Riassunto Biologia molecolare

RIASSUNTO BIOLOGIA MOLECOLARE

SCOPERTE IMPORTANTI:

•1856-1866= MENDEL scopre che esistono fattori ereditari che vengono trasferiti dalla pianta madre alla pianta figlia.

•1871= MIESCHER scopre la presenza di una sostanza nel nucleo delle cellule che lui chiama NUCLEINA.

•1902-1907= MORGAN scopre che l’informazione ereditaria è contenuta nei cromosomi.

•1944 = AVERY scopre che il DNA è responsabile dell’informazione genica. Il suo esperimento sconvolse la storia.

L’esperimento di Avery iniziò nel 1928 con Griffith.

Griffith vide che esistevano pneumococchi infettivi e pneumococchi non infettivi (perché non avevano la capsula e

quindi non erano virulenti).

Mise insieme i 2 tipi di pneumococchi, li lisò con il calore e inoculò questa miscela ai topi. Questi topi morirono di

polmonite, quindi concluse che ESISTE UN FATTORE TRASFORMANTE CAPACE DI PASSARE DA UNA CELLULA ALL’ALTRA

E DI TRASFORMARNE IL FENOTIPO.

Nel 1944 Avery capì qual’era il fattore trasformante, separando le varie componenti contenute in una cellula vide che

il fattore che uccideva i topi era contenuto negli acidi nucleici.

Negli acidi nucleici ci sapeva che c’era l’acido desossiribonucleico e l’acido ribonucleico, responsabili quindi

dell’ereditarietà.

•1949= CHARGAFF studiò la composizione dei nucleotidi.

•1953= WHATSON E CRICK comprendono la struttura reale del DNA.

LEGAME PEPTIDICO

Legame che avviene tra 2 o + amminoacidi.

Abbiamo una condensazione tra un GRUPPO AMMINICO e un GRUPPO CARBOSSILICO con la perdita di una molecola

d’acqua.

(NB: come sappiamo, infatti, ogni aa ha un’estremità amminoterminale e un’estremità carbossiterminale)

PROTEINE:

-l’unità di base delle proteine è l’AA

-i gruppi funzionali dell’aa sono gruppo carbossilico e gruppo

amminico

-STRUTTURA PRIMARIA=formata da una sequenza lineare di aa.

-STRUTTURA SECONDARIA=è formata dall’organizzazione nello spazio

della struttura primaria attraverso la formazione di legami H (che si

formano tra i gruppi COO- e NH3).

Ci sono 2 possibili strutture secondarie ( α-elica e foglietto-β).

-STRUTTURA TERZIARIA= è l’organizzazione nello spazio di più

strutture secondarie. Anch’essa è basata sulla presenza di legami H.

tutte le proteine devono avere almeno una struttura terziaria per poter essere funzionanti.

-STRUTTURA QUATERNARIA=è data dall’associazione di più sequenze amminoacidiche (dette subunità, ogni subunità è

una struttura terziaria). Non tutte le proteine hanno una struttura quaternaria.

α-elica: in questa struttura lo scheletro carbonioso si avvolge intorno ad un asse

immaginario. L’avvolgimento può essere destrogiro o levogiro.

foglietto-β: è una struttura appiattita. Lo scheletro carbonioso della catena prende

una forma a zig-zag. 1

STRUTTURA DEL DNA

Componenti dell’acido desossiribonucleico

COMPONENTE 1: DEOSSIRIBOSIO, zucchero a 5C senza l’ossidrile in 2’

COMPONENTE 2 : ACIDO FORSFORICO

COMPONENTE 3 : BASI AZOTATE (imp. Strutt)

E basi azotate sono costituite da purine e pirimidine. -le basi azotate hanno elettroni delocalizzati quindi si possono

scrivere le strutture di risonanza.

