Documento completo per esame di Biologia molecolare med 3-4 UNIPD

FUNZIONI DI WNT IN EMBRIOLOGIA

L’embrione inizialmente non ha polarità in quanto è simmetrica, la posizione antero-dorsale viene

definita dallo spermatozoo al momento della fecondazione. Quando avviene la fecondazione lo

spermatozoo porta con se i centrioli che cominciano a polimerizzare in modo asimmetrico (nei

microtubuli esistono un’estremità + e una -) viaggiando sotto la cortex. Il punto dove entra lo

soermatozoo è la futura parte ventrale in quanto i microtubuli trasportano con se le cargo proteine

per le chinesine che trasportano vescicole al cui

interno è presente wnt determinando un

gradiente di beta catenina all’interno

dell’embrione. LA VIA DI SHH

La via di sonic hedgehog è via di trasduzione

del segnale che coinvolge meccanismi nella vita

embrionale ma anche nella vita adulta. Nei

vertebrati questi segnali sono stati studiati nel

loro ruolo di morfogeni e nel ruolo di

differenziamento cellulare.

SHH OFF

I fattori di trascrizione coinvolti

in questa via prendono il nome

di Ci (cubitus interruptus).

Nel modello hedgehog off

ossia in assenza di ligando si

osserva che il sistema è

spento. Il recettore chiamato

patched va ad inibire un trasduttore di membrana positivo che si chiama

smoothened mantenendolo all’interno di vescicole. Normalmente quindi questo

è mantenuto inattivo da patched. Il fattore di trascrizione è inattivato tramite

fosforilazione (che avviene quando Ci è ancorata ai microtubuli, agiscono GSK3

e CKI) e taglio proteolitico (Slimb) che toglie il dominio di transattivazione al

fattore trascrizionale che quindi si lega al DNA ma senza attivare la trascrizione.

Questo fattore senza il dominio di transattivazione occupando il DNA media un

processo di repressione della trascrizione.

SHH ON

Quando il ligando lega il suo recettore Patched subisce una modificazione per

cui smette di inibire smoothened (che di per sé sarebbe costitutivamente attiva).

Quest’ultimo inibisce le chinasi e le proteasi e quindi non avviene più il taglio di Ci il quale entra nel

nucleo come fattore di trascrizione e lega specifiche proteine che promuovono la trascrizione.

IL CASO DEI VERTEBRATI

Nei vertebrati i corrispondenti fattori di trascrizione prendono il nome di Gli e sono 3 (Gli1, Gli2 e

Gli3) che posseggono proprietà differenti in quanto Gli3 è quasi completamente repressorio, Gli2 è

quasi completamente attivatorio e Gli1 è molto simile a Ci di Drosophila.

una mutazione a

• livello di patched

provoca una

costitutiva via di

trasduzione;

una mutazione a

• livello di smoothened

desensibilizza la via;

una mutazione in un

• Gli inibiitorio porta il

sistema ad essere

sovraeccitato;

una mutazione in un Gli attivatorio provoca una attenuazione della responsività del segnale

• hedgehog.

IL RUOLO NELLO SVILUPPO E NELLA MORFOGENESI

La via di Hedgehog è coinvolta nello sviluppo e nella morfogenesi del tubo neurale, Sonic

Hedgehog viene secreto dal mesoderma assiale (parte della notocorda) e il suo gradiente media la

formazione di cellule diverse. Viene definito

quindi morfogeno ossia un fattore secreto

capace di istruire destini cellulari diversi a

diverse concentrazioni. Le cellule ventrali quindi

ricevono un segnale maggiore e saranno i

motoneuroni, salendo di pochi micron la

concentrazione cambia e le cellule sono

destinate a diventare diversi tipi di interneuroni.

Le cellule più dorsali che non ricevono

hedgehog diventeranno neuroni sensitivi.

Il vantaggio di questo sistema risiede nell’utilizzo di un solo fattore per determinare numerosi tipi

cellulari.

I segnali di SHH è espresso anche nella zona più anteriore della notocorda ossia la piastra

precordale, quest’ultima ha due funzioni:

una trofica per lo sviluppo dell’encefalo;

• il dividere il campo dell’occhio in due occhi.

•

Mutazioni in SHH quindi provocano delle anomalie dal punto di vista fisico, il caso più estremo

(mancanza di SHH) porta alla ciclopia ma ci

sono casi meno gravi perché SHH si muove

secondo gradiente. Le sindromi che ne

derivano prendono il nome di sindromi

oloprosencefaliche.

Oltre che nella merfogenesi facciale e cranica

SHH è implicato nella morfogenesi degli arti,

da esso infatti dipende la polarizzazione

antero-posteriore (pollice-mignolo, radio-ulna)

degli arti, il pollice riceve meno hedgehog.

Un caso di mutazione di Gli3 (repressorio)

porta ad una overespressione di SHH e quindi si ha la formazione di più dita del normale e in

posizione più posteriore.

RUOLO DEL COLESTEROLO

SHH non è funzionale se prima non viene modificato chimicamente con l’aggiunta di residui di

colesterolo, quest’ultimo modifica la diffusibilità ed è strettamente necessario per il corretto

funzionamento. Una modifica al metabolismo del colesterolo (per esempio grazie ad alcaloidi di cui

un esempio è la ciclopamina) non permette una corretta via di Hedgehog portando a mutazioni.

Queste sostanze vengono definite teratogene.

FUNZIONAMENTO NEI TUMORI

Alcuni tumori della pelle derivano dalla mutazione di Patched (oncosoppressore) che quindi

determina una costante attività di Smoothened e quindi della via di SHH (oncogeno).

