di

marcatori, abbiamo tutti i segreganti mesi in ordine sui 7-10 cromosomi ognuno di questi

loci corrisponde a un gene quindi è una mappa funzionale, poi faccio un'analisi es. fiore

rosso, fiore bianco e carattere fiore rosso, fiore bianco mi va a cosegregare su un gene su

un cromosoma in posizione x, e ho trovato il mio cosiddetto candidato posizonale, l'ho

fatto al buio creando la ricombinazione tra tutti questi geni tra i responsabili di tutti i

metabolismi della pianta scegliendoli a caso e poi ho trovato che quel carattere cosegrega

con una certa sequenza espressa e allora posso fare e il mappaggio fine e poi tutte le altre

cose che ho fatto prima, transgenesi e così via. (Test di complementazione vuol dire test di

complementazione del fenotipo cioè io con la mia sequenza aggiungo quel carattere,

complemento).

riass: faccio una mappa funzionale perchè dò una posizione a tutte queste sequenze

espresse, data laposizione posso vedere come segrega il carattere, quindi dò la posizione

anche al carattere, al gene ignoto responsabile del carattere.

Iniziamo ad avere degli orf utilizzabili per fare degli ogm, il gene p1 in mais regola una

delle vie di sintesi della maisina, un composto pilofenilico che ostacola la crescita di certe

larve all'interno del mais e consente una tolleranza a una farfatta parassita del mais per un

carattere quantitativo, alla fine si è scoperto che avere o non avere in p1 di uno dei due

parentali significava avere maggiore tolleranza alla farfalla ed è stato il primo es. nelle

piante che ha avuto succasso nel dimostrare il suo coinvolgimento nel carattere, quindi se

facciamo un ogm per p1 abbiamo una pianta che resiste a questa farfalla, poi ce ne sono

altri sia posizionali che funzionali per es, una chetoacilsintasi è responsabile in colza del

tenore di acido elucico; geni in frumento che codificano per proteine pr indotte dal

patobeno, che sono proteine di difesa della pianta.

Una delle applicazioni dei macatori molecolaro oltra alle costruzione delle mappe di

linkage sono gli studi di linkage disequilibrium o studi di mappaggio di associazione

(association mapping) tramite il linkage disequilibrium, disequilibriano la stima, è un

parametro che ci conente di fare non mappaggio per linkage ma mappaggio per

associazione. Bisogna tornare un pò indietro, quando abbiamo parlato di mappe

genetiche: per verificare che 2 marcatori sono associati lo verichiamo perchè ritroviamo i

tipi parentali nei ricombinanti più frequenti dei tipi ricombinati perchè l'unica possibilità che

abbiamo di trovare i tipi ricombinati è il fatto di avere un crossing over in mezzo.

Dobbiamo dare un nome a questa associazione e la chiamiamo aplotipo cioè chiamiano

aplotipo o tipo aploide questa associazione allelica di due geni o di due loci associati. Si

chiama aplotipo in cis quando rispetto a un parentale gli aplotipi hanno gli alleli nello

stesso senso, nelle stessa direzione; aplotipo in trans rispetto sempre al parentale gli

aplotipi hanno orientamenti opposti, alleli in direzione opposta cioè abbiamo creato

ricombinazione; per es. un marcatore lo possiamo avere sia in cis che in trans nel senso

che ho allele positivo del marcatore significa anche per il carattere; per fare mappe

genetiche bisognava passare attraverso la segregazione ed era estremamente noioso e

lungo, per evitare questo ho 2 possibilità: radiation hibrid (che non facciamo) e lo studio

del linkage disequilibrium che ci consente di studiare popolazioni naturali o anche artificiali

però senza bisogno di produrre ricombinazione in alcun modo artificiale perchè possiamo

studiare popolazioni presenti in natura, possiamo fare questo perchè possiamo andare a

calcolarci all'interno di quella popolazione quale sia il disequilibrio dovuto all'associazione,

cioè dovuto al linkage tra 2 loci cioè è possibile calcolare tra due loci quale sia il grado di

associazione perchè il grado di disequilibrio decleterà il grado di associazione. es. ho i due

loci A e B e ognuno dei quali siamo in un diploide, ha dua alleli e quindi i gameti in questa

popolazione naturale, le combinazioni possibili sono: AB, Ab, aB, ab quindi abbiamo le

frequenze di genotipi che saranno riportabili in queste classi perchè hanno un gamete da

ognuno perchè per 2 loci questi 4 gameti sono possibili, possiamo quindi calcolare le

frequenze attese per questi loci. Se abbiamo AB e ab più frequenti cioè i tipi ''parentali''

(perchè siamo in una popolazione naturale) più frequenti, significa che abiamo non solo la

frequenza del singolo locus, ma in aggiunta c'è un D e questo D è il linkage disequilibrium

cioè il fatto che queste classi siamo più frequesti è dovuto al fatto che questi alleli che

erano presenti in cis vengono coereditati, cioè il fatto che nella popolazione abbia un'a

grande, siccome l'altro c'è vicino non avendo un crossing over tra i 2 vengono coereditati,

in condizioni di panmissia cioè di incrocio possibile tra tutti i genitori, però comunque

quello che è sempre associato tende ad andare assieme, in blocco e questa tendenza ad

andare assieme è misurabile come D, che è la stima del linkage di disequilibrium, abbiamo

uno sbilanciamento delle frequenze.

Nell'analisi di linkage conto i crossin over, i ricombinanti, qui non conto i ricombinanti, ma

le frequenze alleliche per ciascun marcatore poi le metto assieme. Disequilibrio significa

disequilibrio rispetto all'equilibrio di Hardy Wainberg perchè io suppongo che questa

popolazione naturale sia in equilibrio.

Il disequilibrio del linkage è una distribuzione non casuale degli alleli a differenti loci; il D lo

possiamo definire come differenza tra le frequenza di cis rispetta alla frequenza dei trans o

viceversa; posso inserire un gene responsabile di un carattere o un fenotipo, in questo

caso sono molto più frequenti gli aplotipi in cui sono presenti gli alleli o grandi o piccoli per

i 2 geni, usiamo linkage di disequilibrio perchè possiamo fare ad es. nei pazienti

ospedalieri 2 popolazioni i malati e i sani: in questo caso la popolazione di disequilibrio è

quella dei malati, io devo andarmi a cercare l'snp associato a quella malattia, no trovo tanti

a caso, l'allele dell'snp A più frequente significa che è in linkage con il gene responsabile

delle malattia, perchè è in disequilibrio. Se l'80% dei pazienti ha l'allele A per quell'snp

significa che quell'snp è associato a quella malattia; lo studio di linkage disequilibriun è

importante perchè io posso fase association mapping cioè ho fatto mappaggio per

associazione perchè non mi sono creato una popolazione segregante, ma ho utilizzato

una popolazione a caso e unqa popolazione di controllo; nella popolazione di controllo io

verifico la frequenza di Hardy Wainberg per quell'allele, nella popolazione a caso verifico il

disequilibrio. Se l'snp è associato significa che ho disequilibrio; un altro concetto è il

concetto di tempo: cioè avviene la mutazione in un genotipo in un fenotipo ancestrale

quindi abbiamo un carattere nuovo, pian piano in una popolazione naturale i loci si

rimescolano e nascono nuovi tipi i crossing over avvengono casualmente ovunque, però

se questo tipo comincerà a incrociarsi nella popolazione avverranno sempre più vicino al

gene mutato e significa che se io ottengo un piccolo pezzo di disequilibrio significa che

quella mutazione è molto vecchia perchè molti crossing over hanno potuto accadere tra la

metazione e il mio marcatore e in questo modo sono potuti risalire a migrazioni di

popolazioni ad esempio.

Il disequilibrio di linkage è il disequilibrio dalle frequenze attese, assumendo una

distribuzione delle frequenze di Herdy Wainberg, quando tra dui loci abbiamo uno o due

aplotipi più frequenti significa che questi 2 loci sono in linkage, si basa sulla conta delle

frequenze alleliche a due a due facendo dei test, in questo modo si fa mappaggio dei

caratteri utili per associazione, si stima un valore di D che sarà più alto più ci avviciniamo

al gene responsabile a quel carattere; quando facciamo mappaggio di linkage facciamo la

conta dei ricombinanti quindi le stime dell'associazione sono al contrario, se abbiamo un

centimorgan significa che siamo più vicini al gene invece qui è il contrario più è alto D (si

stima D la differenza tra frequenza attesa e frequenza rilevate), poi più è alto D più siamo

vicini con questo marcatore a quel gene responsabile di quel carattere. Questi studi da

association mapping li possiamo fare per caratteri agronomicamente utili in popolazioni

naturali non imparentate, ci sono alcuni problemi: si deve tenere in considerazione che a

volte le frequenze cambiano per ragioni che non sono solo il linkage e questi sono dei falsi

positivi e quando sono questi falsi positivi? Quando abbiamo per esempio associazione

funzionale o fisiologica cioè abbiamo un gene cha ha un effetto su un enzima però non è

in linkage al gene che provoca la malattia è su un altro cromosoma, però ha un effetto

pleiotropico, l'allele sarà in disequilibrio funzionale non per il linkage. Altri falsi positivi li

abbiamo quando non siamo di fronte a una popolazione naturale in panmissia, ma

abbiamo modificato le frequenze alleliche per es. se prendiamo tutti i genotipi che sono

stati selezionati per essere piante basse e noi stiamo cercando qualche marcatore che sia

associato a delle resistenze, troviamo magari che in unapopolazione in piante selezionate

che sono tutte basse abbiemo degli alleli che sono più frequenti, che sono in disequilibrio

e sono nella popolazione delle produttive, però non è che questo abbia un effetto diretto

pleiotropico sul carattere, potrebbe essere semplicemente che noi abbiamo preso un

campione che non rappresentava la popolazione naturale cioè abbiamo fatto selezione,

quindi geni che regolano l'altezza vengono trovati in disequilibrio anche se non c'è ne

associazione genetica, ne linkage, ne associazione funzionale però semplicemente per

motivi di deriva genetica o selezione abbiamo selezionato un sottocampione anzichè una

popolazione naturale realmente variabile; questo è ilo caso tipo degli stati uniti in cui è

difficile che si sposino tra loro. Abbiamo o falsi popsitivi funzionali o tutte le volte che non

componiamo bene la popolazione dove facciamo lo studio, l'altro concetto di tempo: man

mano che la mutazione si allontana nel tempo man mano cala il linkage di disequilibrio

attorno ad essa, cioè man mano abbiamo in panmissia una ricombinazione degli alleli man

mano si ridurrà il pezzo che si coeredita sempre insieme a quella mutazione perchè c'è

vicino, man mano per caso aumenterà la casualità di ricombinazione e si rimescolerà

anche se quella mutazione è vantaggiosa per quella specie per cui non viene persa però

di fatto il pezzetto che le sta vicino si riduce e quindi c'è anche un calo temporale del

linkage.

Il linkage di disequilibrium non è uguale in tutto il genoma: ci sono zone il cosiddetto

linkage bloxs, blocchi di linkage in cui è facile trovare disequilibrio cioè troviamo

disequilibrio elevato cioè il disequilibrio non cala: noi cerchiamo questo gene per questo

carattere però tende a calare meno cioè probabilmente c'è meno possibilità di

ricombinazione in quella zona e questo dipende dalla struttura fisica del genoma: ci sono

zone in cui è più frequente la ricombinazione e zone in cui è meno frequente la

ricombinazione, in queste zone in cui è meno frequente la ricombinazione è anche più

elevato il linkage, quindi come non è uguale la frequenza di ricombinazione in tutti il

genoma su tutti i cromosomi lo stesso vale per il linkage di disequilibrio cioè giusto per

questo fatto in modo indiretto il linkage non è = lungo tutto il genoma, ci sono zone a più

elevato D e zone a meno elevato D e questo indipendente dal tempo, quindi non è

uniforme. Gli studi che si fanno per andare a associare un marcatore a un gene per un

carattere attravarso lo studio di linkage sono di 2 tipi: uno si dice il ul genoom scanning,

cioè abbiamo marcatori sparsi nel genoma quindi abbondantemente presenti sul genoma,

facciamo uno studio di associazione cioè andiamo a verificare il D per ognuno di questi,

cioè quale è la zona del genoma quindi su tutti i cromosomi che contiene il gene per il

carattere, per fare questo tipo di studi dibbiamo avere un mumero molto abbondanrte di

marcatori disponibili che generalmente sono marcatori snip, cioè snp, oppure possiamo

calcolare il linkage con approccio tipo geni candidati, i gini candidati servono per il

clonaggio per posizione e per gli studi di associatio mapping cioè possiamo scegliere di

non fare uno scanning per trovare il linkage di disequilibrium in tutto il genoma, possiamo

scegliere dei geni candidati, invece di calcoare le frequenze alleliche ad ogni singolo

locus, calcoliamo le frequenze alleliche a meno loci che sono quelli dei geni candidati;i

marcatori di elezione per fare studi di disequilibrium sono gli snip.

