Documento completo per esame Citologia-Istologia-Embriologia corso med 3-4 Unipd

Citologia e microscopia ottica

Il massimo della risoluzione ottenibile con un microscopio ottico è di 0,2 nm.

Osservazione delle cellule

- Osservazione delle cellule viventi, cellule fissate e interno cellulare.

- Il problema dell'opacità è stato risolto attraverso l'inclusione, la fissazione e il taglio al microtomo.

- La fissazione avviene tramite alcol etilico o metilico, aldeidi oppure per congelamento in N liquido.

- L'inclusione avviene con la paraffina in grado di reagire con i solventi organici.

- Risoluzione: è la distanza minima fra due punti tale che i due punti vengano visti separati dall'occhio.

- Il problema della trasparenza è stato risolto attraverso l'uso di specifici coloranti detti anche colorazioni istologiche che assorbono determinate lunghezze d'onda.

Colorazioni istologiche

• Ematossilina-eosina: L'ematossilina o emallume di Mayer colora in blu violetto i componenti cellulari carichi negativamente, come acidi nucleici, proteine di membrana e membrane cellulari, elastina. Questi componenti sono detti basofili e si trovano prevalentemente a livello del nucleo, che assume pertanto il colore blu. L'eosina colora invece in rosso rosato i componenti carichi positivamente, come molte proteine cellulari, le proteine mitocondriali, le fibre collagene. Questi componenti sono detti eosinofili o acidofili e determinano una colorazione rosata di tutte le rimanenti zone cellulari, il citoplasma e le sostanze extracellulari.
• Azan Mallory: Viene usato prima Azocarminio, un colorante che colora i nuclei, cromatina, eritrociti e granuli acidofili dell'ipofisi molto intensamente di rosso, neurofibrille di colore rossastro e il citoplasma di rosso pallido. Poi viene usata la miscela policroma di Mallory che contiene blu di anilina, orange G e acido ossalico, che colora intensamente di blu le fibre di collagene, reticolo e granuli basofili dell'ipofisi, di azzurro le mucine e granuli citoplasmatici delle cellule delta dell'ipofisi, di arancio le cellule del sangue e le fibre muscolari.
• PAS: Colora di un fucsia intenso i glucidi e derivati.
• Verde metile: è un colorante basico che colora la cromatina, le inclusioni lipidiche e i comparti citoplasmatici basofili.
• Anticorpi: produzione di anticorpi specifici per una proteina target, vengono abbinati agli anticorpi dei complessi enzimatici che dopo la reazione producono un precipitato colorato (immunoistochimica) oppure molecole fluorescenti visibili al microscopio ottico a fluorescenza (immunofluorescenza).

Microscopia confocale

Pemette il passaggio delle radiazioni solo se esse sono a fuoco, questa proprietà è dovuta all'impiego di particolari lenti.

Microscopia elettronica

Elettronica a trasmissione: contiene lenti magnetiche che deviano il fascio di elettroni generato dal tungsteno verso dei sensori che elaborano l'immagine digitale in bianco e nero. Il fascio di elettroni, nell'attraversare il campione, verrà deviato e questo, attraverso numerosi calcoli, porta all'elaborazione dell'immagine. Il campione però prima di essere inserito subisce un sistema di preparazione diverso da quello di un campione per microscopio ottico. Per la fissazione viene utilizzata una resina che garantisce maggiore solidità in previsione del successivo taglio all'ultramicrotomo. Infine, il preparato viene colorato utilizzando dei sali di osmio (elettron-denso) che va a legarsi alle zone polari. La risoluzione complessiva è di circa 0,1 nm.

Elettronica a scansione: il preparato verrà ricoperto con un sottile strato metallico che sarà oggetto di indagine attraverso un fascio di elettroni. Questo tipo di microscopio è utile per determinare la struttura esterna di un composto che si va ad osservare.

La cellula

Nucleo

• Contornato da un involucro nucleare costituito da doppia membrana, questo involucro presenta dei pori proteici che regolano finemente il flusso di macromolecole, queste strutture sono definite pori nucleari;
• Il nucleoscheletro dà la forma al nucleo e lo sostiene;
• Il nucleosol è l'ambiente acquoso;
• La cromatina che contiene il 99,9% del genoma umano e proteine istoniche condensata in cromosomi;
• I nucleoli che tipicamente è solo uno ma possono essercene di più è il loco di formazione dei ribosomi.