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NUCLEOSIDE: è una molecola formata da ZUCCHERO + BASE AZOTATA uniti mediante LEGAME GLICOSIDICO.

il legame glicosidico avviene tra:

-il C1 dello zucchero

-N1 pirimidina

-N9 purina

Si formeranno:

desossiadenosina, desossiguanosina, desossitimidina, desossicitidina.

NUCLEOTIDE: è in nucleoside con l’aggiunta di un FOSFATO. Abbiamo la presenza di un LEGAME FOSFODIESTEREO sul

C5 dello zucchero.

I nucleotidi possono essere: mono, di o trifosfato. Dato che le basi azotate hanno le strutture di

risonanza, esse possono avere un equilibrio tra le

forme tautomeriche. Queste forme tautomeriche,

però, può portare appaiamenti errati e quindi

mutazioni nel dna.

Nella CITOSINA si può avere la tautomeria ammino-

immimo.

Nella GUANINA si può avere la tautomeria cheto-

enolica. 2

fortunatamente l’equilibrio è fortemente spostato a sinistra

quindi è molto raro che avvenga.

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COME SI UNISCONO I NUSCLEOTIDI: I nucleotidi si uniscono tra loro grazie ad un LEGAME FOSFODIESTEREO che si

forma tra :

- L’OH in 3’ del nucleotide

- IL FOSFATO in 5’ del nucleotide

NB= la catena di DNA ha una polarità, cioè si scrive in direzione 5’-> 3’ che

sarebbe la direzione di sintesi del DNA

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WATSON E CRICK ebbero importanti intuizioni sulla

struttura tridimensionale del DNA:

•i 2 filamenti di DNA sono ANTIPARALLELI (cioè un

filamento va in direzione 5’->3’ e l’altro va in direzione 3’-

>5’)

•l’APPAIAMENTO DEI NUCLEOTIDI E’ COMPLEMENTARE (si

segue la regola di Chargaff, cioè, ogni Adenina si appaia

con una Timina (A=T) e ogni Guanina si appaia con una

Citosina (G=C), quindi una purina con una pirimidina così

l’ingombro sterico è lo stesso.

• le basi azitate (A=T) e (G=C) si appaiano attraverso

LEGAMI IDROGENO.

FORME DI DNA:

esistono 3 forme di DNA (A,B,Z).

La struttura ideale, più stabile, è la B

dove il DNA ha:

-un’ELICA DESTROGIRA

-FILAMENTI ANTIPARALLELI.

DENATURAZIONE DNA

Il DNA può essere denaturato con calore e pH estremi.

La rottura dei LEGAMI H tra le basi azotate causa la rottura della doppia elica con formazione di filamenti singoli.

(NB:i legami covalenti non vengono rotti). 3

Il DNA può essere RINATURATO:

-se i due filamenti non sono completamente separati, il processo sarà veloce e si svolge in una sola tappa.

-se i due filamenti sono totalmente separati, il processo è lento e bisogna aspettare che ci siano delle collisioni casuali

che creino un punto di unione provocando così l’appaiamento normale.

L’interazione tra le basi azotate impilate va a RIDURRE LA QUANTITA’ DI LUCE UV, questo è detto EFFETTO

IPOCROMO.

La denaturazione di un acido nucleico a doppia catena, invece, produce l’effetto opposto cioè aumenta l’assorbimento

di luce, questo è detto EFFETTO IPERCROMO.

Ogni specie di DNA ha una temperatura di denaturazione caratteristica detta PUNTO DI FUSIONE, il punto di fusione

dipende dalla % di basi C e G presenti. Maggiore è la %, più alto è il punto di fusione.

DIFFERENZE TRA DNA E RNA

queste sono le differenze fondamentali, poi ci sono anche differenze strutturali tra dna ed rna.

Diffenze strutturali:

• l’RNA nelle cellule è presente come SINGOLO FILAMENTO, si possono però formare STRUTTURE SECONDARIE e

TERZIARIE.