(In genetica umana con i microarrey sta succedendo che la fimetrix fa arrey di oligo, cioè

stampa 22 oligo ben spaziati su ogni gene per fare studi di espressione, hanno iniziato a

fare arrey per il mappaggio di tutto il genoma umano, il primo prodotto si chiama ten chei

arrey e significa 10.000 snip selezionati, validati e ben spaziati, e hanno un altro prodotto

che è il cento chei che sono 100.000 snp; loro stampano questi arrey con questi oligo che

contengono gli snip poi si prende un campione di sangue di un genotipo, si fa una

restrizione enzimatica, poi si lega a un adattore universale con una ligation e si amplifica

tutto sperando in modo equimolare; tutti i pezzi che sono tagliati di dimensioni giuste

vengono coamplificati e ibridati contro l'arrey ten chei o cento chei. Esce il dato con

100.000 loci, quello che si faceva in 10 anni si fa in 3 giorni.)

L'ultima applicazione dei marcatori è un'applicazione pratica, si tratta dell'applicazione dei

marcatori al miglioramento genetico; facciamo una introduzione: il miglioramento

genetico si pone come obiettivo ottenere un fenotipo superiore e fino alle biotecnologie

ottenere un fenotipo migliore significava sviluppare una varietà, sviluppare varietà vegetali,

quindi da un punto di vista genetico il plant briding può essere definito come una

combinazione di interventi che applicati a una popolazione di individui ottiene un gruppo

riproducibile di questi individui, di queste piante che hanno un valore agronomico ed

economico superiore al precedente cioè noi miglioriamo una popolazione di piante

applicando una serie di interventi; in modo sintentico il plant briding è la scienza dello

sviluppo delle varietà, il valore agronomico di queste qualità deve essere superiore alle

precedenti. In italia abbiamo avuto il maggior incremento delle rese per ettaro delle specia

erbacee, ed aquisire caratteri agronomicamente utili; una verietà vegetale può essere

protetta e può essere protetta intrinsecamente perchè definiamo una varietà vegetale

come una popolazione di piante distinta, uniforme e stebile: distinta perchè diversa dalle

altre varietà, uniforme perchè tutte le piante hanno quelle caretteristiche e stabile cioè io

posso coltivare oggi come per 20 anni e posso ottenere lo stesso prodotto. Chiunque

coltivi oggi nei paesi occidentali una specie erbacea coltiva delle varietà: hanno un nome

proprio queste varietà e vengono iscritte a dei registri nazionali per cui esiste una

registrazione con quel nome e con quelle caratteristiche riconosciuta, oltre oggi ogni

varietà vegetale viene protetta anche da un brevetto di tipo industriale, in cui si ha

un'ulteriore protezione di quella varietà. Una varietà essenzialmente derivata è una varietà

del tutto identica alla varietà dalla quale si è originata, tranne per la caratteristica che

deriva dal lato di derivazione, questa unica caratteristica in più è la stessa che ha causato

l'atto di derivazione, quindi significa che quando una qualità è essenzialmente derivata

bisogna riconoscere i diritti del costitutore anche a chi a costituito il prodotto stesso.

Definiamo i sistemi di propagazione e i siatemi riproduttivi: nelle piante agrarie quasi tutti i

fruttiferi sono propagati quasi esclusivamente per propagazione vegetativa, tra le colture

erbacee l'unica che viene propagata in questo modo è la patata: si producono un certo

quantitativo di tuberi, questi vengono divisi e la varietà originaria è quella che ha originato

il primo kg di tuberi è praticamente un clone; chi si riproduce per via sessuata cioè per

seme di fatto per le colture erbacee si divide in due grosse categorie: piante autogame e

piante allogame; le piante autogame sono quelle che si autofecondano e le piante

prevalentemente allogame sono piante che si incrociano con altri individui per riprodursi

sessualmente; un clone è più facilmente clonabile, una varietà di patata un agricoltore la

può moltiplicare se se la sa riprodurre. Come si fa il miglioramento genetico? Le specie a

propagazione vegetative si moltiplicano praticamente tutte per taleaggio, bulbi, rizomi più

qualche foraggiera che si riproduce per agamospermia o apomissia ciè significa che

alcune parti di tessuti generalmente femminili della pianta madre sostituiscono i gameti e

di fatto abbiamo un embrione che deriva non dall'unione di 2 gameti, ma deriva da uno dei

tessuti diplodi o diploizzati della pianta madre, quindi di fatto è una riproduzione asessuata

che però passa per il seme, è una condizione limite, c'è in alcune foraggiere come ad es.

in poa; il miglioramento genetico in questo gruppo di piante si fa o facendo incroci quindi

creando variabilità, ricombinazione e poi scegliere un singolo individuo che noi riteniamo

avere caratteristiche miglori e si clona questo singolo individuo oppure si possono fare

mutagenesi inducendo mutazioni in modo artificiali per caso e produrre delle nuove piante

poi le cloniamo vegetativamente. Le piante autogame sono: frumento tenero, orzo, riso,

soia e pomodoro (colza perchè è una via di mezzo tra autogamia e allogamia); c'è una

percuntuale stimata di esoincrocio, cioè una percentuale di semi che provengono

dall'incrocio della cellula uovo della pianta madre con il polline che proviene da un'altra

pianta non dalla stessa pianta, quindi autofecondazione significa che il polline proviene

dalla stessa pianta o dallo stesso fiore o da altri fiori è sempre autofecondazione, se il

polline proviena dalla pianta vicina quella è la percentuale di esoincrocio, tutte le

autogame si mantengono una percentuale di esoincrocio per mantenere una piccola

percentuale di eterozigosi che può essere utile in casi di cambiamenti ambientali però di

fatto tutto il resto è omozigote, alla fine dopo n generazioni una pianta autogama diventa

pressochè 98-98% omozigote e significa che la pianta autogama è coltivata praticamente

come linea pura, come una popolazione di individui tutti uguali che non sono cloni, ma

sono una famiglia altamente omozigote; significa che di questo tipo di piante l'agricoltore

può comprare seme gm e se lo può riseminare tranquillamente senza ripagare diritti al

costitutore perchè è autorizzato a moltiplicarsi per la sua convenienza il seme, si può fare

con il frumento non si può fare con la soia perchè ha problemi di vigore germinativo; terza

considerazione è quelle genetica: le varietà sono linee pure e questo era il modo di fare

varietà fino a 20-30 anni fa; una trentina di anni fa sono ascesi ibridi di mais e si è provato

a fare ibridi F1 in piante autogame cioè a sfruttare l'eterosi che è il vantaggio in termini

produttivi, di vigore vegetativo dell'ibrido F1, si è provato a farlo per es. anche in frumento

ha un incre,ento di resa del 10%, significa che c'è un parziale effetto eterotica anche in

piante autogame, in realtà in certe piante è molto costoso e difficile perchè non esistono

maschio sterili, perchè il seme da seminare è tanto, per es. in frumento l'unica cosa che si

possono usare sono dei gametocidi cioè dei prodotti che vengono spruzzati sulla fila

portaseme per uccidere il polline, in riso esistono maschio sterile che possono fungere da

porta seme e il vantaggio produttivo è qualcosa in più del 10% per l'ibrido F1 e in cina

quello che chiamano super rise sono ibridi F1, non sono linee pure; linee pure anche per

la soia, nella soia vige il sistema americano, ci sono gruppi di maturazione; colza sono

ibridi F1 perchè non è una vera autogama, pomodoro sono ibridi F1, in pomodoro l'unico

problema era disporre di maschio sterili o ricorrere all'emasculinazione manuale, in

qualche caso si ricorre ancora all'emasculinazione manuale.

Le principali specie allogame sono: mais, barabietola da zcchero e in buona parte il

girasole, anche l'erba medica che però è una foraggiera; le principali sono le preme 2,

barbabietola da zucchero arriva vicina al 100% di allogamia, il mais si avvicina e il girasole

siamo a livelli di 50-60%; in queste specie vige l'eterozigosi, necessitano di piante vicine

che portino polline per produrre sem,e, un loro limite evolutivo è che quando sono

sparpagliate su un territorio vasto hanno minore fitness delle autogame, in quanto fanno

seme da sole, molto spesse la allogame non sono annuli ma sono perennali, alternano

produzione di seme e propagazione vegetativa soprattutto nelle foraggiere, quelle da noi

sono annuali o perennali come la barbabietola, in queste piante le varietà sono ibridi F1

cioè il prodotto dell'incrocio di 2 individui omozigoti quindi una popolazione di piante

totalmente eterozigoti, per il girasole abbiamo ibridi F1 divisi in tre classi di precocità con

un alto con un alto contenuto di acido oleico, con olio di maggior qualità, nella barbabietola

da zucchero abbiamo ibridi F1 divisi in tipologie produttive: peso, zucchero, tipologie

intermedie, non esistono più varietà vendute come popolazioni cioè come un insieme di

piante che si incrocia da solo, chi compra mais bt lo deve comprare l'anno dopo; altra cosa

importante è che essendo allogame strette è più facile che abbiamo gene-flow,

un'impollinazione tra un campo e l'altro, questo gene-flow dipende dalla distanza, se

vogliamo contenerlo dobbiamo rispettare una certa distanza; nella barbaietola da zucchero

questo problema non si pone perchè è una coltura da fittone, non la mandiamo mai a

seme viene raccolta prima, riassumento abbiamo linee, cloni, ibridi F1, esistono barriere

all'autofecondazione nelle allogame cioè sono evolute per non autofecondarsi per cui

spesso anche sono geneticamente autoincompatibili, sono barriere di tipo genetico oppure

barriere di tipo fisiologico, morfologico il fatto che i sessi siano su infiorescenze separate e

anche questa è una barriera all'autofecondazione; per fare ibridi F1 quasi sempre servono

mutanti maschio sterili che non producono polline perchè abbiamo 2 alternative: o

togliamo tutto il polline per favorire la fecondazione dei pistilli con il polline dell'altra linea

che deve produrre l'ibrido F1 oppure abbiamo una pianta che non produca polline, è

preferito possedere maschio sterilità che cosente di mantenere linee pure che producano

solo cellule uovo e non polline ovviamente ci sono sistemi genetici per mantenerci quella

linea altrimenti verrebbe persa, perchè il mantenimento di linee pure si basa

sull'autofecondazione delle speci; gli ibridi si possono fare se noi riusciamo a mantenere

come autogame delle popolazioni di linee, cioè le teniamo separate continuando ad

autofecondarle in modo artificiale per mantenere piante omozigoti, ci serve perchè per fare

l'ibridi F1 dobbiamo incrociare 2 omozigoti, questo mantenimento do linee omozigoti si può

fare se non c'è autoincompatibilità, se abbiamo bisogno di questi maschio sterili abbiamo

bisogno di una linea sorella, tutta uguale a parte che non è mutata per la maschio sterilità,

ci consente una volta incrociata con la nostra linea imbred di mantenerla nel tempo.

Le metodiche tradizionali sono quelle che ci consentono di fare varietà oggi nelle specie

erbacee: nelle piante autogame ci sono 2 sistemi predominanti: uno è il cosiddetto metodo

pedigree e l'altro è il cosiddetto gackrost, sono metodologie pratiche per l'ottenimento delle

verietà; pedigree significa favorire la ricombinazione con un evento unico, cioè facendo un

incrocio, creare variabilità ed andare poi ad autofecondare un numero sempre

decrescente di genotipi di generazione in generazione tenendo i mogliori, prima creiamo

variabilità, poi scegliamo i tipi migliori ed andiamo ad autofecondarli, se autofecondandoli

perdono le caratteristiche positive li abbandoniamo se invece autofecondando

mantengono caratteristiche superiori noi li teniamo, autofecondiamo fino ad 8-9

generazioni per ottenere la linea pura che è la varietà; il backrost significa reincrocio, è un

altro schema del miglioramento genetico che consente di introgredire caratteri utili, geni

uliti su un genotipo ricorrente cioè noi abbiamo un backgraund genetico che noi

consideriamo valido, se noi abbiamo dall'altra parte un donatore di una caratteristica utile

facciamo un primo incrocio e otteniamo variabilità ma non ci interessa, selezioniamo

soltanto quelle piante che portano il gene utile, incrociamo l'anno dopo ancora per il

cosiddetto ricorrente (almeno 5) per arrivare ad avere il 99% del beckgraund omozigote

del ricorrente.

