Documento completo per esame di Biologia med 3-4

La cromatina

La cromatina è tutto il materiale che si trova all'interno del nucleo, quindi il contenuto del nucleo è la cromatina. Essa è costituita da DNA, proteine e RNA. La cromatina è un insieme complesso di macromolecole in cui una grossa parte è di DNA. La cromatina ha aspetti diversi che variano nei diversi livelli di compattamento del DNA. Le molecole di DNA nel nucleo si organizzano tramite le sue interazioni con proteine in un modo molto ordinato e con passaggi successivi ordinati. Questi livelli di compattamento sono non solo necessari per permettere a tutto il DNA di rimanere nel nucleo, ma anche per regolare l'attività del DNA. Questi livelli di compattamento non sono statici: durante la vita di una cellula, il modo in cui il DNA si compatta nel nucleo cambia.

La cromatina è composta da 40% di DNA, 44% di proteine istoniche, 13% proteine acide non istoniche e 4% di RNA stabilmente legato al DNA. La cromatina è quindi principalmente costituita da proteine istoniche e DNA. Il DNA è sempre sotto forma di cromatina nel nucleo, quindi interagisce sempre con la sua componente proteica. La componente proteica degli istoni è un insieme di proteine diverse caratterizzate da una elevata basicità (particolarmente ricche in amminoacidi basici). Le proteine istoniche hanno funzioni strutturali ma anche regolative per quanto riguarda il DNA: strutturali perché mediano le fasi iniziali del compattamento, regolative perché il compattamento si ripercuote sulla possibilità di trascrizione dei geni compattati. L'interazione degli istoni con il DNA è prevalentemente di tipo ionico (non esclusivamente però).

Le proteine non istoniche sono proteine che hanno interazioni, strutture diverse e costituiscono quindi un gruppo eterogeneo che può variare tra i vari tipi cellulari a seconda dello stato funzionale della cellula. Le proteine non istoniche hanno funzione sia strutturale che regolativa: strutturale perché aiutano il DNA a raggiungere livelli superiori di compattamento, regolative perché interagiscono con il DNA regolano l'attività trascrizionale (e.g. i fattori di trascrizione).

La differenza principale tra proteine istoniche e proteine non istoniche sta nell'interazione con il DNA: le prime sono aspecifiche e legano il DNA in quanto esso è carico negativamente mentre le seconde riconoscono sequenze specifiche e selezionano sequenze specifiche dove andranno a legarsi. Questo fa sì che le proteine non istoniche abbiano target specifici, non si legano in modo casuale ma a sequenze date.

Compattamento del DNA

Il compattamento del DNA è molto differente tra procarioti e eucarioti: il compattamento è estremamente diverso e seppur entrambi vadano incontro a fenomeni di compattazione e organizzazione, lo fanno in modo molto diverso. Il DNA procariotico non ha mai interazioni con proteine istoniche, quindi nei procarioti non esistono le proteine istoniche (mentre negli archaea esistono gli istoni). Gli eucarioti hanno molti cromosomi (molte molecole di DNA ciascuna lineare). Le molecole sono in grado di organizzarsi in un volume piuttosto piccolo in un modo ordinato: si può quindi dedurre che l'organizzazione del DNA nel nucleo è un processo preciso e delicato in modo che i cromosomi non si incrocino, non si intersechino e non siano più accessibili alla trascrizione. Il nucleo è una struttura altamente organizzata.

Il DNA eucariotico è molto lungo (qualche miliardo di bp) e ad opera degli istoni e delle proteine non istoniche è possibile far stare il DNA nel nucleo. Le proteine fanno diminuire di dimensioni il DNA di diecimila volte per farlo stare nel nucleo. Il DNA nel nucleo eucariotico non si trova in una forma lineare ma è una forma che è più accorciata che va sotto il nome di superspiralizzazione. Quindi la molecola di DNA viene avvolta in modo tale da occupare il minor spazio possibile. Questo processo però è reversibile: la cellula avvolge il DNA con delle interazioni che possono essere "facilmente" modificate. Ciò è essenziale perché la molecola sia accessibile per la trascrizione e per la divisione cellulare.