•Alcuni tratti di RNA sono AUTOCOMPLEMENTARI, quindi l’rna può ripiegarsi su se stesso formando strutture

chiamate STEM-LOOP (stelo-ansa). NB: a causa dell’OH in 2’ del ribosio, l’RNA non può

formare una doppia elica nella forma B.

Però si può in parte formare una doppia elica nella

forma A.

Differenza di stabilità:

sempre per la presenza dell’OH in 2’ del ribosio, l’RNA in condizioni basiche è molto instabile perché: 4

-L’OH si comporta da nucleofilo ed

assume una forte carica negativa.

-Attacca il fosfato e si forma un

intermedio ciclico.

-Si rompe il legame fosfodiesterico

(rimane un fosfato ciclico al 5’ legato ad

un nucleotide, ed un nucleotide privo di

fosfato al 3’).

Quindi in condizioni basiche l’RNA si

AUTODEGRADA senza il bisogno di una

ribonucleasi.

Il RIBOZIMA HAMMERHEAD ha un meccanismo simile, quindi taglia l’RNA grazie alla formazione di un fosfato ciclico.

È una ribonucleasi con una sequenza specifica, funziona in ambiente neutro grazie alla presenza di uno ione Mg2+ (lo

ione rende l’ossigeno nucleofilo favorendo l’attacco al fosfato, con formazione di fosfato ciclico).

GENOMA: tutte le cellule di organismi multicellulari contengono materiale genetico, cioè il GENOMA.

I CROMOSOMI sono le molecole più grandi di una cellula, sono molecole di acido nucleico che possono contenere

migliaia di geni.

Il GENE è una porzione di cromosoma che codifica per un singolo carattere o fenotipo.

DIFFERENZA TRA DNA DI CELLULE PROCARIOTE E DNA DI CELLULE EUCARIOTE:

•PROCARIOTI:

- DNA organizzato in una struttura detta NUCLEOIDE

- I CROMOSOMI possono essere circolari o lineari

Es. E.COLI ha un cromosoma costituito da una sola molecola circolare a doppia elica.

- I cromosomi sono sempre in copia singola (APLOIDI)

- Possono contenere DNA circolari indipendenti di piccole dimensioni chiamati PLASMIDI.

•EUCARIOTI:

- DNA contenuto nel nucleo.

- La maggior parte delle cell eucariote è DIPLOIDE (cromosomi in doppia copia)

- Esistono cell eucariote APOLIDI (lieviti o gameti)

- Esistono cell eucariote POLIPLOIDI. ORGANIZZAZIONE DNA NEGLI EUCARIOTI

Ogni cromosoma è composto da una singola molecola di

DNA a doppia elica, ma può risultare 10000 volte più corto

della lunghezza dell’elica stessa.

Abbiamo, infatti, un efficiente sistema di spiralizzazione dei

filamenti di DNA che comprende diversi livelli di

organizzazione:

1) CROMATINA: complesso costituito da DNA e proteine ad esso associate. Ha una lunghezza di 2 nm.

2)NUCLEOSOMA: complesso proteico costituito da un ottamero formato da 2 copie di ognuno dei 4 istoni (H2A, H2B,

H3, H4) attorno al quale si avvolgono 146 nucleotidi di DNA a doppio filamento (compiendo 1,75 giri). Il nucleosoma è

largo circa 11 nm.

3)FIBRA CROMATINICA: i nucleosomi adiacenti sono connessi da un corto segmento di DNA spaziatore (dna linker).

Nell’insieme la struttura sembra un filo di perle dal diametro di 30nm. 5

DNA CORE= DNA che avvolge il nucleosoma

DNA LINKER= DNA che connette un nucleosoma

all’altro

I nucleosomi assumono una forma a spirale detta

SOLENOIDE.

I solenoidi si organizzano intorno ad un’impalcatura

centrale formando delle anse. Questa impalcatura è

costituita principalmente da Topoisomerasi II (che

svolge la funzione di srotolamento del DNA evitando

problemi di superavvolgimento) e Proteine SMC (proteine di mantenimento della struttura del nucleosoma, che

servono a compattare ulteriormente il tutto).