Nello schema a pedigree abbiamo un centinaio di piante F1, già alla prima

autofecondazione in F2 abbiamo una esplosione di variabilità:loci che diventano

omozigoti, loci che prendono un allele, tutte le diverse combinazioni; poi abbiamo piante

scelte e seminate in un altro anno e alcune verranno scelte a alcune scartate, via via si

passa a un numero sempre minore di piante che si chiamano poi famiglie e sono sempre

più uguali, alla fine otteniamo 6-7-8 linee dall'F8 all'F10 che hanno caratteristiche proprie e

che teoricamente sono meglio dei parentali, è comunque un processo che dura 8-10 anni

ed è un processo che si autoalimenta nel senso che tutti gli anni si fanno incroci; nel

backrost invece c'è una piccola varialibile che è quella dell'allele dominante e quella

dell'allele recessivo; abbiamo un donatore e un ricorrente: vogliamo portare il gene,

carattere A dentro al ricorrente, produciamo un F1 che viene poi incrociata con il ricorrente

e si chiama popolazione bc1 che è quella del primo reincrocio, a questo punto questa si

divide in mezzi eterozigoti per il carattere desiderato e mezzi saranno come il ricorrente;

prendiamo una pianta del carattere desiderato e la incrociamo per il ricorrente e otteniamo

bc2, alla fine decidiamo che 5 reincroci sono sufficienti, ancora selezioniamo in presenza

del virus, quelle suscettibili via quelle resistenti sono ancora eterozigoti, quindi facciamo

un' ultima autofecondazine e prendiamo solo quelle dominanti omozigote, è una linea pura

che è tutta uguale al ricorrente meno che per il carattere A perchè è migliorato, anche

questo è un processo abbastanza lunga circa 7 anni sempre che non abbiamo 2 campi,

complicazione dello schema è quando abbiamo un carattere recessivo, complicazione

perchè se il carattere del donatore lo vedo solo quando è omozigote recessivo qundo

abbiamo fatto l'F1 è eterozitote, nella bc sarà mezzo eterozigote e mezza dominante

perchè è ricorrente che è dominante però in quell'eterozigote l'allele recessivo non si

esprime quindi a noi appaiono tutte suscettibili e non riusciamo a scegliere le piante da

reincrociare? Dobbiamo perdere un anno perchè dobbiamo fare un'autofecondazione, far

segregare, teniamo i resistenti facciamo una bc2 e una bc3 e il processo dura il doppio 14

anni anzichè 7, sempre se non facciamo 2 generazioni l'anno; questo perchè il ricorrente

era dominante mentre il donatore era recassivo.

Graficamente gli schemi delle allogame: es. schema di produzione degli ibridi,

autofecondiamo delle linee portando il polline dal pennacchio sulla spiga, poi abbiamo dei

campi di produzione dell'ibrido in cui in mais possiamo tagliare quella maschile e usare

quella come portaseme, in questo caso l'incrocio a due omozigoti, mi dà il cosiddetto

ibrido semplice o sigol crossing, questo è totalmente eterozigote a vigore eterotipo, se lo

reincrociamo con un altro ibridi F1 abbiamo un ibrido doppio un cosiddetto dable crossing

il cui costo del seme è molto più basso e l'eterosi è ancora molto elevata, se noi facessimo

su questi ibridi F1 una imbred c per es. un'altra si chiama ibrido triplo a tre vie; un progeny

test graficamente es. top cross: si prende una sola linea valida, e si incrociano tutte le

piante che ci sembravano buone l'anno prima per questo test e si ottengono famiglie e si

valuta la performance; parte del seme viene ottenuto per autofecondazione però sempre

su quella imbred.

Applicazione dei marcatori: con il miglioramento genetico otteniamo una varietà, con gli

incroci di selezione e con la mutagenesi, i limiti del sistema sono il numero di caratteri

disponibili, l'incrociabilità, i sistemi riproduttivi, lunghezza del ciclo biologico, il fatto che

impieghi molta manodopera; la selezione assistita o MAS è una metodologia non ogm per

baipassare alcuni di questi limiti introducendo i caratteri innovativi senza la modificazione

genetica, è una delle applicazioni dei marcatori molecolari, una delle più pratiche, dirette

visto che è un lavoro che si va a fare in settori vicini a quello commerciale cioè si

applicano i marcatori per fare le varietà, il problema risulta essere la scelta del genotipo

per avere un fenotipo migliore. La MAS si chiama molecolar assisted selection o marcìker

assisted seletion o selezione assistita o briding assistito, ha tanti nomi che abbreviamo

con mas ed è la selezione di genotipi di piante agrarie attraverso i marcatori molecolari in

addizione o sostituzione della selezione fenotipica, quindi noi individuiamo tre livelli di

miglioramento genetici delle piante erbacee, il briding tradizionale quello fatto fino alle

biotecnologie, il briding integrato e il briding nuovo; briding integrato è quello che abbina il

brifing fenotipico tradizionale con l'uso dei marcatori, possiamo individuare quindi tre livelli

oggi disponibili per fare nuove varietà. Quando parliamo di Harbes index significa

percentuale di biomassa utile sulla biomassa totale, quando parliamo di biomassa significa

peso secco totale di una pianta. Quali sono i vantaggi della selezione asssistita cioè

dell'uso dei marcatori? Importanti sono 2: uno mi vincola dall'ambiente, quindi il fenotipo lo

vedo o non lo vedo anche a seconda diella condizione ambientale biologica, mentre il

genotipo lo vedo sempre perchè il dna sta nel nucleo e riesco sempre a evidenziare quale

sequenza noi abbiamo in quella pianta, quindi mi svincolo dall'ambiente e poi l'altro

vantaggio grande che abbiamo è che io guadagno tempo oppure nello stesso tempo

selezionare per molti più caratteri.

Selezione assistita significa introdurre un carattere positivo, non attraverso la selezione del

gene stesso, ma attraverso la selezione di un marcatore associato al gene, introduco poi

un marcatore per quell'aplotipo quindi ottengo il risultato desiderato, viene usata una

metodica molecolare, quella dei marcatori. Devo usare la MAS e non altre vie perché? Ci

sono alcune considerazioni in merito, finora le varietà le ha fatte chi non andava in

laboratorio, chi non va in laboratorio è diffidente verso il laboratorio e questa dicotomia tra

gli operatori fa tardare l'ingresso delle selezione assistita nel settore del miglioramento

genetico anche se questa di fatto negli ultimi anni si è inserita.

I fattori che mi fanno scegliere se fare o non fare MAS sono sei: quali marcatori ho a

disposizione, conoscenza della genetica delle specie, quali sono i costi, il tempo

risparmiato, come riesco ad organizzarmi il lavoro e l'assenza o la presenza di strategie di

briding convenzionale cioè se io ho una varietà la riesco a fare nello stesso tempo col

briding convenzionale rispetto alla selezione assistita è inutile che faccia selezione

assistita, invece in altri casi è impossibile selezionare in modo convenzionale. Vediamoli

velocemente ad uno ad uno: ovviamente devo avere i marcatori in linkage, se non ho i

marcatori in linkage non ci riesco, anche quando ho marcatori in linkage devo avere

marcatori che abbiamo facilità di esecuzione, rapidità di esecuzione e che il costo della

singola analisi sia comunque limitato; la cosa migliore sarebbe avere marcatori che sono

prodotti senza estrazione di dna, ma direttamente sul succo vegetale; il più esportabile su

tutto il germoplasma meglio è cioè se ho una marcatore in linkage a una resistenza che

funziona solo con uno o deue incroci perchè è in linkage come allele solo in una varietà

non mi serve, devo avere un allele sempre in linkage con la resistennza e che lo riconosco

in tante combinazioni d'incrocio (universalità del marcatore). Altre caratteristiche meno

importanti: la codominanza è preferibile, l'affidabilità e la distanza dal gene sono cose

importanti se ho un marcatore per fare selezione assistita di un gene per una resistenza a

10 centimorgan significa che ho il 10% di sbagli, seleziono 100 piante che penso siano

resistenti però 10 saranno da buttare, solitamente ci si accontenta di un centimorgan un

solo sbaglio su 100; altro fattore imporetante genetica della specie: se devo migliorare una

specie la cui genetica non è nota, cioè non so se è diploide, poliploide, quanti cromosomi

ha, se ci sono mappe genetiche o no, se abbiamo una specie in cui la genetica è a livelli

moto bassi ci conviene usare metodi tradizionali, è importante anche la genetica del

carattere cioè è più facile fare selezione assistita per introdurre i geni di resistenza, è un

gene che ci dà resistenza a un virus ad es. e sappiamo che sta su un cromosoma, in quel

caso è molto utile far miglioram,ento assistito se non abbiamo sistemi di verifica della

presenza del gene, diretti cioè fenotipici se invece abbiamo una resistenza che è dovuta a

chissà quali geni è moglio cambiare metodo, per certe specie è gia nota una mappa

genomica delle posizioni di caratteri utili per altre no.

Considerazioni di costi: questa vanno fatte, la selezione assistita non deve essere un

costo addizionale, mi deve aiutare non aggravare, per risolvere problemi in termini di costi

la seleziona assistita deve preferire le economie di scala, deve organizzare così bene il

lavoro per fare 20.000 analisi all'anno non 50! Poi bisogna dividere i costi di sviluppo in

costi operativi, i costi di sviluppo sono quelli di sviluppo del marcatore di ricerca e

sperimentazione, gli studi pubblici di ricerca sviluppano marcatori e poi li pubblicano, le

ditte private che si sviluppano marcatori proprietari o li brevettano per venderli oppure li

usano loro segretamente; nei costi operativi abbiamo i costi variabili e i costi fissi: costi

fissi sono quelli di aquisto delle macchine e i costi variabili sono quelli di mano d'opera; se

riusciamo ad abbattere i costi la selezione assistita può anche essere iniziata con una

tecnologia povera; tempo: la selezione assistita deve risparmiare tempo, nell'ottenimente

di una varietà rispetto al briding convenzionale significa che se noi facciamo briding

integrato cioè abbini alla selezione fenotipica alla selezione dei marcqatori abbiamo dei

tempi più o meno paragonabili, oppure lievemente migliori del bridind tradizionale, gli

schemi migliori sono gli schemi nuovi che si basano solo su marcatori; l'organizzazione del

lavoro: disporre di informazioni sparpagliate a caso in diversi quadernetti in un laboratorio

non serva a niente, le informazioni sono un lavoro e più sono organizzate meglio è perchè

devono essere di accesso per tutti quindi è importante riprodursi un data base che unisca

informazioni pedegee e di geni presenti in un certo germoplasma e alleli marcatori

presenti; l'ultimo fattore è l'esistenza o l'assenza di strategie di briding convenzionale: ci

sono casi in cui col briding convenzionale non riusciamo a introdurre un bene di resistenza

che invece potrebbe essere introdotto per es. se siamo in un paese in cui è assente un

certo virus non possiamo fare una varietà resistente a quel virus senza portarci il virus in

casa o senza riuscire a fare i test di resistenza, se invece ho il marcatore è una strategia

possibile nel senso che io mi porto per gli incroci una varietà che porta quella resistenza e

comincio a selezionarla genotipicamente per il marcatore associato poi allas fine quando

ho un pò di linee che sembrano valide, buone le mando all'estero e valuto se hanno una

resistenza, quindi anche in assenza di strategie di briding convenzionale uso il

miglioramento assistito in altri casi il test della selezione è troppo lungo. Per una ditta

privata è conveniente fare selezione assistita con i marcatori molecolari.

Metodi ti selezione assistita: Prima di tutti bisogna disporre dei marcatori in linkage cioè

dei marcatori associati ai caratteri indipendente dalla loro posizione nel genoma; una linea

di lavoro molto usata è quella di baipassare le mappe di linkage e usare sistemi come la

BSA e sistemi simili, trovare un marcatore associato a un carattere trovando molti

marcatori casuali con questa strategia di bsa, poi la conversione del nostro marcatore. Le

nils sono linee quasi isogeniche, attraverso uno schema di reincrocio possiamo introdurre

su un parentale suscettibile e significa che è tutto uguale al ricorrente, ha gli stessi geni

però è quasi isogenica, non ce li ha tutti però ha quel carattere, disporre di queste nils: una

linea suscettibile e una linea che è tutta = al suscettibile meno per quel tratto di

cromosoma che c'è il gene per quel carattere di resistenza è un buon materiale di

partenza per sviluppare un marcatore con la selezione assistita (saranno ricombinati

dappertutto meno che nel locus del carattere).

