Documento completo per esame di Biologia molecolare med 3-4 UNIPD

Biologia molecolare Unipd 2015/2016

Corso di laurea in medicina e chirurgia

Di Gabriele Monetti

Genetica mendeliana

Il concetto di gene è stato messo a punto da Mendel nel 1865. La genetica è una scienza astratta e l’analisi è di tipo formale (le sue entità sono state prima intuite in modo astratto e solo successivamente in forma pratica). L’eredità prima di Mendel è da mescolamento mentre Mendel propone un’eredità particolata, ovvero un determinante genetico viene trasmesso da una generazione all’altra come una singola unità integra, senza mescolamento.

Tecniche utilizzate

Mendel parte da delle linee pure considerando un carattere alla volta (colore petali, forma seme, colore seme). Questo è un vantaggio perché le piante di pisello si riproducono secondo un processo di autofecondazione (manualmente tramite il taglio delle antere che vengono utilizzate poi per la fecondazione).

Esperimento

Mendel utilizzò una pianta che dava fiori viola e una che dava fiori bianchi. Fecondò la pianta bianca con le antere di quella viola; i semi risultanti una volta piantati formeranno la generazione F1 che darà tutti i fiori viola (lo stesso della generazione parentale). Mendel fece anche l’esperimento reciproco ossia utilizzò il polline della pianta con i fiori bianchi e fecondò quella dai fiori viola ottenendo lo stesso risultato. Mendel lasciò le piante F1 così ottenute autofecondarsi e osservò che le piante bianche che erano sparite nella generazione F1 ricomparivano sporadicamente, cercando il rapporto fra viola e bianco nella generazione F2 scoprì che era di 3:1.

Decise di ripetere l’esperimento considerando però l’aspetto dei semi e notò che la regola del 3:1 tornava sempre. Da questi esperimenti nascono i concetti di dominante e recessivo. Lasciando andare avanti le generazioni esso riottenne alcune piante che corrispondevano alle linee pure da cui era partito.

Considerando il colore del pisello osservò che in F3 alcune piante contenevano bacelli contenenti piselli di colore diverso in rapporto 3:1 (giallo dominante, verde recessivo). Osservando le tavole di Mendel per F3 si può dedurre che in realtà per F3 il rapporto corretto era 1:2:1.

Esempio

Chiamiamo G il giallo (dominante) e v il verde (recessivo), sapendo che in generazione F1 si ottengono tutte piante Gv e che in F2 otteniamo GG, Gv, Gv, vv possiamo calcolare tutte le possibili combinazioni ottenibili in F3 lasciando ad autofecondare F2. G G G G G GG GG GG G GG GG v Gv Gv G GG GG v Gv Gv v Gv Gv G v G v v v G GG Gv v Gv vv v vv vv V Gv vv v Gv vv v vv vv

Leggi di Mendel

• Gene come determinanti di natura particolata;
• Ogni individuo possiede due geni (possono essere dominanti o recessivi);
• Ogni singolo gene si ripartisce (segrega) egualmente nei gameti;
• Ogni gamete porta un solo gene per carattere;
• L’unione di gameti per formare uno zigote è casuale (leggi della probabilità).

Biologia molecolare

Deriva dall’unione della biochimica e dalla genetica.

Mutanti e mutazioni

Mutazione somatica: dà origine a un clone perché colpisce solo le cellule somatiche e quindi non trasmette la mutazione alle generazioni successive. Un tipico caso è il cancro (non causato da un gene);

Mutazione germinale: si verifica nel tessuto che darà origine alle cellule germinali e quindi questa mutazione verrà trasmessa agli organismi successivi.

Mutante: si tratta di organismi in cui l’allele colpito da mutazione è NULL (ossia quando l’attività funzionale della proteina eventualmente prodotta è zero o mancanza della proteina stessa). Se invece un determinato gene codifica per una proteina che funziona poco o male (ipomorfo). Un altro caso si ha invece quando un gene è totalmente nuovo (dopo la mutazione) viene definito neomorfo (un esempio è p53 che passa da oncospressore a oncogeno).

Le mutazioni possono essere di due tipi:

• Loss of function quando un gene perde la capacità di creare un costrutto efficiente per l’organismo;
• Gain of function quando viene prodotto troppo dalla traduzione di un determinato gene, questo può essere determinato dal fatto che un gene viene costantemente espresso in modo anomalo.