ISTONI= sono proteine basiche ricche di Arginina e Lisina che con la loro carica positiva vanno a bilanciare le cariche

negative dei fosfati del DNA.

Gli istoni che fanno parte del nucleosoma sono: H2A. H2B, H3, H4 e l’istone H1 che lega il DNA LINKER.

Nell’ottamero istonico ogni istone è presente in doppia copia.

H2A e H2B formano 2 dimeri

H3 e H4 formano un tetramero.

Il primo ad associarsi al DNA è il tetramero, poi arrivano i due dimeri e si completa il nucleosoma, quindi abbiamo un

ASSEMBLAGGIO GERARCHICO.

-Le regioni più compatte sono dette ETEROCROMATICHE e sono meno accessibili.

-Le regioni meno compatte sono dette EUCROMATICHE e sono più accessibili.

Il passaggio da eterocromatina ad eucromatina e viceversa avviane tramite PROCESSI DI RIMODELLAMENTO, cioè

modifiche delle code amminoterminali degli istoni (viene aggiunto o eliminato un gruppo chimico).

DUPLICAZIONE DNA

Già con Watson e Crick si era capito che i filamenti antiparalleli erano alla base della duplicazione.

Nel 1956 con l’esperimento di MESELSON e STAHL si capì che la duplicazione è semiconservativa (potevano esserci 3

ipotesi: semiconservativa, conservativa e dispersiva).

quindi fu confermato che la duplicazione è semiconservativa, le altre ipotesi erano: 6

-SEMICONSERVATIVA: ciascuna delle doppie eliche figlie è composta da un filamento dalla doppia eliche di origine e

un filamento di nuova sintesi. Quindi ogni cellula figlia riceve metà della struttura parentale.

-CONSERVATIVA: i 2 filamenti originali rimangono insieme dopo essere serviti da stampo, quindi la cellula figlia figlia

avrà filamenti di nuova sintesi.

-DISPERSIVA: le cellule figlie conterranno doppie eliche in cui ogni filamento è una combinazione di DNA vecchio e

nuovo.

Prima della duplicazione delle cellule deve avvenire la duplicazione del DNA (nella fase S del ciclo cellulare).7

La duplicazione del DNA inizia nei siti di origine di replicazione ed è effettuata da una serie di enzimi.

La duplicazione è un processo: SEMICONSERVATIVO, SEMIDISCONTINUO e BIDIREZIONALE.

La bolla di replicazione si muove in entrambe le direzioni lungo il filamento per questo è bidirezionale.

Per la replicazione del DNA sono necessari 2 substrati:

1) NUCLEOSIDI TRIFOSFATO : molecole che presentano 3 gruppi fosforici legati al deossiribosio mediante un

legame ossidrilico al 5’. Per convenzione il gruppo

fosforico coinvolto direttamente nel legame è

indicato con la lettera α mentre quello intermedio e

quello più esterno sono denominati β e γ.

2) GIUNZIONE INNESCO : essa è uno STAMPO, cioè DNA a singolo filamento (ssDNA), che dirige l’aggiunta, alla nuova

catena di DNA in fase di sintesi, dei nucleosidi complementari; e di un innesco, o primer, il quale è un singolo

filamento di RNA, molto corto, che si ibrida con una regione specifica dello stampo e possiede all’estremità 3’ un

gruppo -OH libero.

Direzione di sintesi del DNA e la sua energia

Durante la sintesi del DNA, essendo essa semi conservativa, ciò che va incontro a modificazioni chimiche è unicamente

l’innesco il quale può essere allungato soltanto in direzione 5’—3’; questa caratteristica riguarda non solo il DNA ma

anche l’RNA.