(Meglio disporre di marcatori codominanti). Abbiamo il nostro marcatore, lo abiamo

selezionato, abbiamo il nostro set di marcatori associati a un centimorgan dei nostri

caratteri, possimo avere delle applicazioni di briding integrato (primo livello), abbinare cioè

selezione fenotipica con selezione genotipica, possiamo avere schemi nuovi; del briding

integrato possiamo fare la scelta dei parentali, assistere a schema di pedigree e allo

schema di reincrocio oppure assistere alla produzione di doppi aploidi; nella creazione di

nuovi schemi abbiamo più geni di certi caratteri, accumulo di geni favorevoli. Un altro

schema che è l'advantas backross che è l'analisi è uno schema per le piante, per l'intero

genoma. Vediamoli singolarmente: scelta dei parentali: gli obiettivi di usare marcatori per

scegliere parentali, possiamo scegliere aplotipi di imbred omozigoti che mi consetano di

fare la migliore combinazione di incrocio, l'obiettivo è baipassare i progeny test, possiamo

tentare con i marcatori di predire l'eterozigosi, una volta che abbiamo tutte le imbred

catalogate possiamo predire la produzione dell'ibrido senza passare dai progeny test, il

secondo obiettivo nella scelta dei parentali riguarda le autogame e in perte anche le

allogame, cioè a volte si usano dei genotipi che portano resistenze per essere incrociati

con genotipi produtiivi, si può valutare quanto sia ristretta la base genetica di questi

genotipi che portano questa resistenza perchè molte volte tutti questi che portano lo

stesso gene di resistenza derivano magari da uno stesso progenitore. Dieci o venti linee

succassive che portano quel patogeno noi potremmo verificare che di fatto sono tutte

molto simili: non è un bene e ci dice che potremmo usare una sola di queste 10 linee che

è la stessa cosa: oppure 10 o 230 linee ce ne saranno 18 tutte = e 2 molto diverse allora

per fare questi incroci usiamo in base alla diversità allelica una di quel gruppo di 18 e le

altre 2, la verifica della diversità allelica nei parentali ci guida nelle scelte per gli incroci;

marcatori di elezione: aflp oppure i microsatelliti o gli snip, la tendenza è andare verso gli

snp, dobbiamo averi sistemi che ci consentono di identificare più loci con una singola

analisi, gli svantaggi quali sono? Se avessimo una residua eterozigosi delle imbred questo

ci falserebbe il risultato nel senso che non sapremmo quale allele andrà a finire nell'ibrido

F1, l'altro problema che il test genotipico è assolutamente affidabile, le predizione che si fa

con i marcatori non corrisponde mai completamente con i progeny test, quindi non è vero

che avere la massima diversità allelica nei marcaori ci dà la massima eterosi (questo è

stato visto anche in riso).

Secondo schema pedigri assistito: gli obiettivi e i vantaggi quali sono? E' uno schema che

va bene per la autogame, quindi affianchiamo le normali analisi fenotipiche con selezione

fatta con il genotiping, si va in contemporanea a partire dall'F2 in avanti cioè da quando

abbiamo ricombinazione, i vantaggi sono: ben accetta, facile, immediata, versatile, un

limite della selezione fenotipica è legata al tempo e allo spazio di permanenza in campo, lo

posso fare anche con i qtl e il loro ottimo è avere una finestra non superiore ai 10

centimorgan però con i qtl si devono utilizzare 2 marcatori alla volta. I marcatori di elezione

sono diversi marcatori prc specifici, sono pochi loci testati però sono tanti i genotipi, gli

svantaggi sono che i tempi do ottenimento delle linee sono praticamente = al briding

tradizionale.

Il backross assistito è diverso dal backross acceletaro cioè questo è un metodo di

selezione assistita integrata cioè che integra la selezione fenotipica con i marcatori, in

questo caso entrano anche i transgeni e ottenere alla fine un'altra linea più produttiva che

contiene anche il transgene, guadagno molto tempo con questo sistema, è sempre il

doppio più veloce, questo vale anche per il pedigrì nel senso che per molto geni clonati o

per i transgeni utilizzo marcatori disegnati sul gene stesso, l'efficienza è massima perchè

non abbiamo più ricombinanti disponibili in molte specie geni clonati, non patentati; i

marcatori di elezione sono gli stessi, per i transgeni dove non devo selezionare

obbligatoriamente l'omozigote, perchè non abbiamo la controparte allelica, possiamo sare

metori alternativi es. dot blot, gli svantaggi: se ho un carattere che si vede bene che è

dominante questo serve a poco, guadagno molto se ho caratteri che si vedono male, un

sistema integrato potrebbe essere quello di assistere alla produzione di doppi aploidi che

sono uno dei metodi di fare briding abbasanza moderno dove abbiamo la necessità di

produrre linee omozigoti con lo svantaggio che non stiamo selezionando l'omozigote, lo

dobbiamo selezionare in fasi finali, possiamo pilotare la traduzione di doppi aploidi perchè

possiamo monitorare quali marcatori multiloci portino l'uno o l'altro background genetico,

gli schemi nuovi sono schemi prima inpensabili, uno di questi è il gene piramidy cioè sono

la piramidizzazione, l'accumolo di geni favorevoli, ovviamente i geni non sappiamo quali

sono, l'obiettivo è quello di accumulare più loci in uno stesso genotipo generalmente di

resistenza facendo incroci multipli per accumulare in un'unica linea 4-5-6 loci di resistenza

a più patogeni, si può fare con pedigrì modificati, alla fine si scelgono quelli che hanno tutti

e 4 i loci in omozigosi, con il reincrocio è un pochino più difficile.

Una cosa interessante è che possiamo attraverso incroci di selezione per il marcatore

degli stessi transgeni accumulare più transgeni per diversi step di un pattuei, cioè

possiamo avere un effetto finale che necesita di 2-3 modificazioni che possono essere

messi in diversi eventi e verificare che esista la proteina, si fanno gli incroci e si

selezionano le piante omozigoti che portano entrambi i transgeni, alla fine dovrei avere la

proteina attiva ed è stato fatto questo. I marcatori di elezione sono marcatori pcr specifici,

sts, scar, snip, gli svantaggi possono essere che all'inizio il lavoro è noioso e non si vanno

a selezionare fenotipicamente le piante e non si sa quale sarà l'effetto sul fanotipo e se

queste piante avranno altricaratteri produttivi o meno, ci concentraimo sull'accumulo di

questi geni e alla fine avremo linee in cui abbiamo accumulato tanti caratteri utili. Nelle

specie con varietà ibride, va bene per geni dominanti dove possiamo nell'ibrido F1 4

resistenze, se invece abbiamo caratteri utili, loci utili con alleli recessivi diventa un

problema il processo di piramiding perchè non dovremmo avere nell'ibrido F1

segregazioni, dovremo piramidare gli stessi geni.

Uno dei limiti della selezione fenotipica in pedigrì è la gestione del n. di genotipi F2, non si

riesce per ogni ditta a selezionare più di qualche migliaio di piante per ottenere qualche

fenotipo superiore, in questo modo limitiamo il numero di ricombinanti, se potessimo

produrre un n. molto grande di ricombinanti e poi testarlo coi marcatori molecolari

otterremmo ricombinanti favorevoli e quindi più efficienza nel processo in termini di tempo

e spazio. Esistono strategie miste, che uniscono questi metodi.

Backross acceleratio: impieghiamo molti anni a fare uno schema di pedigrì, per accelerare

il pedigrì è quello dell'analisi simultanea selection, piante che siamo già in omozigoti in F2

ai loci scelti, un modo per accelerare il backross è quello del backross accelerato, si può

selezionare con marcatori per il carattere portato dal donatore, ciò che velocizza è la

scelta degli alleli del ricorrente tra tutte le piante che derivano dal reincrocio, seleziono

piante che portino il maggior numero di alleli del ricorrente, prima selezionavo solo

l'eterozigote per il carattere che introgredivo poi a caso prendevo una pianta e l'incrociavo

con il ricorrente, però portulavo che dopo la prima volta aveva il 50% di genoma nel

ricorrente, dopo il reincrocio ne aveva il 75% e così via, in realtà la pianta la prendevo a

caso, se io invece mi tengo un pò più di queste piante eterozigoti e poi vado a verificare

quali tra queste quella che ha casualmente la > porzione di alleli del ricorrenti potrei

vedere che invece del 75% sono all'87% in quella pianta, allora prendo solo quella pianta

e faccio il backross, ottengo il prodotto di reincrocio, scelgo quelle eterozigoti con un

marcatore o con un fenotipo e magari ne troverò una che è al 99%, in tre backross potrei

avere il mio prodotto finale a multi loci, i marcatori di elezione sono gli aflp, o anche gli

snp.

Uno schema nuovo proposto per il pomodoro è l'advansed backross qtl analisis, è uno

schema assistito unito all'analisi qtl, è stato proposto in pomodoro di fare diversi reincroci,

selezionando fenotipicamente e alla fine trovare le regioni che portano i caratteri qnt

unendo la scoperta dei loci importanti all'interno di un normale processo di briding, si fa qtl

in fase avanzata, il vantaggio è che non si parte a dati noti in letteratura, i difetti sono che

noi perdiamo qualcosa soprattutto nelle prime fasi, l'ultimo non ancora possibile nelle

piante fare selezione assistita in tutto il genoma usando gli arrey di snip, il dna arrey, ed è

il punto di arrivo.

Una delle applicazione dei marcatori molecolari in senso lato è quello della diagnostica:

abbiamo 2 vie alternative: la via proteica e la via di individuazione di sequenze di dna; la

metodologia basata sulle proteina si basano sull'immunoasei che è una metodica utilizzata

in medicina da oltre 30 anni e serve per il monitoraggio sia di malattie che di abuso di

droghe, test di gravidanza, sono molto affidabili, test flessibili, di basso costo, economici

ed ideali quando è noto il targhet. Si basa su un legame di un cosiddetto antigene e un

anticorpo, la fine del sistema immunitario è la produzione di anticorpi, proteine complesse

che vanno a legarsi con l'antigene provocando la precipitazione, sono prodotti dai

mammiferi, quindi dobbiamo avere un antigene che inserito in un sistema immunitario

funzionante di qualche organismo riproduca anticorpi, perchè le piant non sono in grado di

produrre una reazione immunitaria, una volta che io ho prodotto anticorpi posso pensare

che qualsiasi analita sia un antigene, qualsiasi molecola, e una volta prodotto questo

immunoasei ha un'alta specificità perchè è molto specifico per quell'antigene e un'alta

sensibilità, ne riconosce anche piccoli quantitativi dell'antigeni, la preparazione del

campione è anche minimale nel senso che l'anticorpo riesce a riconoscere l'antigene

anche in tessuti cellulari in cui ci sono molte proteine e molti composti simili. la specificità è

tale in modo che l'anticorpo riconosce solo l'antigene targhet; la strutture dell'anticorpo è

fatta da 2 catene lunghe, pesanti e 2 catene leggere, e il sito di legame all'unione della

catene leggere con le catene pesanti, le immunoglobuline sono la categoria di proteine,

anticorpi ed hanno una struttura conservata, che viene riconosciuta dal sito, un problema

potrebbe nascere in un ogm, ricadiamo in un antigene che ha una risposta immunogena,

che riesce a produrre anticorpi perchè tipicamente ha un peso molecolare elevato. I modi

di detectaggio di questa reazione anticorpale sono il metodo enzimatico, il metodo elisa,

radio leveling, i kit disponibili per gli ogm sono l'elisa in cui abbiamo 2 anticorpi che si

legano da una parte e dall'altra, oppure c'è un'altra possibilità che è l'immunoasei

competitivo.

L'Elisa; abbiamo un anticorpo legato a un pozzetto, che riconosce il mio ogm, la mia

proteina che si lega al pozzetto, avendo inserito un secondo anticorpo legato a un enzima,

poi si fa un lavaggio, se abbiamo inserito anche l'antigene significa che questo è un

enzima riuscito a legarsi a sendwich, se non c'era viene lavato e gettato, poi inseriamo un

altro substrato, reagente e facciamo avvenire la reazione enzimatica: se abbiamo l'enzima

avviene la reazione enzimatica, se l'enzima è stato lavato la reazione enzimatica non

avviene, se avviene la reazione enzimatica cambia il colore.