Membrana plasmatica

• Doppio strato lipidico;
• Proteine integrali di membrana e non;
• Glicolipidi;
• Colesterolo;
• Glicocalice formato dai saccaridi legati alle proteine di membrana e ai lipidi, possiede una carica netta negativa. È importante per l'adesione cellulare e per il riconoscimento cellulare. Contiene i recettori di membrana;
• Specializzazione in strutture di movimento.

Citoplasma

Citosol: rappresenta il 50% del volume cellulare, è una soluzione acquosa di sali e proteine, è leggermente alcalina (pH 7,4).

Citoscheletro: è composto da microtubuli, microfilamenti e filamenti intermedi, sostiene e permette la locazione degli organelli, permette inoltre il movimento e le specializzazione del plasmalemma.

Organuli non membranosi: come i centrioli e i ribosomi liberi.

Organuli membranosi: sono organelli con almeno una membrana, ne fanno parte mitocondri, perossisomi, reticolo endoplasmatico, Golgi, vescicole, endosomi e lisosomi.

Mitocondri

• Organelli tubulari con diametro di 0,5-1 μm;
• Doppia membrana, quella interna forma delle creste e racchiude la matrice in cui è situato il genoma mitocondriale (origine endosimbiontica);
• Funzioni cataboliche (ciclo di Krebs, respirazione cellulare, β-ossidazione degli acidi grassi), sintesi di steroidi, produzione di ROS e radicali liberi, deposito di ioni Ca²⁺;
• Induce sotto preciso stimolo il fenomeno dell'apoptosi.

Perossisomi

• Struttura vescicolare con singola membrana, diametro di 0,5-1 μm;
• Hanno un contenuto elettrondenso (cristallo di enzimi);
• Funzioni: perossidazione (2H₂O₂ → 2H₂O + O₂), sintesi plasmalogeni (lipidi, mieline), rimuovono i ROS e i radicali liberi.

Reticolo endoplasmatico

Cisterne delimitate da una singola membrana, è in comunicazione con l'involucro nucleare (attraverso i pori) e al citoplasma, pH 7.

• RER: presenza di ribosomi sulla superficie, produzione e glicosilazione delle proteine;
• REL: deposito e rilascio di ioni Ca²⁺, sintesi e distribuzione lipidi e fosfolipidi, sintesi di steroidi, rimozione delle tossine.

Golgi

• Formato da cisterne che non sono in comunicazione diretta fra loro, queste sono impilate e hanno pH acido pari a 6,5.
• Funzioni: smistamento e modificazione delle proteine.
• Sintesi dei proteoglicani.

Vescicole

• Organelli sferici con membrana singola;
• Trasporto: si fondono alla membrana della struttura bersaglio;
• Endocitiche: si distaccano dal plasmalemma e permettono l'entrata nella cellula di alcune sostanze;
• Secrezione: si fondono al plasmalemma e rilasciano il loro contenuto all'esterno.

Endosomi e lisosomi

• Hanno la stessa struttura ma gradi di maturazione diversi;
• Gli endosomi ricevono il materiale dall'esterno della cellula, maturano in lisosomi che con gli enzimi che arrivano dal Golgi assumono una funzione di demolizione;
• L'attivazione degli enzimi è determinata dal pH acido di 5,5 che si ottiene attraverso trasportatori di membrana;
• Hanno grandezze diverse, in genere di circa 0,1 μm.

Membrane

Formate da doppio strato fosfolipidico (glicerolfosfolipidi e sfingolipidi) con teste polari rivolte verso la zona extracellulare e il versante cellulare, e zone code idrofobiche ravvicinate protette dall'acqua. Quindi la membrana è una struttura anfipatica.

È un fluido bidimensionale in cui è permessa la diffusione laterale lipidica, il flip-flop avviene grazie a specifici enzimi; le catena idrofobiche sature implicano un maggior impaccamento e quindi una maggiore rigidità della membrana (6-7 nm), quelle insature invece presentano dei ripiegamenti che determinano una maggiore fluidità e uno spessore di 5nm.