Le patologie umane sono determinate da geni gain o loss of function. Le mutazioni gain in eterozigosi danno fenotipo mutante. Il mutante viene definito come null e loss of functions. Nel caso di un gene eterozigote che non è in grado di mantenere una quantità di proteina sufficiente si parla di aploinsufficienza e si considera l’organismo mutante.

Dominante/recessivo

Dominante: Allele che impone il suo fenotipo; Recessivo: è quell’allele che esprime il suo fenotipo solo in condizioni di omozigosi recessiva. I concetti di dominante e recessivo sono distinti da quelli di mutante e wild type.

Un esempio esplicativo è la fenilchetonuria, essa è una malattia dovuta al mancato funzionamento della fenilalanina idrossilasi che catalizza la modificazione di fenilalanina in tirosina. Questo comporta che la fenilalanina venga accumulata e convertita in acido fenil-piruvico che danneggia il SNC provocando ritardo mentale. Esistono dei mutanti che hanno un ritardo mentale ma che hanno l’enzima mutato, ciò implica che questa mutazione non dipenda da un solo gene. Oppure esistono dei mutanti per l’enzima ma che non possiedono il fenotipo. Questo implica una seconda mutazione in un altro gene, per esempio in un gene che codifica per il canale attraverso cui la sostanza tossica raggiunge le cellule cerebrali. Si possono quindi definire delle cascate di geni di cui bisogna definire quali geni stanno a valle e quali a monte in modo da definire il fenotipo.

Complementazione

La produzione di un fenotipo selvatico si verifica quando due genomi aploidi che portano mutazioni recessive diverse sono riuniti nella stessa cellula. Ergo, se due alleli mutanti recessivi di fenotipo simile non si complementano, allora devono essere alleli dello stesso gene.

Esempio: Se si incrocia $ con £ si ottiene un fenotipo identico, ciò significa che i due fiori sono uguali fra loro. Si dice quindi che non è presente complementazione. Se si incrocia £ con ¥ (entrambi fenotipo mutante) si ottiene un fenotipo wild type, ciò significa che esiste una complementazione. Ovvero i due fiori che presentano un fenotipo identico in realtà non sono uguali ma che l’assenza del colore viola dipende da più geni e di conseguenza i fiori bianchi possono essere di questo colore in conseguenza alla mutazione di geni differenti. Ciò è possibile perché il colore può dipendere da diversi fattori che agiscono in cascata fra loro e quindi ci sono diversi punti in cui la mutazione può bloccare il processo determinando il fenotipo mutante. Con complementazione si intende quel processo per cui mutazioni su geni diversi si compensano mutuamente portando al fenotipo wild type.

Epistasi

Con epistasi si intende la tecnica con cui si ricerca il fenotipo mutante che domina in una combinazione allelica. Il fenomeno si verifica quando una coppia di alleli copre l'espressione fenotipica di un'altra coppia di alleli. Le caratteristiche fenotipiche dell'individuo saranno pertanto date dalla risultante di questa interazione; il gene che maschera l'espressione di un altro gene viene definito epistatico, il gene la cui espressione viene mascherata viene definito ipostatico. Ad esempio se il gene Y è epistatico sul gene X; il gene X è detto ipostatico rispetto al gene Y.

Più precisamente, nell'epistasi dominante, la presenza di un singolo allele epistatico A ha l'effetto di impedire il passaggio dal fenotipo 1 al fenotipo 2, passaggio che però è controllato anche da un'altra coppia allelica, i cui alleli possono essere B o b; si dice allora che A è epistatico su B e b perché, per la presenza di una copia di A, dal fenotipo 1 non si capisce se il secondo gene ha almeno un allele dominante o entrambi gli alleli recessivi.

Nell'epistasi recessiva, l'assenza di un allele A, ossia la presenza di una coppia allelica epistatica a/a, ha l'effetto di impedire (quindi l'allele A lo coadiuverebbe) il passaggio dal fenotipo 1 al fenotipo 2, passaggio che però controllato anche da un'altra coppia allelica, i cui alleli possono essere B o b; si dice allora che a/a è epistatico su B e b perché, a causa della presenza di una coppia allelica a/a, non si può ricavare dal fenotipo 1 se il secondo gene ha almeno un allele dominante o entrambi gli alleli recessivi.