L'ateral flus trip: praticamente abbiamo un sito di controllo e un altro sito in cui è presente

in una posizione fissa l'anticorpo legato al supporto, dove noi mettiamo una gocciolina di

estratto vegetale nel pozzetto: questo si lega a un anticorpo con del colorante e poi si

diffonde per capillartà lungo tutto lo strip, dove incontra la striscia in cui c'è l'altro anticorpo

legato se ne accumula una certa qnt, è molto comodo per il detectaggio di ogm, l'altro

modo di fare l'immunoasei è quello competitivo cioè sappiamo quale è la nostra molecola

targhet e se mescoliamo il nostro campione con una qnt nota del nostro antigene già

marcato con coloranti florescente, se non c'è l'antigene nel nostro campione si legherà

solo quello marcato fluorescente, quindi avremo un segnale molto intenso, se c'è anche il

nostro antigene che non è marcato questo va in competizione quindi avremo una riduzione

dell'emissione di luce.

Stiamo utilizzando tecniche che vanno bene per tutti i marcatori molocolari, tranno

l'immunoassai, sono da considerare marcatori in senso lato e li inseriamo alle applicazioni

biolotecnologiche delle specie erbacee, l'immunoassai l'abbiamo già visto, c'è questo

problema che le molecole devono avere una certa dimensione altrimenti non trovano il

targher, per i transgeni non c'è problema, il sistema dell'immunoassai non va

eccessivamente bene se il transgenico produca poca proteina, in questo caso è meglio

andare a vedere se c'è la equenza del dna, l'immunoassai essendo basato sulla

coniugazione all'anticoporpo con la proteina prodotta dal transgene ci deve essee la

proteina, abbiamo detto che è molto specifico ed ha anche una sensibilità accettabile 0.3-

0.4% di ogm sul peso secco, alcuni sistemi: abbiamo parlato di Elisa e Lateral flus trip e

sono entrambi sistemi a sendwich in cui 2 anticorpi sono coniugati alla proteina dell' ogm

uno legato a un supporto e una marcato con un reagente o colorante, oppure

nell'immunoassai competitivo dove abbiamo la competizione tra proteina standard legata

all'anticorpo e anticorpo legato alla proteina transgenica, i formati non sono solo L'Elisa,

ma sono diversi tradizionalmente Elisa, il lateral flus trip come funziona? Abbiamo

l'endotossina bt che si lega al marcato e poi troviamo una striscia in cui c'è l'altro anticorpo

legato al substrato e qindi abbiamo la formazione del sandwich e la colorazione sulla

striscia; i livelli in cui noi possiamo andare a vedere se c'è espressione del transgene sono

diversi, non solo in fasi della commercializzazione dell'ogm, ma sono anche durante la

produzione dei transgenici per vedere se la pianta esprime una proteina, se l'ibrido

l'esprime correttamente, se in quella varietà sta segregando se si è abbassato quindi il

livello di proteina prodotta per qualche motivo, questi casi possono essere utili per vedere

se anche in fase di produzione per la compagnia che sta producando ogm diverse fasi

della procedura di briding abbiamo o non abbiamo espressione del transgene. Per es.

nelle conversioni di una linea normale in una linea transgenica assistita da marcatori si

può assistere con l'iommunoassai la presenza o meno del transgenico dento alla linea nel

quale stiamo reincrociando il transgene, per vedere se abbiamo presenza o meno del

transgene espresso.

Le applicazioni dell'immunoassai non sono solo quelle del detectaggio di ogm, ma

possono essere anche la detection di altri inquinanti come pesticidi, tossine, glicotossine,

alcaloidi; all'interno di alimenti; l'immunoassai può essere usato per il detectaggio di

allergeni nei cibi, ci sono diversi allergeni noti es. quelli dell'arachide anche mortali.

Restando nel campo dei marcatori per il detectaggio di ogm vediamo quali sono le

possibilità dell'uso di tecnologie basate sul dna, sul detectaggio della sequenza genica: ci

basiamo su 2 sistemi: l'ibridazione di sauthern (dna-dna) e la pcr, ampiamente usate nella

produzione di marcatori molecolari, per quanto riguarda la metotica di sauthern si può

avere un'utilizzazione nel dlot blot dna genomico blottato e reso a singolo filamento a 96

spot su una membrana, per ibridazione del marcatore con questo dna a singolo filamento

a dot blot, un'alternativa è l'uso dei microarray: l'ibridazione con oligo legati su superfici

solide, per quanto riguarda la pcr ne abbiamo diversi tipi utilizzabili e abbiamo pcr and

piont in cui vediamo alla fine se c'è un amplificato o meno, poi ci sono diverse metodologie

per verificare se il transgenico è proprio lui una di queste è la pcr rflp, cioè una digestione

con enzimi di restrizione perchè oppure il sequenziamento diretto però sono sempre pcr

and point; oppure potremmo ibridare la probe dello standard contro prodotti di pcr, sono

sistemi abbastanza macchinosi; l'alternativa a questo sono le diverse pcr quantitative,

sostanzialmente oltra alla pcr Elisa, pcr quantitativa competitiva e pcr real time, e sono le 2

più usate. Tutti i sistemi si basano sul riconoscimento specifico di sequeneze, significa che

siamo limitati dalla conoscenza di quali sequenza sono inserite nel transgene nel senso

che non possiamo fare un kit di detectaggio di ogm senza prescindendo dall'ogm, da cosa

contiene quel transgenico, se non contiene il 35S è inutile che andiamo a fare una pcr

contro il 35S, dobbiamo o fare diversi saggi per diverse parti del gene oppure si potrebbe

amplificare una parte del promotore e una parte del gene strutturale in questo modo

entrambi devono essere copresenti o coassenti, 'alternativa sono pcr multiplex cioè fare

primer molto differenti sulle tre diverse componenti e poi fare una pcr simultaneamente dei

tre componenti (promotore, gene, terminatore), oppure pcr multiplex utilizzando coppie di

primer disegnati su tutti i promotori possibili. L'unico sistema che ci consente di

baipassare questo problema è quello dell'gm ocip che pur essendo un sistema chiuso,

possiamo avere tutti gli eventi commercializzati in un continente nello stesso kit, per

arrivare alla pcr che sia and point o qnt dobbiamo ottimizzare la pcr e l'estrazione di dna, i

più usati sono wizard però può sembrare banale però se andiamo a verificare la qnt di dna

estratto, estrazione di dna su tessuto fogliarre non ci sono grossi problemi però potremmo

avere di fronte campioni magari essicati in cui il dna è parzialmente degradato o campioni

che sono stati insilati, sono andati incontro a processi degradativi microbici per cui

esistono protocolli per diverse matrici, la condizione ideale è campione fresco e dna da

campo. Se non c'è una sufficiente qnt e qualità del dna estratto non è possibile fare una

pcr in modo ottimale, inoltre dobbiamo tenere in conto resa in qnt e qualità del dna estratto

e scelta della sequenza targhet, sono le tre variabili fondamentali, attualmente i promotori

più usati sono: 35S, NOS o promotori batterici, noi scegliamo per la presenza di ogm quelli

che sono attesiu con > frequenza, geni strutturali mette dentro anche i marker: marker

NBT2 si sta riducendo, stanno umentando quelli gene bar, resistenza al glufusinate

ammonio, ci sono anche i geni strutturali degli ogm: epsps della raund up ready, cry dei

vari bt; diversi mais che hanno anche gli stessi geni cry per le tossine bt posseggono

componenti di promotore e terminatore diversi a seconda della ditta. Dati questi tre

accorgimenti generali vediamo le tecniche quali vantaggi e svantaggi hanno:

convenzionale è la pcr and point. pcr and point potrebbe essere un primo scrining basato

su componenti comuni come il terminatore nos o 35s e una volta trovato che ci sono i

transgenici andare a vedere se si tratta di BT11 piuttosto di BT176 con dei primer più

specifici disegnati su quegli eventi, la verifica dei falsi positivi che siamo realmente di

fronte all'amplificato del transgene si può fare pcr rflp: digestione enzimatica

nell'amplificato, si può ibridare con sonde però il sistema è più macchinoso e poi non si

può fare su gel ma trasferire su membrana l'amplificato, si può sequenziare, la verifica dei

falsi negativi cioè quando non abbiamo niente, e per decidere che non ci sono transgenici

nel campione dobbiamo avere coamplificato un gene housekeaping cioè un gene per es.

con un'invertasi o un altro enzima che è presente sempre nelle cellula vegetale, la pcr è

avvenuta, il dna c'era e in qnt sufficientee questa è la verifica del falso negativo; pcr rflp

per es. anche di sequenze mitocondriali.

L'ibridazione può essere fatta con un sistema dot blot, quindi con una probe che è marcata

generalmente o con sistema di chemioluminescenza o con un fosforo 32, anche se il

sistema di chemioluminescenza è più usato come quello della digossigenina e in questo

caso abbiamo una verifica di tipo dot blot in cui abbiamo l'amplificato dei minisatelliti che

sono specie specifici poi li abbiamo portati su membrana a abbiamo ibridato, minisatelliti

ripit di 15-30 paia di basi anch'essi abbondanti nel genoma, i microsatelliti sono specie

specifici; nella pcr and point non può essere quantizzato il prodotto, possiamo dire che se

abiamo un'amplificazione, questa potrebbe anche esssere dovuta anche alla presenza di

0.1% di transgenico dentro a un campione ed esssere corretta, non c'è una assoluta

certezza di esssere sotto allo 0.9% do ogm (soglia consentita), ed esserci una

contaminazione casuale, si può utilizzare uno dei sistemi di pcr quantitativi, il meno usato

è la pcr Elisa, in cui abbiamo una piastra di tipo Elisa e un sistema di tipo sendwich in cui

abbiamo un oligo che è omologo al mio transgene che viene fissato dentro al pozzetto,

attaccato alla matrice, facciamo la pcr, facciamo ibridare il prodotto di pcr a singolo

filamento contro questo oligo, questo prodotto di pcr è anche stato marcato con

digossigenina, viene lavato con un anticorpo che si lega a digossigenina e abbiamo un

substato che reagisce contro un anticorpo che si lega a sendwich, in questo caso a

seconda di quanti frammenti di pcr abbiamo legati contro il pozzetto abbiamo un'intensità

< o > di colore come nel test Elisa, il sistema è macchinoso e poi la quantitazione che

viene fatta contro uno standard a concentrazione nota, con la pcr quantitativa competitiva

abbiamo come principio simile quello dell'immunoassai competitivo, con la pcr quantitativa

competitiva abbiamo la possibilità di misurare quanto transgene c'è nel nostro campione

perchè facciamo competere il transgene presente nel campione con quantitativi

sostanzialmente crescenti di uno standard noto perchè il numero di amplificati alla fine dei

35 cicli è direttamente proporzionale a quante copie di templato avevamo messo all'inizio

e mettondo in competizione uno standard interno con il nostro transgenico, si amplificherà

più transgenico o standard interno a seconda che ci sia più dell'uno o dell'altro; quando

abbiamo il punto d'equivalenza significa che abbiamo tanto templato dello standard

quando del transgenico, quando abbiamo equimolari i 2 templati il prodotto di

amplificazione prevede in equimolarità il prodotto amplificato. Il massimo è la pcr real time

in cui verifico nella fase geometrica di amplificazione dei templati, verifico il tempo

necessario per raggiungere la fase esponenziale di amplificazione.

FRET: trasferimento di energia dovuto alla rinonanza della fluorescienza, quando noi

mettiamo 2 coloranti, una fluoresceina a un set di normali coloranti in aggiunta a dei

cosiddetti quencer e li mettiamo molto vicini per es. legati a un oligo solo, quando viene

eccitato questo dal laser noi non vediamo la luce perchè la luca viene persa come

trasferimento di energia al quencer, che significa stoppatore stoppa la reazione assorbe lui

l'energia che viene emessa dal colorante per cui quando sono troppo vicini abbiamo

questo effetto che si chiama fret, il sistema taqman si basa su un sistema fret come molti

sistemi di detectaggio di snp es. invader, il sistema taqman è una taq che ha un'azione

esonucleasica oltre che una endonucleasica per cui quandi il dna polimerasi incontra la

probe taqman che annila contro il transgenico abbiamo un'attività esonucleasica che libera

il quencer dal reporter e abbiamo un'emissione di colore che è proporzionale a quanto

reporter è rilasciato e a quanta attività esonucleasica abbiamo; abbiamo bisogno di

templati, in questo caso di curve standard a concentrazione nota di transgenico per

comparare la nostra pcr real time contro lo standard.

