Documento completo per esame di Biologia med 3-4

BIOLOGIA

UNIPD 2015/2016

CORSO DI LAUREA

MEDICINA E CHIRURGIA 1

LA CROMATINA

La cromatina è tutto il materiale che si trova all'interno del

nucleo, quindi il contenuto del nucleo è la cromatina. Essa è

costituita da DNA, proteine e RNA, la cromatina è un insieme

complesso di macromolecole in cui una grossa parte è di DNA.

La cromatina ha aspetti diversi che variano nei diversi LIVELLI

DI COMPATTAMENTO DEL DNA, le molecole di DNA nel

nucleo si organizzano tramite le sue interazioni con proteine in

un modo molto ordinato e con passaggi successivi ordinati,

questi livelli di compattamento sono non solo necessari per

permettere a tutto il DNA di rimanere nel nucleo ma anche per

regolare l'attività del DNA. Questi livelli di compattamento non

sono stati: durante la vita di una cellula il modo in cui il DNA si

compatta nel nucleo cambia.

La cromatina è composta da 40% da DNA, 44% da proteine istoniche, 13% proteine acide non

istoniche e 4% di RNA stabilmente legato al DNA. La cromatina è quindi principalmente costituito

da proteine istoniche e DNA. Il DNA è sempre sotto forma di cromatina nel nucleo, quindi

interagisce sempre con la sua componente proteica. La componente proteica degli istoni è un

insieme di proteine diverse caratterizzate da una elevata basicità (particolarmente ricche in

amminoacidi basici). Le proteine istoniche hanno funzioni strutturali ma anche regolative per

quanto riguarda il DNA: strutturali perché mediano le fasi iniziali del compattamento, regolative

perché il compattamento si ripercuote sulla possibilità di trascrizione dei geni compattati.

L'interazione degli istoni con il DNA è prevalentemente di tipo ionico (non esclusivamente però). Le

proteine non istoniche sono proteine che hanno interazioni, strutture diverse e costituiscono quindi

un gruppo eterogeneo che può variare tra i vari tipi cellulari a seconda dello stato funzionale della

cellula, le proteine non istoniche hanno funzione sia strutturale che regolativa: strutturale perché

aiutano il DNA a raggiungere livelli superiori di compattamento, regolative perché interagiscono

con il DNA regolano l'attività trascrizionale ( e.g. i fattori di trascrizione).

La differenza principale tra proteine istoniche e proteine non istoniche sta nell'interazione con il

DNA: le prime sono aspecifiche e legano il DNA in quanto esso è carico negativamente mentre le

seconde riconosco sequenze specifiche e selezionano sequenze specifiche dove andranno a

legarsi, questo fa si che le proteine non istoniche abbiano target specifici, non si legano in modo

casuale ma a sequenze date.

Il compattamento del DNA è molto differente tra procarioti e eucarioti: il compattamento è

estremamente diverso e seppur entrambi vadano incontro a fenomeni di compattazione e

organizzazione lo fanno in modo molto diverso: il DNA procariotico non ha mai interazioni con

proteine istoniche, quindi nei procarioti non esistono le proteine istoniche (mentre negli archea

esistono gli istoni). Gli eucarioti hanno molti cromosomi (molte molecole di DNA ciascuna lineare).

Le molecole sono in grado di organizzarsi in un volume piuttosto piccolo in un modo ordinato: si

può quindi dedurre che l'organizzazione del DNA nel nucleo è un processo preciso e delicato in

modo che i cromosomi non si incrocino, non si intersechino, non siano più accessibili alla

trascrizione. IL NUCLEO È UNA STRUTTURA ALTAMENTE ORGANIZZATA.

Il DNA eucariotico è molto lungo (qualche miliardo di bp) e ad opera degli istoni e delle proteine

non istoniche è possibile far stare il DNA nel nucleo, le proteine fanno diminuire di dimensioni il

DNA di diecimila volte per farlo stare nel nucleo. Il DNA nel nucleo eucariotico non si trova in una

forma lineare ma è una forma che è più accorciata che va sotto il nome di

SUPERSPIRALIZZAZIONE quindi la molecola di DNA viene avvolta in modo tale da occupare il

minor spazio possibile, questo processo però è reversibile: la cellula avvolge il DNA con delle

interazioni che possono essere "facilmente" modificate, ciò è essenziale perché la molecola sia

accessibile per la trascrizione e per la divisione cellulare. 2

I significati del compattamento del DNA sono:

-significato sterico (la riduzione delle dimensioni)

-protezione (il compattamento dipende dalla presenza o meno dell'involucro nucleare perché è

importante come sistema di protezione da forze esterne)