Fosfolipidi

• Fosfatidilcolina (PC), neutra a pH 7;
• Fosfatidiletanolammina (PE), neutra;
• Fosfatidilserina (PS), carica negativamente;
• Fosfatidilinositolo (PI), carico negativamente;

Sfingolipidi

• Sfingomielina (fosforil-colina);
• Cerebrosidi, un residuo glucidico;
• Gangliosidi, più residui glucidici;

Colesterolo

È un componente delle membrane animali, si posiziona con il residuo polare -OH vicino alle teste polari, la zona idrofoba invece resta immersa fra le code dei fosfolipidi. Ha il ruolo di conferire maggiore rigidità alla membrana.

Le membrane sono polari, esse presentano differenze strutturali fra lo strato lipidico extracellulare e quello citosolico. In particolare, nella faccia esterna sono maggiormente presenti sfingolipidi, glicolipidi e PC. Nella faccia interna invece prevalgono PE e PS.

Proteine

• Integrali di membrana: possiedono almeno un dominio transmembrana (circa 20 aa) che attraversa completamente lo strato fosfolipidico. Questa zona presenta amminoacidi con gruppi funzionali apolari (come la fenilalanina). Studiando una proteina e facendo un profilo di idrofobicità possiamo capire quale parte della sequenza amminoacidica è apolare e quindi transmembrana. I domini transmembrana possono anche essere più di uno, solitamente sono alfa eliche ma nel caso delle porine è maggiormente presente la struttura a beta barile (interno idrofilo ed esterno idrofobico). In alcuni casi la proteina non attraversa interamente lo strato fosfolipidico ma rimane immersa in uno solo dei due strati lipidici (non vengono più considerate proteine transmembrana).
• Periferiche: sono proteine che si agganciano alle proteine transmembrana per legarsi alla membrana. Questo tipo di aggancio si può vedere in entrambi i versanti della membrana.
• Ancorate ai lipidi: sono proteine che si legano covalentemente ad un'ancora lipidica che è inserita nella membrana. Il legame con la membrana è un legame reversibile perché la proteina può modificare la sua struttura creando una tasca idrofobica in cui inserire l'ancora, facendo ciò la proteina viene liberata. Le ancore sono diverse in base al versante della membrana:
  • Versante citosolico:
    • Ancora di acido miristolico legato al gruppo amminico terminale (legame amidico), miristolazione;
    • Ancora di acido palmitico legato ad una cisteina con un legame tioestere, palmitoilazione;
    • Ancora di farnesile (non è un acido grasso e ci sono tre sottocategorie, il farensile, il prenile e il geranil geranile) legato tramite un legame tioetere con cisteina C terminale (generato dal taglio della proteina dovuto a tale legame).
  • Versante extracellulare: nel versante extracellulare è presente solo un tipo di ancora lipidica, il GPI (glicosilfosfatidilinositolo). È un fosfolipide a cui è legato il fosfatidilinositolo al fosfato. Non ancora direttamente la proteina, è presente infatti un piccolo oligosaccaride formato da quattro residui, un n-acetilglucosammina e tre di mannosio (a cui sono legati un gruppo fosfato e etanolammina), uno di quest'ultimi lega l'estremità C terminale derivante da un taglio proteolitico della proteina da ancorare.

Zattere lipidiche

Sono zone ricche di colesterolo che rimangono più rigide, spesse e compatte. In esse è alta la presenza di sfingolipidi. Navigano nella membrana plasmatica, si formano solo quando è necessario e la loro funzione è quella di concentrare le proteine integrali di membrana e di conseguenza recettori ed effettori nello stesso punto.

Proprietà delle membrane

La membrana può essere attraversata da piccole molecole apolari che si muovono secondo gradiente di concentrazione, queste molecole sono per esempio CO₂ e O₂. Anche l'acqua può passare ma è un processo molto lento e poco spontaneo, le molecole polari più grandi sono impedite nel passaggio. Anche gli ioni sono impediti nel passaggio.

La cellula è in grado di creare compartimenti con concentrazioni diverse, questo è dovuto alla permeabilità selettiva e crea concentrazioni ioniche fondamentali per la vita. Queste concentrazioni sono regolate da equilibrio mobili, da trasportatori (trasformazioni allosteriche) e canali (no porine, no strutture a barile) molto selettivi e specifici per determinati soluti.

Tipi di trasporto

Trasporto passivo: trasporto secondo gradiente senza utilizzo di energia, un esempio è rappresentato dalla semplice diffusione oppure può esserci una proteina che permette il trasporto facilitato.