Tale allungamento del filamento primer avviene mediante l’aggiunta di nuovi nucleotidi: il gruppo —OH libero del

primer dà vita ad una reazione SN2 legandosi al fosfato α del nucleoside trifosfato e formando con esso un legame

fosfodiesterico. Tale processo porta quindi alla perdita di un gruppo pirofosfato costituito dai fosfati β e γ. Il

nucleoside trifosfato corretto da aggiungere viene determinato dal filamento stampo mediante il principio di

complementarità.

L’aggiunta di un nucleotide al primer è un processo endoergonico in quanto la sua energia

libera è pari a ΔG = 3,5 kcal/mol. Da ciò si potrebbe quindi dedurre che tale reazione

risulta essere altamente sfavorita, ma non è così. Infatti energia libera in più viene fornita

dall’idrolisi del gruppo pirofosfato uscente in due gruppi fosforici mediante l’attività

catalitica dell’enzima pirofosfatasi. Il risultato netto dell’aggiunta di un nucleotide e

dell’idrolisi del pirofosfato è la rottura di due legami fosfato altamente energetici. Quindi la 7

sintesi del DNA è un processo

accoppiato, esoergonico, con un

energia libera pari a ΔG = — 7

kcal/mol e di conseguenza

irreversibile.

DNA Polimerasi

La sintesi del DNA è catalizzata da una classe di enzimi noti come DNA polimerasi. Il sito attivo di questi è

estremamente particolare in quanto è in grado di catalizzare l’aggiunta di tutti e quattro i deossinucleosidi trifosfato.

Tale flessibilità catalitica è dovuta alla pressoché identica geometria delle coppie di basi A:T e G:C.

Ciò permette alla DNA polimerasi non tanto di riconoscere i singoli nucleotidi che entrano nel suo sito attivo ma di

controllare la capacità di essi di formare il giusto appaiamento con il filamento stampo.

Infatti, soltanto quando il nucleotide da polimerizzare si appaia correttamente con il suo complementare, il gruppo

ossidrile al 3’ del primer e il fosfato α si trovano in una posizione ottimale per la formazione del legame

fosfodiesterico. Quando invece due basi non complementari vengono avvicinate si assiste ad una drastica diminuzione

della velocità di polimerizzazione (selezione cinetica) dovuta all’impossibilità di formare un legame

fosfodiesterico in quanto il fosfato α è troppo distante dall’OH in 3’ dello zucchero.

Struttura della DNA Polimerasi. la struttura somiglia ad una mano destra chiusa.

PALMO= formato da un foglietto beta e contiene gli elementi

principali del sito attivo. In particolare, esso presenta 2 ioni bivalenti

(come Mg2+ e Zn2+) uno dei quali riduce l’affinità dell’ OH-3’ del

primer per l’idrogeno, facendolo diventare O- (in modo da far

avvenire in modo corretto l’attacco nucleofilo al fosfato alfa).

L’altro metallo bivalente invece coordina le cariche negative dei

fosfati β e γ del nucleotide e stabilizza il pirofosfato uscente.

Inoltre, il palmo controlla il corretto appaiamento delle basi appena

sintetizzate. Questi legami non specificano la coppia di basi, ma si

formano solo se i nucleotidi sono appaiati correttamente.

Se non sono appaiati correttamente la dna polimerasi non può formare legami idrogeno, con conseguente

diminuzione della velocità di polimerizzazione e distacco del primer dal sito attivo.

DITA= le dita svolgono un ruolo catalitico grazie ad alcuni residui amminoacidici, inoltre, una volta avvenuto il corretto

appaiamento delle basi, le dita assumono una forma più compatta che favorisce la catalisi in quanto si avvicina il

nucleotide agli ioni bivalenti. Le dita entrano a contatto anche con la regione dello stampo piegando di circa 90° il

legame fosfodiestereo tra la prima e la seconda base dello stampo. In questo modo la prima base dello stampo che si

trova dopo l’innesco è esposta al sito attivo dell’enzima. 8

POLLICE= non è direttamente coinvolt