-regolativo (il compattamento regola l'attività trascrizionale del DNA rendendolo o meno

accessibile alla trascrizione da RNA pol)

Osservando un nucleo in base al livello di

compattamento possiamo suddividere la sua

cromatina in due grosse categorie:

l'eucromatina (la cromatina meno compatta che è

quella cromatina che contiene dei geni e ha attività

trascrizionale--> ci sono geni che sono in quel

momento sottoposti a trascrizione)

l'eterocromatina (la cromatina che nel momento

dell'osservazione è più compatta e non ha attività

trascrizionale)

L'eterocromatina è suddivisibile a sua volta in due

porzioni:

costitutiva

• facoltativa

•

La differenza sostanziale tra le due è che

l'eterocromatina costitutiva non contiene alcun gene, una piccola parte del genoma è costituita da

geni mentre la gran parte del genoma non contiene geni. Una parte di questi non geni hanno

funzioni strutturali (ma non solo) importanti quali i telomeri e i centromeri (porzioni terminali e futuro

sito d'attacco del fuso mitotico). L'eterocromatina facoltativa presenta geni ma essi sono silenziati

(trascrizionalmente inattivi) nel preciso momento in cui la cellula viene osservata. Sono geni

volontariamente inattivati dalla cellula nel suo programma differenziativo, i geni possono essere

riattivati se la cellula necessita di trascrivere un gene silenziato, la riattivazione può avvenire per

stimoli esterni o per necessità differenziative cellulari. Fanno parte dell'eterocromatina facoltativa i

CORPI DI BARR che sono i cromosomi X inattivati negli organismi di sesso femminile: i mammiferi

di sesso femminile hanno due cromosomi X mentre quelli di sesso maschile ne contengono

solamente uno.

Il dosaggio genico-->la quantità di espressione necessaria di un dato gene: per quanto riguarda gli

autosomi, esistono due copie ciascuna delle quale trascrive il suo gene mentre nei cromosomi

sessuali presentano una trascrizione che non corrisponde alla normale trascrizione della copia di

geni, questo per far si che tra individui di sesso maschile e di sesso femminile ci sia una simile

quantità di geni trascritti a partire dal cromosoma X, questo è il PROBLEMA DEL DOSAGGIO

GENICO che è stato risolto dalle cellule con l'inattivazione del cromosoma X dove quindi una copia

del cromosoma (in modo casuale) viene inattivato totalmente.

Un'altra evidenza dell'inattivazione del cromosoma sessuale è la DISTROFIA DI DUCHENNE che

va a colpire un cromosoma X e quindi si manifesta molto più facilmente in un uomo piuttosto che in

una donna.

L'inattivazione è del tutto casuale e si manifesta a partire dalle prime fasi dello sviluppo dove le

cellule di vari tessuti possono andare ad esprimere o meno un cromosoma o l'altro (e le relative

forme mutate nel caso che siano presenti): le donne portatrici possono avere alcune cellule

patologiche mutate ma sono in grado di compensare con quelle cellule che non presentano

mutazioni sul cromosoma X risultando in un fenotipo normale. Il cromosoma X inattivato può

essere osservato in un preparato istologico poiché forma eterocromatina in stretta prossimità della

lamina nucleare che è importante proprio per l'organizzazione dell'eterocromatina. 3

Il corpo di Barr ha caratteristiche sia dal punto di vista trascrizionale (i suoi geni non vengono

trascritti) sia replicativo poiché è una delle parti del DNA replicate più tardivamente.

L'ETEROCROMATINA HA DEI COMPORTAMENTI SPECIFICI DIVERSI DALL'EUCROMATINA

Il ruolo del corpo di Barr è stato chiarito da Marie Lion, da cui il processo a cui va incontro il

cromosoma X inattivato viene chiamato anche LIONIZZAZIONE. È stato osservato che nei

mammiferi (quelli che presentano determinazione del sesso dal cromosoma sessuale) le cellule

esprimono trascrizionalmente solamente un cromosoma X, l'inattivazione del cromosoma X

avviene durante l'embriogenesi, durante le prime fasi (non nello zigote) creando un MOSAICO di

cellule da cui poi deriveranno poi i vari tessuti e organi che presentano il cromosoma X materno o

paterno inattivato. La scelta di inattivazione viene poi mantenuta dalle cellule successive derivanti

dalla stessa cellula iniziale, questo fa parte dei processi epigenetici e questo processo va oltre la

semplice sequenza nucleotidica.