Questo tipo di pcr quantitativa per il detectaggio di ogm, può essere fatto anche per

verificare quale ingrediente ci sia all'interno di un preparato alimentare per es. se abbiamo

farina di mais all'interno di un pane dichiarato farina di frumanto; facendo una pcr

quantitativa possiamo verificare che c'è un tot di farina di mais dentro al prodotto

alimentare con un controllo positivo e per i falsi negativi es. per la zeina; quindi queste

sono altre possibilità. Il gene ocip ha un'alta sensibilità 250 copie di amplificato dentro al

prodotto di pcr per detectare la presenza do ogm, e poi l'altro vantaggio è che noi

possiamo mettere tutti i promotori, geni strutturali e terminatori all'interno dello stesso chip

(cip), si gasa su 2 pcr moltiple, uno basato su 10 primer per amplificare 5 sequenze e un

altro primer per amplificare un altro gruppo di sequenze, l'unione dei 2 amplificati e

l'ibridazione contro l'array.

PARTE RELATIVA AGLI OGM: facciamo un'introduzione: quali ogm facciamo nelle

colture erbacee? E cosa facciamo prima con le colture erbacee? Lo scopo delle

coltivazioni erbacee è quello di produrre alimenti, materie prime per l'industria, sfruttiamo

la produzione di tonnellate ettaro di biomassa per uso alimentare e industriale che non è

quasi sempre food, anche se in certi paesi occidentali potrebbe esserci spazio anche per

coltivazioni non food es. girasole per produzione di biodisel dall'olio, questa è

l'applicazione più seria non food oltre alla produzione di amido per industrie cartarie,

tessile anzichè quella alimentare, però in massima parte le coltivazioni erbacee le

mettiamo per produrre materie prime, quindi gli obiettivi biotecnologici non possono

prescindere da questo: dobbiamo mettere un qualcosa o che serve alla pianta per

produrre la biomassa utile o possiamo sfruttare questo per dare all'alimento un qualcosa in

più o in meglio. Gli obiettivi delle piante erbacee sono gli stessi obiettivi del briding, questi

obiettivi portano a un miglioramento della qualità della vita e dell'ambiente, per fare una

coltura più sostenibile, l'obiettivo dell'ogm è migliorare la vita in senso lato. Il biotecnologo

vegetale agrario sta tra la società e le colture erbacee, le biotecnologie possono

raccogliere tanti problemi che provengono dal comparto economico e dal consumatore,

deve anche raccogliere le problematiche che provengono dalle colture erbacee.

Raccogliendo anche conoscenze di base dalle biologie molecolare il biotecnologo

vegetale sceglie il gene per sapere quale carattere andare a introdurre ed è importante la

strategia, se sia meglio usare un aumente dell'espressione genica piuttosto che un

silenziamento, e in questo punto entra un pò la creatività, limitata dal fatto che non tutto

quello che è noto può essere usato senza pagarne i diritti.

Per quanto riguarda i problemi biologici, gli obiettivi della coltura sono diversi a seconda si

parli di riso o di mais o di frumento o di pomodoro, le multinazionali non hanno tenuto in

conto l'esigenza delle colture o della società ma soltanto a una specifica esigenza: il

problema del diserbo non è maggiore della soia! Per il cotone bt il problema maggiore

erano gli insetti, hanno optato per una scelta di convenienza pensando che essendo i

monopolisti possono imporre questo.

Il riso: il suo problema principale potrebbe essere quello del diserbo con la competizione

degli infestanti e potrebbe anche essere con la resistenza al brusone, poi ne vengono altri

è inutile che facciamo un riso bt, il riso ha uno scarso valore energetico in termini di

amimoacidi essenziali, inoltre la produzione di resistenza al freddo; il mais: il suo maggior

problema è il controllo degli infestanti, i transgenici con la resistenza agli erbicidi hanno

risolto un grave problema nel mais, per es. la resistenza alla piralide non è un grave

problema in Europa, le ditte biotecnologiche hanno pensato principalmente al mercato

degli stati uniti, l'altro problema del mas potrebbe essere problemi di insilaggio, di

fermentazione legati alla presenza di funghi e micotossine.

In Italia ci sono pochissime ditte biotecnologiche, la nazione che ha più ditte è la Germania

seguono Inghilterra e Francia, nonostante gli ultimi articoli il biotec in Italia non è passato,

sta passando lentamente più lentamente rispetto agli altri paesi europei, alcune regioni in

Italia si dichiareranno ogm free anche se l'unione europea ha autorizzato la coltivazione di

ogm: ci sono problemi sociali e politici!

Metodi di trasformazione : ci sono diversi metodi di trasformazione, nelle piante si lavora

bene per la proprietà della totipotenza delle cellule vegetali, possiamo quindi recuperare

individui completi da singole cellule, fatto proprio dei sistemi vegetali; tra tutti i sistemi

abbiamo ad es. l'uso di vettori virali, trasferimento diretto in pianta, di fatto questi sistemi

diretti funzionano soltanto in arabidopsis però sempre mediati da agrobacterium, invece il

sistema diretto del dna nudo funziona solo con i protoplasti che sono cellule vegetali

private della parete, quindi tramite elettroporazione generalmente o shok osmotico noi

riusciamo a fare trasformazione dei protoplasti, questo si una per fare trasformazione

transiente cioè una trasformazione limitata nel tempo fino a quando il sistema protoplasto

dura, non muore in questo modo vediamo che il transgene funziona. Per le trasformazione

di piante agrarie i sistemi utilizzati sono 2: agrobacteriunm e biolistico (microproiettile);

l'agrobacterium è un sistema di integrazione nucleare del transgene e questo è un pò un

limite nel senso che il sistema agrobacterium per come funziona trasferisce il transgene

nel nucluo, quindi abbiamo un aspressione nucleare del gene e quindi non possiamo fare

trasformazione diretta per es. cloroplastico nel batterio dobbiamo farla con sistemi di tipo

microproiettile; l'agrobacterium trasferisce direttamente al transgene al nucleo e questo

può essere una limitazione, il sistema agrobacterium si basa sulla struttura del plasmide TI

e il dna viena passato attraverso diversi step: uno step è quello della colonizzazione

batterica delle cellule vegetali, l'induzione del sistema di virulenza batterica da parte di

alcuni fattori come temperatura, ph e composti fenilici come l'acetosiringone, l'induzione

dei primi gene vir a e poi di conseguenza tutto il regulore dei geni vir vengono indotti che

sono appunti contenuti nel plasmide TI, c'è un'iniziale coinvolgimento anche del

cromosoma batterico però questo funziona soltanto col plasmide e il regulone vir consente

il trasferimento del dna esogeno dento alla pianta. I composti fenolici più importanti sono

acetosiringone e idrossiacetosiringone che sono essenziali per indurre l'inizio del

trasferimento genico nell'integrazione del tdna nella cellula vegetale, viene generato un

tdna transfer compens (vedi figura) e quindi ogni dna che venga messo tra i 2 border del

tdna è trasferito alla pianta, come si trasferisce il tdna tra i due border? Si trasferisce come

singolo filamento e viene riconosciuto nel trasmoplasma vegetale come complesso che

deve essere diretto al nucleo perchè eè legato a una proteina di un gene vir, questa

proteina viene diretta al nucleo e una volta diretto al nucleo viene integrato quarem con

ricombinazione illegittima si dice, dentro al genoma nucleare. Questa è la figura

abbastanza dettagliata dell schema di funzionamento dell'agrobacterium: abbiamo

l'idrossiacetosiringone o acetosiringone o altri tipi di composti fenolici che vengono

riconosciuti da dei recettori, qua è l'unico momento in cui il cromosoma batterico ci mette

del suo cioè c'è un complesso proteico che è virA assieme a questa proteina del gene

CHVE, quindi un cpmlesso tra membrana, l'acetosiringone induce l'autoforforilazione del

bene virA, quindi è uno proteina dimerica, il gene vurA induce e fosforila il gene virG che è

un regolatore dell'operone vir e del plasmide TI, quindi virA è un polipeptide di membrana,

virG è un regolatore della trascrizione degli altri vir di cui vir1 e virg1 sono a loro volta

regolatori della excisione tramite legame con vir2 del singol strend compreso nel tdna tra

left o border e l'et to border, una volta exciso tramite vird1 e virc1 e degato alla proteina

vird2 il pezzo di dna, il nostro transgene oppure quello che sono i geni per le opine o le

auxine nel wild tipe (quelli che inducono il tumore nella pianta e fanno produrrre le opine

che sono le fonti di carbonio e azoto per il batterio), una volta fatto questo probabilmente

la teoria più accreditata è che questo complesso virD2 e singol strend tdna non passi così

come dna nudo, ma passi in un sendwuich di proteine con peptidi del virE2, si formerebbe

un sandwich che proterrebbe per es. dall'attività nucleasica il singol strend tdna. Altri beni

vir sono geni virB che sono coplessi proteici tra membrana che riconoscono virD2 e

conentono il passaggio, questo non è chiaro se venga fatto questo sandwich o meno

perchè l'assenza di virE2 limita la virulenza però non la blocca completamente, comunque

viene riconosciuto come viene riconosciuto il virD2 e tra i gene virD che sono proteine di

canale tra membrana e fanno passare il complesso del tdna, ci sono dei recettori che

riconoscono la targhettizazione di queste proteine al nucleo e quindi sono quelle che

veicolano le proteine nucleari al nucleo, poi all'interno del nucleo come venga eliminato

dirD non è copletamente chiaro, quello che è chiaro è che abbia una ricombinazione

all'interno del genoma vegetale, generalmente nei siti 5' dei geni quindi ha delle regioni

preferenziali in composizione di base nucleotidiche questa ricombinazione per poi avere

nel wild tipe una produzione di auxine che inducono una proliferazione delle cellule, s

autoreplica in questa maniera, il procewsso gli costa fatica all'agrobacterium, questo è il

modello più completo. Il sistema è cieco per quanto concerne cosa è contenuto nel tdna,

qualsiasi sequenza che noi mettiamo all'interno del left o right border viene inserita,

ovviamente è stato necessario eliminare le limitazioni del plasmide TI, sono geni

ridondanti, produzione di auxine, citochinine, opine non servono quindi sono stati eliminati

questi gene, inoltre il plasmide TI non si replica in Escherichia Coli per cui è necessari

inserire un'origine di replicazione in Escherichia Coli altrimenti non avremmo la

replicazione del plasmide TI all'interno di Escherichia Coli.

Cose necessarie: un marker di selezione per selezionare le colonie trasformate, un'origine

di replicazione in Escherichia Coli e un polilinker con diversi siti di restrizione dentro al

tdna per inserire il nostro gene; oggi oltre al polilinker è possibile utilizzare altri sistemi per

inserire i geni net tdna e il sistema si chiama gate weit che utilizza una ricombinazione

fagica, quindi diversi plasmidi TI sono stati prodotti e sono liberi in commercio e con diversi

sistemi: il sistema cointegrato e il sistema binario, il sistema cointegrato comprende l'uso

di tre plasmidi, oggi non è più usato, il sistema usato oggi in agrobacterium è il sitema

binario in cui abbiamo 2 plasmidi per replicazione in Coli, per replicazione in

agrobacterium e poi inseriamo il nostro gene in Coli, ci manteniamo la nostra libreria in

Coli poi utilizziamo Coli per replicare il transgene poi passiamo questo in un plasmide

binario, può coabitare quindi sia in Coli che in agrobacterium, noi trasformiamo questo con

coniugazione batteriaca in agrobacterium poi questo viene trasferito alla piante con

infezione batterica dei tessuti vegetali, nata così come tecnologia disponibile per tutti

inventata da max plant, diverse parti del sistema oggi sono patentate. Anche il sistema

cointegrato si chiamava disarmato per il fatto che non ci sono più i geni che inducono

tumori, è un lasmide che va bene sia in agrobacterium che in coli, abbiamo il nostro gene

di interesse con il promotore e il terminatore, poi abbiamo 2 origini di replicazione uno per

la replicazione di agrobacterium e uno per escherichia coli per questo motivo è binario, ha

bisogno di un vettore helper che viene mantenuto in agrobacterium, in coli ci teniamo il

plasmide con cui abbiamo inserito il nostro gene poi dentro agrobacterium abbiamo

presente il plasmile helper in cui abbiamo i geni vir che consentono di trasferire il

complesso virD2, quindi i plasmidi sono 2, ma si chiama binario perchè questi plasmidi

sono disegnati per essere replicati nei 2 batteri: o per coniugazione o per replicazione

plasmidica e trasferimento diretto in agrobacterium che porta l'helper, il vettore binario

inserito in agrobacterium e poi abbiamo una cocoltivazione di agrobacterium con le cellule

vegetali che sono selezionate in condizioni appropriate. Ci sono anche nuovi vettori binari

come il twltacbibac che servono a inserire larghi frammenti di dna vegetale dentro a un

organismo vegetale, significa che per fare il clonaggio per posizione facciamo un

mappaggio fine cioè facciamo una mappa genetica fine poi selezioniamo alcuni cloni bac

che sono bacterial altificial cromosons che in genere hanno una dimensione media di

150kilobasi, se in un sistema che funziona bene la trasformazione, vogliamo andare a

vedere quali dei 6 bac che sono in quella regione genomica contengono il gene di interre,

possiamo fare diversi costrutti in questi vettori binari bibac trasformare con tutto quello che

sta in queste 150 kilobasi e vedere se complementiamo un fenotipo, poi restringiamo

l'analisi a uno dei cloni, vettori bibac che hanno un'efficienza del 0.12% di trasformazione

ed è relativamente bassa, più recente con una efficienza di trasformazione 3.4% e

consentono di contenere fino a 80 kilobasi twltac che sono un'evoluzione del vettore bac.