Inoltre c’è da ricordare che anche patched necessita di colesterolo per il suo corretto

funzionamento e quindi anche lui in caso di modificazioni del metabolismo del colesterolo ne

risente. TGF-β

I ligandi di questa via sono una famiglia di citochine che

legano recettori serin-treonin chinasici, il legame del

ligando comporta la dimerizzazione dei recettori e quindi

si forma un complesso terziario (ligando-recettore I-

recettore II). Il recettore II causa la fosforilazione del

recettore I in uno specifico dominio che quindi si attiva

fosforilando direttamente i fattori di trascrizione di questa

via che sono R-Smad. Normalmente queste R-Smad sono ancorate a proteine che le mantengono

nel citoplasma, entrano nel nucleo e qui dimerizzano con Smad-4 (non viene fosforilata dal

recettore ma è il partner di R-Smad). All’interno del nucleo questo dimero lega il DNA ma non

agiscono ne dà attivatori ne da inibitori, la loro azione dipende dal contesto in cui si trovano

(coattivatori, fattori di trascrizione, tipo cellulare). Le Smad sono in grado di uscire dal nucleo

grazie all’ubiquitnazione (non porta a poliubiquitinazione ma ubiquitinazione regolative che non

comporta la proteolisi), nel citoplasma vengono defosforilate e riancorate quindi a proteine

specifiche.

Questo processo di entrata e uscita dal nucleo ha la funzione di rendere l’interno del nucleo

parallelo all’ambiente extracellulare.

IL RUOLO DI MORFOGENI

Le quantità di Smad all’interno della cellula portano la

cellula a destini diversi, lo stesso segnale ma in

misure diverse porta a destini cellulari differenti.

Una sottoclasse di TGF-beta sono le BMP, in assenza

di organizzatore non si forma il sistema nervose

perché manca un inibitore secreto che vada a

bloccare BMP4. Non è quindi un gradiente di BMP4

che provoca un cambiamento di destini cellulari ma il

gradiente è dell’inibitore che va a sottrarre BMP4 e lo

mantiene all’esterno del nucleo, si parla quindi di

gradiente inverso (viene soppresso ventralmente e

non dorsalmente).

La logica fra BMP e TGF-beta è la stessa ma i ligandi

e i recettori sono diversi e inoltre anche i fattori di

trascrizione sono diversi. Infatti nel nostro genoma

sono presenti 8 SMAD di cui SMAD2 e 3 sono

coinvolte nella via di TGF-beta mentre SMAD1, 5 e 8

sono dedicate al mondo BMP; SMAD 4 è comune fra

le due vie.

TGF-beta è importantissimo nel differenziamento dei vari tipi di linfociti ed ha quindi un ruolo

importantissimo per ciò che riguarda il sistema immunitario.

REGOLAZIONE

La regolazione avvine grazie a delle molecole specifiche che agiscono nell’ambiente extracellulare

sequestrando le molecole attivatrici. HIPPO

INIBIZIONE DA CONTATTO

È un segnale di tipo fisico-meccanico, quando le cellule si trovano isolate sono stimolaTe a

proliferare perché cercano la situazione in cui sono in contatto l’una con l’altra grazie a complessi

giunzionali. Il segnale che dice stop alla proliferazione è il contatto con le cellule circostanti stesse.

La pathway che regola questo è denominata hippo (normalmente è una via tumor suppressor

quindi se viene inibita diventa oncogeno).

La via di hippo è composta da diverse chinasi che hanno come scopo quello di regolare due fattori

di trascrizione che prendono il nome di YAP e TAZ.

Quando le cellule sono sparpagliate i fattori di trascrizione YAP/TAZ sono attivi e le inducono a

proliferare. Nel momento in cui le cellule sono stipate e quindi diminuiscono di dimensione, i fattori

di trascrizione passano dal nucleo al citoplasma e quindi si passa alla inibizione da contatto.

Quindi ciò che conta non è solo il contatto ma anche le proprietà meccaniche e quindi in poche

parole quanto spazio c’è. Anche la matrice su cui stanno poggiate determinano la proliferazione o

meno.

La cascata di chinasi è inibitoria, quindi quando è attiva i fattori di trascrizione sono nel citosol e

vengono eliminati. Se invece è inattiva sono liberi di entrare nel nucleo, questi non hanno un

dominio per legare il DNA, lo fanno attraverso una interazione con proteine TEAD (1,2,3 e 4) che

riconoscono il DNA ma non hanno la capacità di attivare la trascrizione.

Il complesso composto da YAP/TAZ e TEAD attiva geni che:

promuovono la divisione cellulare;

• la sopravvivenza della cellula

• e la staminalità.

•

HIPPO ON

Quando le chinasi sono attivate:

la prima chinasi MST fosforila la seconda LATS attivandola;

• LATS attivo fosforila YAP e TAZ che li rende inattivi perché sono legati da ancora citoplasmatiche

• che non permettono la traslocazione nel nucleo e le rendono propensi alla ubiquitinazione e

quindi alla degradazione.

Nel nucleo rimane TEAD da solo ma senza i due fattori di trascrizione non riesce ad attivare la

• trascrizione.

Queste chinasi sono attivate da:

il segnale fisico meccanico che viene trasmesso attraverso proteine recettoriali come CD44,

• merlin, KIBRA. In realtà non è ancora chiaro quanti e quali siano precisamente questi trasduttori.

Questa via è importante per:

controllo della dimensione degli organi;

• rigenerazione dei tessuti;

• per la corretta divisione fra distretto staminale e differenziato;

• sviluppo embrionale;

• sviluppo del cancro.

•

Esem