Significati del compattamento del DNA

• Significato sterico (la riduzione delle dimensioni)
• Protezione (il compattamento dipende dalla presenza o meno dell'involucro nucleare perché è importante come sistema di protezione da forze esterne)
• Regolativo (il compattamento regola l'attività trascrizionale del DNA rendendolo o meno accessibile alla trascrizione da RNA pol)

Eucromatina ed eterocromatina

Osservando un nucleo in base al livello di compattamento possiamo suddividere la sua cromatina in due grosse categorie:

• Eucromatina (la cromatina meno compatta che è quella cromatina che contiene dei geni e ha attività trascrizionale -- in quel momento ci sono geni sottoposti a trascrizione)
• Eterocromatina (la cromatina che nel momento dell'osservazione è più compatta e non ha attività trascrizionale)

L'eterocromatina è suddivisibile a sua volta in due porzioni:

• Costitutiva
• Facoltativa

La differenza sostanziale tra le due è che l'eterocromatina costitutiva non contiene alcun gene. Una piccola parte del genoma è costituita da geni mentre la gran parte del genoma non contiene geni. Una parte di questi non geni hanno funzioni strutturali (ma non solo) importanti quali i telomeri e i centromeri (porzioni terminali e futuro sito d'attacco del fuso mitotico). L'eterocromatina facoltativa presenta geni ma essi sono silenziati (trascrizionalmente inattivi) nel preciso momento in cui la cellula viene osservata. Sono geni volontariamente inattivati dalla cellula nel suo programma differenziativo. I geni possono essere riattivati se la cellula necessita di trascrivere un gene silenziato, la riattivazione può avvenire per stimoli esterni o per necessità differenziative cellulari. Fanno parte dell'eterocromatina facoltativa i corpi di Barr che sono i cromosomi X inattivati negli organismi di sesso femminile: i mammiferi di sesso femminile hanno due cromosomi X mentre quelli di sesso maschile ne contengono solamente uno.

Il problema del dosaggio genico

Il dosaggio genico si riferisce alla quantità di espressione necessaria di un dato gene: per quanto riguarda gli autosomi, esistono due copie ciascuna delle quale trascrive il suo gene mentre nei cromosomi sessuali presentano una trascrizione che non corrisponde alla normale trascrizione della copia di geni. Questo per far sì che tra individui di sesso maschile e di sesso femminile ci sia una simile quantità di geni trascritti a partire dal cromosoma X. Questo è il problema del dosaggio genico che è stato risolto dalle cellule con l'inattivazione del cromosoma X dove quindi una copia del cromosoma (in modo casuale) viene inattivato totalmente.

Un'altra evidenza dell'inattivazione del cromosoma sessuale è la distrofia di Duchenne che va a colpire un cromosoma X e quindi si manifesta molto più facilmente in un uomo piuttosto che in una donna. L'inattivazione è del tutto casuale e si manifesta a partire dalle prime fasi dello sviluppo dove le cellule di vari tessuti possono andare ad esprimere o meno un cromosoma o l'altro (e le relative forme mutate nel caso che siano presenti): le donne portatrici possono avere alcune cellule patologiche mutate ma sono in grado di compensare con quelle cellule che non presentano mutazioni sul cromosoma X risultando in un fenotipo normale. Il cromosoma X inattivato può essere osservato in un preparato istologico poiché forma eterocromatina in stretta prossimità della lamina nucleare che è importante proprio per l'organizzazione dell'eterocromatina.

Corpo di Barr

Il corpo di Barr ha caratteristiche sia dal punto di vista trascrizionale (i suoi geni non vengono trascritti) sia replicativo poiché è una delle parti del DNA replicate più tardivamente. L'eterocromatina ha dei comportamenti specifici diversi dall'eucromatina.

Il ruolo del corpo di Barr è stato chiarito da Marie Lyon, da cui il processo a cui va incontro il cromosoma X inattivato viene chiamato anche lionizzazione. È stato osservato che nei mammiferi (quelli che presentano determinazione del sesso dal cromosoma sessuale) le cellule esprimono trascrizionalmente solamente un cromosoma X, l'inattivazione del cromosoma X avviene durante l'embriogenesi, durante le prime fasi (non nello zigote) creando un mosaico di cellule da cui poi deriveranno poi i vari tessuti e organi che presentano il cromosoma X materno o paterno inattivato. La scelta di inattivazione viene poi mantenuta dalle cellule successive derivanti dalla stessa cellula iniziale, questo fa parte dei processi epigenetici e questo processo va oltre la semplice sequenza nucleotidica.