Esistono casi di aneuploidia con cromosomi X soprannumerali come sindrome con triplo X, in

questi casi le cellule silenziano completamente due cromosomi X e si mostrano in preparato due

corpi di Barr, sono particolarmente evidenti nei granulociti, dove il corpo di Barr sporge dal nucleo

e risulta facilmente osservabile (a causa del nucleo polilobato tipico dei granulociti)

L'inattivazione del cromosoma X avviene ad opera dei lncRNA (che regolano la attività

trascrizionale): all'interno del cromosoma X esiste un gene che si chiama XIST, il gene in

questione codifica per un grande lncRNA, entrambi i cromosomi X trascrivono il lncRNA

inizialmente e per fenomeni non particolarmente chiari uno dei due cromosomi inizia a produrre

molto più RNA dell'altro, l'effetto del lncRNA è quello di andare a posizionarsi sopra il DNA del

cromosoma stesso, ciò induce il richiamo di proteine per la super spiralizzazione che porta alla

eterocromatizzazione del cromosoma X che ha espresso maggiormente lncRNA. I siti per i geni

XIST sono presenti su entrambi i cromosomi ma il trascritto è particolarmente abbondante in quello

che è il cromosoma X inattivato. XIST presenta un suo antagonista che produce anche esso un

lncRNA a partire da un gene sul cromosoma X che controbilancia l'attività di XIST: il gene in

questione (chiamato TSIX) lega la sequenza di XIST e ne impedisce la produzione di trascritto.

Il bilancio tra i due RNA e le loro interazioni determina quale dei cromosomi X verrà inattivata,

questa interazione che si manifesta con una super spiralizzazione del DNA è CASUALE e avviene

nelle FASI INIZIALI NELLO SVILUPPO, TRASMETTENDOSI DI CELLULA IN CELLULA creando

l'effetto mosaico.

Per quanto riguarda l'eterocromatina facoltativa e l'eucromatina hanno quantità relative in diverse

cellule a seconda del programma differenziativo della cellula stessa: partendo dalle prime cellule

embrionali si nota una diminuzione dell'eucromatina e l'aumento dell'eterocromatina che

accompagna proprio il momento differenziativo delle cellule nell'organismo in sviluppo quindi la

presenza di eterocromatina è specchio dell'attività trascrizionale della cellula e dipende dal

momento differenziativo della cellula in questione.

GLI ISTONI

Sono proteine molto abbondanti e molto conservate

attraverso l'evoluzione, questo significa che sono

proteine che si sono evolute molto precocemente negli

eucarioti e hanno raggiunto un livello di specializzazione

tale da far si che fossero selezionate per essere

mantenute in quanto tali: un caso esemplare di

conservazione amminoacidica.

Le proteine istoniche sono di cinque tipi: H1, H2A, H2B,

H3, H4. Queste proteine sono caratterizzate da

abbondanza di amminoacidi basici e conseguente

abbondanza di cariche positive che permette una

favorevole interazione aspecifica con il DNA. 4

PROTEINE NON ISTONICHE

Ci sono proteine strutturali ma molte sono proteine che regolano l'attività del DNA stesso: vari

enzimi che agiscono sul DNA e varie proteine di controllo del DNA. Esse sono molto eterogenee

all'interno dei diversi tipi cellulari perché la tipologia e la quantità dipende dal ruolo del tessuto (e

della cellula) nell'organismo, perché proprio le proteine non istoniche determinano la

differenziazione cellulare.

Due sono i gruppi principali di proteine associate al DNA:

-le proteine istoniche dotate di aa basici che conferiscono alla molecola carica positiva, queste

proteine si legano al DNA e mediano i primi passaggi del compattamento.

Gli istoni sono tra le proteine più conservate (esse nel corso dell’evoluzione sono state selezionate

inizialmente e lo sviluppo degli organismi ha favorito il mantenimento di queste molecole altamente

specializzate senza importanti variazioni negli eucarioti)

-le proteine non istoniche, cioè le proteine molto eterogenee e variabili nel nucleo con funzioni sia

strutturali (coesine e condensine per esempio) sia di regolazione dell’attività del DNA (fattori di

trascrizione)

Una sostanziale differenza sta nelle modalità di interazioni con il DNA, infatti le prime interagiscono

prevalentemente grazie a interazioni elettrostatiche mentre le seconde riconoscono sequenze ben

precise nel DNA e risultano quindi selettive rispetto alla sequenza nucleotidica su cui

andranno ad agire.

ISTONI

È una famiglia di proteine (proteine con caratteristiche comuni che svolgono la medesima

funzione) contenente: H1, H2A, H2B, H3 e H4. C’è una certa abbondanza di aa di tipo basico,

sono proteine di piccole dimensioni (30KDa c.a.) composte da all’incirca 200 amminoacidi. La

capacità degli istoni di entrare in contatto con il DNA è dato da carica elettrica (interazioni ioniche

di tipo debole).