Molto è dovuto alla lunghezza e alla capacità di mantenere sia in coli che in agrobacterium

un'origine di replicazione questi vettori binari molto grandi; poi c'è un altro sistema che non

usa il piolilinker che è il sistema gate weit, prodotto in vitro per agrobacterium, si basa su

un segmento dei gene di inresse non attraverso restrizione e ligazione, ma si basa su 2 siti

di ricombinazione diversi che sono siti di riombinazione fagica che si chiamano attr1 e

attr2, siti di ricombinazione del fago lambda, utilizzato il fago lambda per integrarsi nei

genomi ospiti, sono stati scoperti che questi siti funzionano in modo indipendente cioè ne

inseriamo 2 per dare un orientamento a pezzo che vogliamo inserire, non si ricombinerà,

noi utilizziamo per il frammento che noi inseriamo la ligazione con r1 e r2, si orienterà nella

direzione voluta quindi sempre da r1 verso r2, sono 2 siti di ricombinazione diversi che

vengono inseriti in un set di vettori binari; il sistema gate weit ti vende un set di vettori

binari già pronti in cui tu devi sono aggiungere il frammento e il vettore binario e un enzima

che si chiama clonasi, una ricombinasi che facilita la ricombinazione nel vettore binario,

poi recupero il plasmide faccio la trasformazione in coli lo replico e poi faccio la

trasformazione in agrobacterium e va avanti come un normale sistema; la cosa buona è

che è facilissimo integrare tra r1 e r2 il mio frammento e poi li vendono per diversi scopo

ad es. vendono vettori binari che attraverso il redborder hanno cassette per fare

overespressione o tanti sensi di un gene es. un promotore 35S già inseito, c'è un marker

di selezione c'è un gene reporter; ci sono diverse possibilità di scelta tra marker si

selezione, i gene reporter. Per sostituire un promotore, ho una regione a 5' di un gene

dove c'è il tata box prima del codone di inizio e suppongo che quella sia la regione

promotrice, suppongo che quel gene se è indotto da patogeni funzioni ogni volt che entra

un patogeno in una pianta, faccio diversi tagli per vedere quale è l'unità minima che

funziona, quando non funziona più riusciamo a capire se il promotore era il pezzo piccolo,

quello lungo... per vedere se questi inducono qualche gene li metto a molte di un gene

reporter si usava prima gus, facendo un saggio gus senza promotore l'unica cosa che

metto è il mio e poi magari metto la pianta con il patogeno, se facendo un saggio gus sulle

foglie e diventano blu significa che è stato indotto il gene gus. Gus però ha un saggio

distruttivo per cui una volta che ho fatto un saggio gus su una foglia la butto via, mentre

con gene infuorescense protein questo è un saggio che posso fare in vivo, emette luce

fluorescente verde che posso vedere con un microscopio a fluorescienza. La cassetta

serve per tessuti di promotore, quindi le diverse cassette gate weit sono tutti vettori binari

diversi.

Sostanzialmente è un siatema che viene mediato da un sistema biologico, i limiti maggiori

di agrobacterium sono possedere una pianta che possa essere infettata da agrobacterium

e possedere poi in quella specie un sistema di rigenerazione delle piante che sono malate,

questo fino a poco tempo fa non era posibile nei cereali, cioè i cereali non potevano

essere trasformati con afrobacterium dovevano essere trasformati solo con microproiettile,

nei primi ogm commerciali fatti per il mais ad es. sono tutti fatti con microproiettili, però per

diversi cereali e recentemente anche per l'orzo però sicuramente frumento, riso e mais è

possibile trasformarli efficacemente con agrobacterium (solo da alcuni anni, perchè hanno

trovato ceppi di agrobacterium che sono i grado di infettare alcune monocotiletoni). Dal 98

in avanti sono stati introdotti transgenici di cereali, di monocotiledono con agrobacterium,

l'orzo lad 2003-2004, l'orzo è un sistema più complicato perchè ha dei grossi problemi di

rigenerazione in vitro, quindi i limiti sono di efficienza del sistema in vitro nella

rigenerazione di transgenici, casi limiti sono l'inserimento di geni reporter e l'inserimento di

marker di selezione: ci sono geni che possono funzionare sia da marker di selezione sia

da geni peropter quindi non è detto che noi dobbiamo obbligatoriamente inserire geni

reporter, ma quesi sempre inseriamo marker di selezione e questo è un limite, lo è anche

per il biolistico.

Geni reporter significa che consente di fare una sede avvenuta dalla trasformazione,

invece i marker di selezione ti consente di recuparare i transgenici rispetto a quelli che non

lo sono; alcuni funzionano sia da reporter che da marker di selezione.

I reporter più esati nelle piante sono il sistema gus, il gene per la luciferasi e green

fluorescens protein che sta sostituendo i primi 2 perchè ha i vantaggi dell'utilizzo in vivo e

poi anche perchè è molto stabile all'inattivazione da calore e può funzionare con diverse

fusioni con altre proteine sia che la metta all'n terminale o al c terminale; la produzione di

luce fluorescente funziona sempre, oltre al fato che funziona in vivo e che non sia un

marker invasivo quindi è molto vantaggioso; si possono addirittura se prendo dei

fotogrammi a tempi determinati si possono fare dei filmini di espressione di un gene

sfruttando le fotografie, ti fanno vedere dei filmini di espresione di un gene dentro un

organello poi viene trasferito.

I promotori possono essere costitutivi o tessuto o condizione specifica o organo tessuto

specifica, per es. per i tuberi il promotore più usato è quello della patatina che è un

promotore delle proteina di riserva dei tuberi di patata, per i semi dei cereali usiamo un

promotore dell'alfa amilasi o il promotore delle altre proteine di riserva; promotori costitutivi

di overespressione li abbiamo per i cereali, per le monocotiledoni in generale il più

utilizzato è il promotore dell'ubiquitina, in mais il più usato per le dicotiledoni il 35S.

In ababidospis si può fare trasformazione in planta, a partire dagli ultimi anni 80 dall'idea si

2 studiosi Fredman e Mark, che prima hanno provato prima coi semi, poi con l'immersione

dei fiori immaturi dentro a una sospensione di cellule agrobacterie, il motivo non è chiaro,

però agrobacterium riesce a infettare, gli ovuli che vengono a contatto con agrobacterium

vengono trasformati e si chiama sistema in planta, prima si immergevano le infiorescenze

di fiori immaturi dentro alla sospensione di agrobacterium applicando il vuoto, oggi si

possono mettere delle goccie sui fiorellini immaturi per più volte delle goccie di

sospensione di agrobacterium su quei fiori, e si raccoglie il seme; molto semplice, il

tessuto targhet sono gli ovuli.

Le alternative che oggi abbiamo per produrre transgenici nelle piante erbacee come piante

intere, coltivabili sono sostanzialmente 2, nel senso che ne avremmo un terzo che è quello

di trasformazione di protoplasti peroò serve solo per fare esperimenti di trasformazione

transiente, per fare trasformazione genetrica abbiamo 2 vie: tradizionalmente si è inteso

che questa via nell'agrabacterium è la via delle dicotiledoni e il sistema biolistico è quello

delle monocotiledoni però sempre più monocotiledoni è possibile oggi trasformarle con il

sistema agrobacterium in quanto il sistema agrobacterium ha comunque dei vantaggi

rispetto al biolistico: innanzitutto il costo è più limitato quindi la tecnologia è più semplice,

addirittura se lo facciamo in vivo non è necessario neanche il passaggio nella coltura in

vitro, ho soltanto la selezione dei semi e il terreno selettivo quindi costi minori, poi

l'efficienza di fatto è più elevata perchè potrebbe anche essere modesta però quello che è

integrato però l'efficienza finale di recuperare un individuo completamente transgenico si

abbassa e rende l'efficienza finale più bassa dell'agrobacterium, poi crea altri problemi:

sono maggiori i casi di silenziamento genico con il sistema biolistico che non con il sistema

di agrobacterium, poi il numero di copie del gene inserito è più elevato che in

agrobacterium, ci sono casi di inserimenti multipli anche in agrobacterium però

generalmente il n. di copie inserite del gene desiderato è modesto e quindi noi possiamo

seezionarci il transgenico che abbia una copia soltanto del gene, l'unico grosso vantaggio

del sistema biolistico è che noi possiamo usarlo per targhettizzare l'inserimento dei geni

nel genoma cloroplastico, il vantaggio residuo è che fino a che non si mette a punto un

sistema di agrobacterium per ma monocotiledone resta assodato che si può usare solo il

sistema biolistico.

SISTEMA BIOLISTICO: abbiamo delle microparticelle dette anche microcarier che

vengono rivestite di dna del gene che noi vogliamo inserire, queste vengono introdotte

denntro le cellule e in qualche cellula di questa avviene l'integrazione del transgene nel

genoma e alla fine noi possiamo far proliferare un callo su un terreno selettivo, quindi

facciamo un passaggio in vitra anche qua, possiamo sparare su foglia, radici, sul tessuto

che vogliamo però poi se vogliamo selezionare i transgenici dobbiamo usare o un sistema

con un gene marker o un sistema senza gene marker comunque dobbiamo selezionarci i

veri transgenici quindi tradizionalmente si va a fare un callo su terreno selettivo che

contiene l'antibiotico o l'erbicida e si rigenera la pianta intera, l'unico callo che cresce è

quello transgenico, la macchina più venduta è quella della Viorad per il biolistico che si

compone da una camera dove avviene la trasformazione dove ci sono 2 operazioni dentro

a questa camera, una è l'effettuazione del vuoto perchè lo sparo viene effettuato sotto

vuoto quindi abbiamo una pompa a vuoto che estrae l'aria e poi abbiamo il manometro

che misura quanto vuoto è stato fatto nella camera e poi abbiamo un apparato di sparo

che una volta veniva fatto con una vera cartuccia con polvere da sparo, oggi viene fatta

con una pressione improvvisa di elio, i componenti più importanti stanno dentro alla

camera di sparo coiè il disco di rottura il supporto delle particelle, il disco di stop e il posto

dove sta il campione. Lo sparo è dato dalla rottura del disco di rottura cioè noi aumentiamo

la pressione dell'elio in questa camera che consente di arrivare ad alte pressioni dopo che

abbiamo fatto il vouto, questa camera ha un disco che si rompe a una pressione

predefinita quindi noi possiamo calibrare l'intensità dello sparo calibrando il tipo di disco di

rottura che noi scegliamo, se lo scegliamo molto resistente si sparerà a pressioni più alte

quindi lo sparo sarà più forte, se vogliamo fare uno sparo più modbido usiamo dischi di

rottura che si rompono a pressioni più basse poi sostanzialmente abbiamo un disco di volo

do oro o di tungsteno, quindi questo pallini di metallo con i quali è stato fatto aderire il dna,

vola contro uno stop e poi il microcarier lasciano il disco di volo e si integrano nel tessuto

vegetale quindi queste microcarier sono supportate su un disco che fa il primo pezzo di

volo, quali sono i parametri da scegliere? Sono la pressione dell'elio da dare quindi il disco

di rottura appropriato per quella specie e per quel tessuto anche. poi quanto vouto

dobbiamo fare nella camera, la distanza tra il disco di rottura e il microcarier cioè quello

che deve volare, la distanza di volo del macrocarier dal punto di partenza al punto di stop

e la distanza tra il punto di stop e il tessuto targhet, ovviamente più è distante più l'impatto

sarà mordido, più è vicino l'impatto sarà violento. Come si fa a preparere le particelle del

microcarier? Si sospendono le particelle d'oro con etanolo voltexando poi se ne preleva la

qnt necessaria per il numero di eventi che dobbiamo produrre, si centrifuga per recuperare

l'oro, viene risospeso in acqua sterile, tutto deve essere fatto in condizioni di assoluta

sterilità, si aggiungono il dna con l'inserto da far integrare separato dal plasmide, cloruro di

calcio e spermidina e poi a 4° C avviene questa miscelazione abbastanza energica che

serve a fare aderire il dna al microcarier e l'adesione è favorita sia dal cloruro di calcio che

dalla sperminidina; poi le particelle si lacano con etanolo e a questo punto prepariamo il

materiale di sparo: i macrocarier sono dei dischi di metallo in cui viene inserito un

dischettino di plastica sul quale viene sparso il microcarier in soluzione, in fase liquida. Poi

prepariamo il materiale vegetale: abbiamo delle piante cresciute in sterilità, non sono

generalmente piante cresciute in vovo, vengono recuperati gli espianti generalmente pezzi

di foglia o anche antere oppure degli embrioni maturi; e poi prepariamo sempre in sterilità

il ruttur disk e lo stopping cren, il disco che si rompe è sempre di plastica lo stopping scrin

invece è una rete metallica, si inserisce il disco di rottura avvitandolo dove arriva il

beccuccio dell'elio e si posiziona lo stopping screen, poi si posiziona il marcocarier sopra

lo stopping screen; si mette il tessuto, si crea il vuoto, si spara e possiilmente si centra e

poi si procede con le successive fasi che sono = anche per l'agrobacterium, sono

selezione delle linee trasformate con terreno selettivo, rigenerazione delle piante intere e

trapianto in serra; non serve che sia un plasmide binario.