Esistono casi di aneuploidia con cromosomi X soprannumerali come sindrome con triplo X, in questi casi le cellule silenziano completamente due cromosomi X e si mostrano in preparato due corpi di Barr, sono particolarmente evidenti nei granulociti, dove il corpo di Barr sporge dal nucleo e risulta facilmente osservabile (a causa del nucleo polilobato tipico dei granulociti).

L'inattivazione del cromosoma X avviene ad opera dei lncRNA (che regolano la attività trascrizionale): all'interno del cromosoma X esiste un gene che si chiama XIST, il gene in questione codifica per un grande lncRNA, entrambi i cromosomi X trascrivono il lncRNA inizialmente e per fenomeni non particolarmente chiari uno dei due cromosomi inizia a produrre molto più RNA dell'altro, l'effetto del lncRNA è quello di andare a posizionarsi sopra il DNA del cromosoma stesso, ciò induce il richiamo di proteine per la super spiralizzazione che porta alla eterocromatizzazione del cromosoma X che ha espresso maggiormente lncRNA. I siti per i geni XIST sono presenti su entrambi i cromosomi ma il trascritto è particolarmente abbondante in quello che è il cromosoma X inattivato. XIST presenta un suo antagonista che produce anche esso un lncRNA a partire da un gene sul cromosoma X che controbilancia l'attività di XIST: il gene in questione (chiamato TSIX) lega la sequenza di XIST e ne impedisce la produzione di trascritto.

Il bilancio tra i due RNA e le loro interazioni determina quale dei cromosomi X verrà inattivata, questa interazione che si manifesta con una super spiralizzazione del DNA è casuale e avviene nelle fasi iniziali nello sviluppo, trasmettendosi di cellula in cellula creando l'effetto mosaico.

Per quanto riguarda l'eterocromatina facoltativa e l'eucromatina hanno quantità relative in diverse cellule a seconda del programma differenziativo della cellula stessa: partendo dalle prime cellule embrionali si nota una diminuzione dell'eucromatina e l'aumento dell'eterocromatina che accompagna proprio il momento differenziativo delle cellule nell'organismo in sviluppo quindi la presenza di eterocromatina è specchio dell'attività trascrizionale della cellula e dipende dal momento differenziativo della cellula in questione.

Gli istoni

Sono proteine molto abbondanti e molto conservate attraverso l'evoluzione, questo significa che sono proteine che si sono evolute molto precocemente negli eucarioti e hanno raggiunto un livello di specializzazione tale da far sì che fossero selezionate per essere mantenute in quanto tali: un caso esemplare di conservazione amminoacidica. Le proteine istoniche sono di cinque tipi: H1, H2A, H2B, H3, H4. Queste proteine sono caratterizzate da abbondanza di amminoacidi basici e conseguente abbondanza di cariche positive che permette una favorevole interazione aspecifica con il DNA.

Proteine non istoniche

Ci sono proteine strutturali ma molte sono proteine che regolano l'attività del DNA stesso: vari enzimi che agiscono sul DNA e varie proteine di controllo del DNA. Esse sono molto eterogenee all'interno dei diversi tipi cellulari perché la tipologia e la quantità dipende dal ruolo del tessuto (e della cellula) nell'organismo, perché proprio le proteine non istoniche determinano la differenziazione cellulare.

Due sono i gruppi principali di proteine associate al DNA:

• Le proteine istoniche dotate di amminoacidi basici che conferiscono alla molecola carica positiva, queste proteine si legano al DNA e mediano i primi passaggi del compattamento. Gli istoni sono tra le proteine più conservate (esse nel corso dell'evoluzione sono state selezionate inizialmente e lo sviluppo degli organismi ha favorito il mantenimento di queste molecole altamente specializzate senza importanti variazioni negli eucarioti).
• Le proteine non istoniche, cioè le proteine molto eterogenee e variabili nel nucleo con funzioni sia strutturali (coesine e condensine per esempio) sia di regolazione dell'attività del DNA (fattori di trascrizione).

Una sostanziale differenza sta nelle modalità di interazioni con il DNA, infatti le prime interagiscono prevalentemente grazie a interazioni elettrostatiche mentre le seconde riconoscono sequenze ben precise nel DNA e risultano quindi selettive rispetto alla sequenza nucleotidica su cui andranno ad agire.

Istoni

È una famiglia di proteine (proteine con caratteristiche comuni che svolgono la medesima funzione) contenente: H1, H2A, H2B, H3 e H4. C'è una certa abbondanza di amminoacidi di tipo basico, sono proteine di piccole dimensioni (30KDa c.a.) composte da all'incirca 200 amminoacidi. La capacità degli istoni di entrare in contatto con il DNA è data da carica elettrica (interazioni ioniche di tipo debole).