Tutti gli istoni hanno un dominio globulare a cui si associano una o due code (SEMPRE una coda

N-terminale e qualche volta una coda C-terminale), in N-terminale si trovano la maggior parte degli

amminoacidi basici.

La prima osservazione sulla compattazione del DNA è stata relativa alla FIBRA DI CROMATINA

DA 30nm O FIBRA DI CROMATINA NATIVA, essa appare come costituita da strutture circa

sferiche unite assieme e contiene una molecola di DNA. Trattando la fibra con ioni o con sostanze

in grado di “rilassare” le interazioni ioniche permette di ottenere la cromatina decondensata,

chiamata FIBRA DI CROMATINA DA 10nm a collana di perle, ciascuna sfera viene chiamata

nucleosoma mentre i nucleosomi sono uniti da DNA linker (DNA nudo).

IL NUCLEOSOMA E LA FIBRA DI CROMATINA DA 10 nm

È la prima struttura che si ritrova nell’organizzazione della cromatina all’interno

del nucleo stesso, viene quindi chiamato primo livello di compattamento del

DNA, esso è costituito da una struttura centrale di proteine (core proteico)

sul quale il DNA si avvolge, il core proteico forma un rocchetto sul quale il

DNA si avvolge a doppio giro. Il core proteico è costituito da otto molecole di

istoni contattate da 147 nucleotidi (sono in numero fisso).

La effettiva associazione costante di 147 bp è stata verificata ponendo la

cromatina a collana di perle in una soluzione contenente enzimi digestivi che

sono in grado di idrolizzare i legami del DNA linker lasciando solamente i

nucleosomi, successivamente gli stessi possono essere trattanti con una

soluzione di sali (che modificano la forza ionica) da cui si ottiene la sequenza

di DNA associata al core proteico, in seguito si può verificare che si tratti

effettivamente di 147 paia di basi 5

Oltre agli istoni H2A, H2B, H3 e H4 che formano il core proteico del nucleosoma è necessario

anche l’istone H1 (che ha una coda N-terminale e una coda C-terminale) che si posiziona

esattamente nel punto di entrata/uscita dalla particella, ciò facendo esso stabilizza l’interazione del

DNA con il core proteico.

Il DNA linker presenta anche esso una lunghezza stabile pari a 50 bp ottenendo nel complesso tra

nucleosoma e DNA linker un insieme di 200 bp osservabili con una corsa elettroforetica

opportunamente eseguita, nel complesso quindi il nucleosoma permette un accorciamento della

molecola di DNA di quattro volte.

Gli istoni sono costituiti da alcuni domini cilindrici che sono sempre presenti nella parte globulare

della molecola istonica (anche se in numero variabile in base all’istone considerato).

H3 e H4 si trovano nella parte più centrale del core proteico mentre H2A e H2B sembrano

“poggiare” più esternamente.

L’interazione tra il DNA e il core proteico avviene sempre a livello dei domini globulari delle

proteine istoniche, le code (che contengono la maggior parte della carica positiva) degli istoni

fuoriescono dalla particella proteica, l’interazione delle particelle proteiche del core avviene

prevalentemente a livello del solco minore del DNA, ciò si dimostra essere una peculiarità poiché

normalmente il punto di contatto di molecole interagenti con il DNA è nel solco maggiore

mentre gli istoni hanno un comportamento atipico. Questi solchi minori hanno preferenzialmente

Adenine o Timine mentre i solchi minori non nel nucleosoma hanno solitamente Guanina e

Citosina (per organizzazione sterica).

Nel nucleosoma si osservano anche 142 ponti H che stabilizzano la struttura insieme a legami

salini e legami idrofobici.

Le code sporgenti degli istoni interagiscono con il DNA dall’esterno andando a “circondare” la

molecola di DNA con interazioni di tipo salino, esse sono poi sede di modificazioni post

traduzionali che interesseranno soprattutto le lisine modificano la carica elettrica della proteina

modificando le interazione del core proteico con la molecola di DNA

Assemblaggio del core proteico

Il core proteico non si trova in quanto tale libero nel

nucleo ne tanto meno si osservano molecole

istoniche libere, bensì gli istoni si presentano sotto

forma di dimeri: H2A-H2B e H3-H4.

L’assemblaggio prevede l’unione di due dimeri H3-

H4 a formare un tetramero H3-H4,

successivamente si legano i due dimeri H2A-H2B a

completare