Per la preparazione di embrioni immaturi ad es. in orzo e in frumento, si separano dal

seme gli embrioni immaturi vengono pretrattati osmoticamente con sostanze come il

mannitolo e il sorbitolo, poi vengono sparati e rilevati con un saggio gus; una fase

importante è quella della verifica del numero di copie dell'integrazione del transgene del

dna che può essere fatta con pcr o con rflp usando una metodica tipica dei marcatori

molecolari. Una volta che abbiamo ottenuto la piantina intera per verificare che non abbia

perso il transgene nella fase di rigenerazione viene pennellata con del basta, dell'erbicida

con lo stesso erbicida che abbiamo usato con il terreno selettivo, viene pennellato una

parte di una foglia e se quella parte della foglie ingiallisce significa che non è transgenica

la pianta, era una chimara c'è stato un qualche problema di rigenerazione, se invece dopo

la spennellata è sempre resistente abbiamo ottenuto la pianta transgenica.

Studi che si possono fare con il biolistico: si possono fare anche esperimenti di

espressione transiente in planta, cioè una pianta cresciuta in vitro che viene inserita in una

camera di sparo, una foglia viene messa sotto lo stopping screen per essere trasformata,

se ed es. stiamo inserendo un gene di resistenza a un patogeno possiamo fare

un'inserzione del gene di resistenza anche in maniera chimerica su 2 o 3 foglie della

stessa pianta o su più piante, quindi verifichiamo poi dopo che ci sia un saggio gus o un

green fluorescens protein, comunque un saggio di fluorescienza per verificare che gli spari

sono avvenuti in modo regolare, poi sulle altre foglie trasformate possiamo spruzzare il

patogeno: se il gene funziona quella foglia sarà più libera da patogeno rispetto alle altre

foglie. Poi possiamo fare studi di transattivazione con il biolistico: dobbiamo vedere per es.

se questo gene che è un fattore di trascrizione che induce o reprime la trascrizione di un

altro gene blt4.9 funziona realmente come abbiamo ipotizzato, cioè come regolatore della

trascrizione cioè se questa proteina si leghi o meno a questo promotore: noi prendiamo il

promotore lo leghiamo a un reporter e facciamo un costrutto reporter e quindi facciamo

una cotrasformazione del biolistico per cui se questo è realmente un induttore di questo

promotore dobbiamo avere un saggio gus positivo altrimenti non mettendoci un 35S

questo reporter non si esprime perchè abbiamo messo un promotore inducibile (sono studi

di transattivazione); il nostro obiettivo è fare un ogm che contenga un regolatore della

trascrizione però dobbiamo prima vedere se funziona e per vedere se funziona dobbiamo

o magari portarlo su un'altra specie o su un sistema controllato in cui abbiamo solo questi

2 attori, possiamo con la green fluoresciens protein fare degli studi di localizzazione

subcellulare di proteine, possiamo vedere se non lo sappiamo facendo un ogm dove il

transgene si va ad esprimere per es. facendo un transgenico di quella pianta inattivo cioè

di quella specie col suo promotore, lo rimettiamo in quella specie e poi vediamo dove va a

compartimentarsi la proteina perchè abbiamo legato al promotore di questo gene anche

un gene reporter oppure facciamo diversi costrutti del reporter della trasformazione con

diversi pezzi del 5' UTR sempre più lunghi per vedere quale di questi sostanzialmente

funzioni per l'induzione dell'attività del reporter, rispetto a un promotore costitutivo.

TRANSGENICI MARKER FREE: rifacciamo la cascata di produzione di transgenico:

abbiamo una selezione di una pianta che è quella targhet della trasformazione, l'evento di

trasformazione, dobbiamo crescere i trasformati in maniera non chimerica selezionare

questi trasformati desiderati e rigenerarli, propagare le piantine, fare dei test di laboratorio

di verifica e fare dei test di campo sia di verifica che di performance per arrivare al brevetto

e al mercato; bisogna baipassare per quanto possibile dei limiti: possono essere dei limiti

tecnici che dei limiti di immagine, il fatto di dover inserire il marker di selezione ed

eventualmente il reporter nel transgene e per ognuno di questi dobbiamo ottenere una

autorizzazione all'inserimento dell'ambiente, un altro limite grande è l'efficienza del

sistema in vitro; sostanzialmente quindi noi abbiamo degli elementi indispensabili e degli

elementi dispensabili per avere la pianta migliorata, è sia un limite tecnico, ma anche

applicativo commerciale nel senso che noi dobbiamo spendere anche per questi elementi

accessori. Assolutamente indispensabili abbiamo il transgene e gli elementi regolativi del

transgene, dispensabili abbiamo il selecteble marker, i reporter, gli elementi regolativi del

selectable marker e del reporter e le sequenze ancillari per es. il tdna border che sono

sequenze ancillari che si inseriscono nel dna vegetale; come fare per avitare l'inserimento

più importante di questi elementi dispensable? I selectable marker, cioè i marker di

selezione del tessuto delle cellule transgeniche sono essenzialmente di 2 tipi: geni per

resistenza ad antibiotici e geni per resistenza ad erbicidi; questi sono i più contestati tra

tutte le sequenze che noi inseriamo tra gli ogm, per la fine del 2004, l'unione europea ha

bandito l'uso di transgenici che portino resistenze agli antibiotici di antibiotici ancora

clinicamente usati; nel transgenico noi non inseriamo un antibiotico, ma un gene di

resistenza a un antibiotico è tutto un altro discorso, l'unione europea quindi gradisce molto

che vengano eliminati i marker di selezione; al di là dell'opinione pubblica dobbiamo

eliminarli perchè sono dispensabili, sono un costo aggiuntivo e anche perchè utilizziamo

pochissimi promotori per consentire una loro espressione.

Per fare una pianta ogm marker free sono 4 le possibili vie: - non utilizzare il selectable

marker, - usare al posto dei selectable marker i cosiddetti scrinable markers, - fare i doppi

transgeni e separarli successivamenti, - inserire il selectable marker però dopo aver fatto

le selezione del callo transgenico exciderlo con diverse metodiche. Non usarli e possibile o

non è possibile? E' questione di numeri cioè noi trasformiano solo l'elemento

indispensabile e poi mi invento un qualche altro sistema per riuscire a selezionarli cioè

baipasso il problema della selezione dei transgenici inventandomi un modo per

selezionare questi transgenici, cosa posso fare? Per es. posso giocare sulle differenze di

crescita tra transgenici o wild tipe cioè se io vedo che il callo transgenico mi cresce più

velocemente di un callo normale posso colturarlo più volte e quindi quelli che non riescono

a stare al passo non ingrandiscono e seleziono i calli più grandi e poi faccio una verifica di

presenza o meno del transgene solo su questi calli più grandi e vedo se il mio callo

contiene il transgene o meno, oppure non ho nessuna possibilità di notare differenze di

crescita perchè quel transgene non mi conferisce nessuna fitness rispetto agli altri calli:

posso usare un sistema automatizzato di verifica di transgeni cioè posso mettere in piedi

un sistema di pcr con i balk cioè posso estrarre il dna in modo veloce ed economico da

tutte le mie piantine rigenerate e da tutti i miei calli, poi faccio dei balk di dna

isomolarimettendi insieme la stessa qnt di dna, poi amplifico questi balk con il transgene,

in uno di questi balk ci sarà il transgene quindi vado a separare quelli che sono transgenici

da quelli che non lo sono dentro a quella miscela è un modo qiìuesto anche per trovare

delle mutazioni, è una cosa molto costosa che potrebbe ripagare i costi di non dover usare

nessun altro sistema di excisione o di preparazione di costrutti complessi o di

segregazione, oppure altra strategia: gli scrinable marker: cioè passare da un concetto di

marker di selezione di tipo negativa dove io eliminano le piante che non crescono su un

erbicida a un sistema di selezione positiva cioè io scelgo le piante che riescono a crescere

su un terreno che è poi un principio di selezione dei lieviti o di tanti mutanti dei

microrganismi, inserisco nel costrutto dei geni che codificano per enzimi semplici che

consentono di usare un substrato particolare quindi lo stesso gene gus, gus è una

possibilità, sfruttare un reporter come uno scrinable marker, le piante che portano il

reporter sono quelle transgeniche, in questo senso il saggio gus essendo un saggio

distruttivo, il concetto di scrinable marker è che non faccio morire gli altri tessuti, ma

prendo quelli che crescono meglio o quelli che vedo meglio quindi sono più accettabili,

sarebbero più accettabili soprattutto se venissero dalla stessa specie, il difetto di questa

strategia è che nel lungo periodo la tecnologia di piante ogm si evolverà e diventerà

sempre più efficiente il sistema di tramformazione e poi perchè diventerà più efficiete il test

di verifica della transgenosi. Un'altra strategia possibile: separazione per segregazione: si

fa una cotrasformazione di tipi possibilmente diversi o due tdna nello stesso vettore

binario, o 2 vettorti binari nello stesso agrobacterium usato per trasformare o 2 ceppi

diversi del batterio ciascuno portante un vettore binario uno per i slectable marker e uno

con il tdna per il transgene che vogliamo, si usa abrobacterium perchè consente di inserire

mono copie delll'uno e dell'altro e generalmente è stato visto che è più facile avere eventi

indipendenti uno dall'altro in termini di distanza sul genoma, quindi nel sistema ideale io

riesco a ineserire una copia di selectable marker, una copia del mio transgene su 2

cromosomi diversi nella stessa piante, a questo punto faccio fiorire la pianta e le faccio

fare seme e poi nella progenie parte della progenie avrà il mio transgene e parte avrà il

selectable marker e parte per caso avrà tutti e 2, però seleziono solo quelle piante che

segregano cioè solo quelle piante che portano solo il transgene e non portano più il

selectable marker nella progenie di quella pianta, devo aspettare almeno una meiosi e

quuindi se dice separo per segregazione cioè elimino il selecteble marker senza dover

trovare migliaia di genotipi; time consuming può essere inteso come un momento di lavoro

necessaio per produrre o 2 tipi tdna nello stesso vettore o 2 vettori nello stesso

agrobacterium o fare trasformazione con 2 ceppi diversi e questo può comportare la spesa

di più energie e più tempo. Poi c'è un'obiezione vera che si adatterebbe male alle specie

arboree, con le specie erbacee va benissimo perchè non ci mette niente la pianta a fare

tanto seme, inoltre si adatta male a tuttio i casi di trasformazione cloroplastica nel senso

che viene sempre ereditato per via materna.

La quarta strategia per eliminare il selectable marker consiste nel fare selezione dei

trasformati in maniera normale e poi utilizzare un sistema di excisione del selectale marker

dopo, a opsteriori e i sistemi possibili di excisione sono 3: la ricombinazione sito specifica,

la trasposizione del selectable marker e la ricombinazione omologa; la ricombinazione sito

specifica è stata la prima ad essere scoperta ed è quella più studiata, il concetto è che

utilizza una ricombinasi che riconosca dei siti targhet e mi consenta di far saltare via il

pezzo che è compreso tra questi 2 siti targhet, quindi mi faccio un costrutto in cui metto il

marker di selezione coi suoi elementi regolativi tra i 2 siti r di attivatà di azione della


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in scienze e biotecnologie agroambientale
SSD:
A.A.: 2014-2015

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher marcorivi di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biotecnologie delle specie erbacee e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Modena e Reggio Emilia - Unimore o del prof Pecchioni Nicola.

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