Tutti gli istoni hanno un dominio globulare a cui si associano una o due code (sempre una coda N-terminale e qualche volta una coda C-terminale), in N-terminale si trovano la maggior parte degli amminoacidi basici.

La prima osservazione sulla compattazione del DNA è stata relativa alla fibra di cromatina da 30nm o fibra di cromatina nativa: essa appare come costituita da strutture circa sferiche unite assieme e contiene una molecola di DNA. Trattando la fibra con ioni o con sostanze in grado di "rilassare" le interazioni ioniche permette di ottenere la cromatina decondensata, chiamata fibra di cromatina da 10nm a collana di perle, ciascuna sfera viene chiamata nucleosoma mentre i nucleosomi sono uniti da DNA linker (DNA nudo).

Il nucleosoma e la fibra di cromatina da 10 nm

È la prima struttura che si ritrova nell'organizzazione della cromatina all'interno del nucleo stesso, viene quindi chiamato primo livello di compattamento del DNA, esso è costituito da una struttura centrale di proteine (core proteico) sul quale il DNA si avvolge. Il core proteico forma un rocchetto sul quale il DNA si avvolge a doppio giro. Il core proteico è costituito da otto molecole di istoni contattate da 147 nucleotidi (sono in numero fisso).

La effettiva associazione costante di 147 bp è stata verificata ponendo la cromatina a collana di perle in una soluzione contenente enzimi digestivi che sono in grado di idrolizzare i legami del DNA linker lasciando solamente i nucleosomi, successivamente gli stessi possono essere trattati con una soluzione di sali (che modificano la forza ionica) da cui si ottiene la sequenza di DNA associata al core proteico, in seguito si può verificare che si tratti effettivamente di 147 paia di basi.

Oltre agli istoni H2A, H2B, H3 e H4 che formano il core proteico del nucleosoma è necessario anche l'istone H1 (che ha una coda N-terminale e una coda C-terminale) che si posiziona esattamente nel punto di entrata/uscita dalla particella, ciò facendo esso stabilizza l'interazione del DNA con il core proteico. Il DNA linker presenta anche esso una lunghezza stabile pari a 50 bp ottenendo nel complesso tra nucleosoma e DNA linker un insieme di 200 bp osservabili con una corsa elettroforetica opportunamente eseguita, nel complesso quindi il nucleosoma permette un accorciamento della molecola di DNA di quattro volte.

Gli istoni sono costituiti da alcuni domini cilindrici che sono sempre presenti nella parte globulare della molecola istonica (anche se in numero variabile in base all'istone considerato). H3 e H4 si trovano nella parte più centrale del core proteico mentre H2A e H2B sembrano "poggiare" più esternamente. L'interazione tra il DNA e il core proteico avviene sempre a livello dei domini globulari delle proteine istoniche, le code (che contengono la maggior parte della carica positiva) degli istoni fuoriescono dalla particella proteica, l'interazione delle particelle proteiche del core avviene prevalentemente a livello del solco minore del DNA, ciò si dimostra essere una peculiarità poiché normalmente il punto di contatto di molecole interagenti con il DNA è nel solco maggiore mentre gli istoni hanno un comportamento atipico. Questi solchi minori hanno preferenzialmente Adenine o Timine mentre i solchi minori non nel nucleosoma hanno solitamente Guanina e Citosina (per organizzazione sterica). Nel nucleosoma si osservano anche 142 ponti H che stabilizzano la struttura insieme a legami salini e legami idrofobici.

Le code sporgenti degli istoni interagiscono con il DNA dall'esterno andando a "circondare" la molecola di DNA con interazioni di tipo salino, esse sono poi sede di modificazioni post-traduzionali che interesseranno soprattutto le lisine modificando la carica elettrica della proteina modificando le interazioni del core proteico con la molecola di DNA.

Assemblaggio del core proteico

Il core proteico non si trova in quanto tale libero nel nucleo né tantomeno si osservano molecole istoniche libere, bensì gli istoni si presentano sotto forma di dimeri: H2A-H2B e H3-H4. L'assemblaggio prevede l'unione di due dimeri H3-H4 a formare un tetramero H3-H4, successivamente si legano i due dimeri H2A-H2B a completare.