Trasporto attivo: è un trasporto che va contro il gradiente di concentrazione utilizzando energia che viene ricavata dall'idrolisi dell'ATP e viene definito trasporto primario.

Il trasporto secondario avviene invece quando vengono trasportati due soluti contemporaneamente, uno secondo gradiente e l'altro contro, questo avviene perché si utilizza l'energia potenziale del trasporto secondogradiente per far entrare anche la molecola che altrimenti sarebbe ostacolata. In questo caso si parla di sinporto se viaggiano entrambi nella stessa direzione oppure antiporto se viaggiano in due direzioni opposte.

Il caso dei globuli rossi

Il globulo rosso è adibito al trasporto di ossigeno grazie all'emoglobina e al rilascio di anidride carbonica a livello dei polmoni. Sulla membrana plasmatica sono presenti due principali proteine di trasporto: la glicoforina A e la proteina della banda 3. Quest'ultima regola il passaggi degli ioni HCO₃^- e Cl^-.

A livello polmonare la concentrazione elevata di ossigeno fa sì che questo entri e si leghi all'emoglobina provocando l'espulsione di un protone. L'anidrasi carbonica combina il protone e l'acido carbonico (derivante dal plasma e entrato attraverso la proteina della banda 3) formando anidride carbonica e acqua. Per favorire l'entrata dell'acido carbonico è stato necessario un trasporto in antiporto con lo ione cloro.

A livello dei tessuti avviene l'esatto opposto, ossia il cloro entra per favorire l'uscita di acido carbonico formatosi dopo che la CO₂ altamente concentrata nei tessuti è entrata nel globulo rosso.

Pompe

Le pompe utilizzano l'energia liberata dall'idrolisi dell'ATP per trasportare ioni o molecole da un lato all'altro della membrana. Esse subiscono modificazioni conformazionali per compiere il loro ruolo. Sono quindi dei trasportatori attivi e ne esistono diverse classi:

Pompe P

Sono adibite al trasporto di ioni solitamente in antiporto, l'ATP viene idrolizzata e l'energia così liberata viene utilizzata per fosforilare la pompa, questo comporta una modificazione allosterica della proteina. Un esempio è la pompa SERCA che è presente nel reticolo endoplasmatico e regola l'accumulo del calcio. È composta da catene che formano una tasca idrofila attraverso la membrana, il suo funzionamento può essere riassunto:

• Due ioni calcio si legano alla tasca nel versante citosolico in scambio con due ioni H⁺.
• La pompa viene fosforilata ed essa cambia conformazione bloccando gli ioni calcio.
• Successivamente due ioni H⁺ si scambiano con gli ioni calcio che vengono liberati nel lume del RE;
• La pompa viene defosforilata e si stabilizza il legame con i due protoni.

La possiamo considerare una pompa elettrogenica perché crea un potenziale, è molto simile alla pompa sodio potassio; la differenza principale è che in quest'ultimo caso l'ATP si lega direttamente alla pompa e non ne media la fosforilazione.

Pompe F

Sono pompe che trasportano solo ioni H⁺, il legame dell'ATP o dell'ADP è ciò che provoca la modificazione conformazionale.

Pompe V

Sono pompe molto simili alle precedenti, un esempio sono quelle presenti sui lisosomi che garantiscono un pH acido.

Pompe ABC

Sono pompe che trasportano piccole molecole apolari, sono una classe di pompe detossificanti perché sono adibite allo smaltimento di alcune sostanze nocive. Sono la causa della resistenza ai farmaci chemioterapici. Sono formate da dimeri simmetrici che sporgono da entrambi i lati della membrana e hanno una classica forma a forbice. Il loro funzionamento può essere riassunto:

• La funzione comincia quando una molecola entra in contatto con la tasca posta fra le due subunità.
• Il legame con la molecola porta la pompa ad avere un'elevata affinità per l'ATP. Quando questa si lega avviene una modificazione conformazionale che consiste in una rotazione che porta la tasca ad aprirsi verso lo spazio extracellulare.
• L'ATP viene idrolizzata e la proteina torna al suo stato iniziale ed è pronta per un altro ciclo.

Canali

Sono proteine di membrana che creano dei passaggi attraverso questa. Non vanno confusi con le porine, i canali infatti creano dei passaggi altamente specifici, cosa che le porine non fanno. La specificità di queste proteine è dovuta ad un filtro di selettività composto di numerose postazioni che comprendono residui specifici.