Esempio

Nell’animale modello (composto di testa, due segmenti corporei e una coda) so che per la formazione della coda è necessaria la cascata di geni a, b e c. Raccogliendo un mutante senza coda dopo averlo studiato arrivo alla conclusione che sia mutato a livello di b. Nel caso io esprima in questo mutante a in maniera molto elevata non ottengo alcun risultato perché b è epistatico rispetto ad a, se invece overesprimo b e c compenso la mutazione e ottengo un fenotipo wild type.

Metodo

Il fenotipo epistatico corrisponde al gene più a valle. Nell’esempio a lato quando incrocio un individuo b- con uno a ottengo un esemplare bianco. Ciò sta a significare che il fenotipo di b è epistatico e che quindi si trova più a valle di quello di a. Secondo lo schema a inibisce b, b inibisce c e c inibisce il pigmento. Questo metodo ha come scopo quello di capire in una pathway metabolica quali sono i geni coinvolti e qual è la gerarchia delle proteine che ne derivano in modo da poter intervenire in modo mirato e preciso in caso di malattia.

Trascrizione

È uno dei processi genetici di base, essa ha il compito di copiare in un certo RNA un segmento di DNA. Esso coinvolge alcune classi di enzimi da tra cui le RNA polimerasi (da qui anche RNA pol) che vanno a unire ribonucleotidi a formare il trascritto della regione trascritta del gene.

Le RNA polimerasi:

• Si legano ai promotori attivi che sono regolati grazie ai fattori di trascrizione, tuttavia è bene ricordare che non è sufficiente il fattore di trascrizione per permettere la trascrizione, esiste una regolazione fine composta da diverse sequenze nella regione regolatoria del gene.
• Si legano a partire a livello di inizio della trascrizione, ossia a livello +1 = il primo nucleotide che viene trascritto e viene detto anche start point, la porzione a monte rispetto a questo nucleotide si definisce upstream (contiene quasi sempre il promotore) mentre la regione a valle si definisce downstream e possiede esoni, introni e la sequenza di terminazione.
• Denaturano per un tratto molto breve la doppia elica del DNA, apre la doppia elica a livello del promotore e trascrive uno solo dei due filamenti, chiamato filamento stampo fino alla fine della regione trascritta.
• Unisce ribonucleotidi trifosfato complementari al filamento stampo (AU, GC);
• Procede in direzione di sintesi 5’-3’, essa compie una polimerizzazione di testa sfruttando l’ultimo nucleotide trifosfato come fonte di energia per il legame;
• Usa Adenina, Guanina, Citosina e Uracile;
• Legandosi, comprende diverse decine di nucleotidi;

Le RNA sono complessi enzimatici molto complessi, solo alcuni fagi posseggono delle RNa pol faghiche che sono costituire da un’unica catena polipeptidica, per esempio T7, SP6 e una polimerasi mitocondriale. Queste RNA pol sono importanti perché possono essere utilizzate in vitro per trascrivere un pezzo di DNA.

Passaggi della trascrizione

L’RNA polimerasi si lega coprendo parte del promotore, con attività elicasica denatura per una breve sequenza nucleotidica il DNA e separa i due filamenti complementari. Usa uno dei due filamenti come stampo e comincia a produrre una sequenza complementare di mRNA. La sequenza complementare si allunga e quando il trascritto comincia a essere sufficientemente lungo, le basi neosintetizzate si associano temporaneamente al filamento stampo formando una doppia elica ibrida a DNA/RNA. Mano a mano che procede la trascrizione l’RNA viene rimosso e il processo continua. RNA polimerasi è in grado di riconoscere il filamento stampo grazie al promotore, esso infatti è presente sul filamento (a monte di 3’) che deve essere trascritto, così il promotore non risulta sono necessario per attaccare/staccare la RNA polimerasi ma è necessario a indicare quale gene deve essere trascritto (fattori di trascrizione), su quale filamento si trova e conseguentemente la direzione che RNA polimerasi (RNA pol) deve prendere. La sintesi di un trascritto primario non avviene a singolo mRNA per volta, man mano che una RNA polimerasi procede nella sintesi del RNA complementare si possono agganciare più RNA polimerasi l’una dietro l’altra. I processi di maturazione avvengono contemporaneamente ai processi di trascrizione: la trascrizione procede e gli spliceosomi (quando c’è sufficiente trascritto) cominciano a rimuovere gli introni.

Trascrizione nei procarioti

La RNA pol copre, ove è legata, una regione di ~35 paia di basi mentre la regione coinvolta nella denaturazione è di 15 paia di basi, il tratto a doppia elica ibrida DNA/RNA è lungo 9 paia di basi. La RNA pol è unica nei procarioti visto che tutti i geni trascritti presentano lo stesso tipo di regione regolatoria.

L’oloenzima è composto da 5 diverse subunità (ciascuna con un suo peso molecolare tipico):

• 2 α
• 1 β
• 1 β’
• 1 ω
• 1 σ: questa subunità funziona da fattore di inizio, la RNA pol batterica si lega al promotore e riconosce una sequenza presente tra -35 e -10 nella regione regolatoria, comincia la sintesi mantenendo σ legata e dopo ~10 nucleotidi polimerizzati la subunità σ si distacca e si associano altre subunità che agiscono da fattori di allungamento.

RNA polimerasi batterica

Le subunità alfa e beta costituiscono il core della polimerasi, questo core è in grado in linea di principio di iniziare la trascrizione in qualsiasi punto in qualsiasi molecola di DNA. Questo perché il core deve essere in grado di trascrivere qualsiasi zona del DNA, ciò che regola il loco in cui questo core si localizza è il fattore σ. Questa subunità trasforma il core nell’oloenzima pronto alla trascrizione e al riconoscimento del promotore. Sigma si lega da una parte al DNA e dall’altra al core della polimerasi, in questo modo può bloccare l’ingresso del DNA nella tasca catalitica del core finché non si arriva alla sequenza indicata da sigma per la trascrizione. In poche parole, la peculiarità di sigma è duplice:

• Aumenta di mille volte l’affinità fra polimerasi e promotore;
• Ma allo stesso tempo diminuisce l’affinità della polimerasi per il DNA.

Sigma si trova in eccesso rispetto ai core enzimatici.

Promotori e footprinting

Attraverso la tecnologia footprint furono analizzati tantissime zone in cui la polimerasi si attaccava (tutte allineate secondo il nucleotide +1) e si scoprì che queste zone erano tutte differenti fra loro se non delle brevi sequenze nucleotidiche definite consenso situate:

• Un esamero a -35 che ha particolare importanza nell’attacco iniziale della polimerasi in particolare una mutazione a questo livello andrebbe a compromettere la formazione del complesso chiuso;
• Una definita Pribnow box a -10 che ha la funzione di formazione del complesso aperto o bolla di trascrizione e quindi una mutazione a questo livello non influenza il legame della polimerasi ma la sua funzione successiva.

Le proteine che interagiscono con il DNA non sono specifiche per una singola sequenza per via dell’enorme variabilità che esiste a livello del genoma, esse interagiscono per affinità e quindi esistono delle zone simili ma non uguali in grado di relazionarsi con la stessa proteina. Inoltre tipicamente (tranne TBP) i fattori di trascrizione di legano al solco maggiore del DNA grazie al perfect fit perché il bordo della coppia di basi è esposto e possiede zone in grado di interagire con le proteine (legami H, zone idrofobiche). Nel solco principale l’eterogeneità chimica è molto maggiore ed è per questo che le proteine tendono ad interagire con questa zona e non con il solco minore. Generalmente si può dire che la superficie di una proteina è complementare alle caratteristiche di superficie della doppia elica. Un esempio sono le zone -35 e -10 che corrispondono a zone specifiche della proteina σ, in particolare la zona 4.2 e la zona 2.4.

Fattore σ

È una proteina molto complessa che non ha solo la capacità di legare il DNA ma ha anche un dominio N terminale che ha la funzione di “freno” per il sistema. Questa regione N terminale ha lo scopo di impedire ai fattori sigma liberi non legati al DNA di legarlo. Soltanto quando si forma l’oloenzima la regione N-terminale cambia di conformazione e sigma è in grado di legare il genoma. Sigma garantisce il riconoscimento promotoriale nella fase di inizio. Dopo che la fase di inizio abortiva è stata superata sigma si stacca dal core e viene riciclato in un altro processo di riconoscimento.

Superavvolgimenti

Nel muoversi lungo il DNA la polimerasi, essendo il DNA spiralizzato, deve svolgere dei superavvolgimenti, nel fare questo introduce dei superavvolgimenti a valle. Dal punto di vista biomeccanico questo sa