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CAPPING

È il primo elemento di modificazione che prende luogo (perché

l’estremità 5’ è la prima ad essere formata) ed è tipico di tutti gli RNA

eucariotici prodotti dalla RNA pol II. La RNA polimerasi, appena viene

prodotto il 5’ ,recluta le proteine coinvolte nei processi di capping

grazie alla fosforilazione della serina 5 della sequenza amminoacidica

della coda C-terminale, successivamente la RNA pol si muove lungo il

gene.

Essa porta all’organizzazione del 5’ di RNA e produce un cappuccio

protettivo sul trascritto per evitare che venga digerito da esonucleasi

endogene. Il cappuccio viene formato con un legame particolare 5’- 5’

di un nucleotide modificato (una 7metilguanosina), il legame è

particolarmente forte e resistente all’azione esonucleasica.

Funzioni del cappuccio:

protezione dalle esonucleasi endogene

• riconoscimento da alcune proteine che medieranno la traslocazione

• verso il citoplasma

viene contattato dai ribosomi nel citoplasma in quanto segnale di un mRNA maturo e quindi

• destinato a traduzione

Enzimi che intervengono nel capping:

RNA trifosfatasi:Elimina un fosfato nel 5’ dell’RNA;

• Transferasi:Responsabile dell’unione dei due nucleotidi;

• Metiltransferasi:Aggiunge il gruppo metilico alla guanosina;

TAILING

Si tratta dell’aggiunga di una coda composta da molte

ripetizione della adenina, è un elemento tipico degli

mRNA. I fattori proteici necessari al tailing vengono

reclutati grazie alla fosforilazione della serina in

posizione 2 sulla sequenza di 7 amminoacidi della coda

C-terminale della RNA polimerasi II.

È determinata da un segnale di poliadenilazione

(AAUAAA) che è un segnale specifico posto a ~30

nucleotidi dal punto dove l’enzima deputato all’aggiunta

della coda poli A comincerà ad agire, due nucleotidi

specifici (tra cui una adenina speciale), a valle del

segnale di poliadenializione, segnalano il punto esatto

dove l’RNA deve essere tagliato.

È importante osservare che il punto di poliadenilazione

differisce dal segnale di poliadenilazione che è

differente dal punto di terminazione della trascrizione da

parte della RNA polimerasi. L’RNA prodotto in eccesso rispetto al sito di poliadenilazione , poiché

non presenta un cappuccio, viene rapidamente degradato.

Funzioni di poli A:

segnale di esportazione: veicola l’mRNA verso il NPC (NUCLEAR PORE COMPLEX);

• è un “modo” in cui l’RNA sopravvive nel citoplasma: tanto più è lunga la coda tanto più l’mRNA

• può permanere nel nucleo

segnale per la traduzione

• 33

Enzimi coinvolti nella poliadenilazione:

Poli A polimerasi

• Fattore di stimolazione:Permette la sequenza successiva di interazione dei fattori di specificità;

• Fattori di specificità : Danno specificità di posizione e di taglio attraverso i due nucleotidi di

• riconoscimento alla poli A polimerasi;

Alcune delle proteine coinvolte nel taglio andranno poi a “appoggiarsi” sulla coda di poli A

stabilizzandola e favorendo il trasporto attraverso il complesso del poro.

Esistono anche dei siti alternativi dei poliadenilazione, sono stati descritti dei casi in cui sono

presenti più siti di poliadenilazione: essi sono importanti perché a partire da uno stesso trascritto

primario permettono di ottenere trascritti maturi diversi e poi proteine differenti.

I siti di poliadenilazione multipli si trovano al 3’ utr solitamente tuttavia sono presenti anche in altre

posizioni.

GLI INTRONI

Inizialmente non era nota la presenza degli introni nei trascritti primari ma si era in grado

solamente di osservare delle differenze tra gli RNA nel nucleo (più grandi) e quelli nel citoplasma

(tendenzialmente più piccoli).

Procarioti: la sequenza del DNA, la sequenza dell’RNA e la sequenza della proteina sono

• assolutamente colineari.

Eucarioti: la sequenza del DNA, la sequenza dell’RNA e la sequenza della proteina non sono

• colineari, infatti sono presenti sequenze che sono mantenute inframmezzate a sequenze non

codificanti (ovvero gli introni).

Lo splicing è un fenomeno generale che avviene normalmente nei trascritti della RNA pol II

(avviene anche per le altre RNA polimerasi).

Gli introni:

Sono presenti in numero variabile e in lunghezza variabile all’interno di ciascun gene

Sono estremamente eterogenei

Nonostante l’estrema eterogeneità degli introni, il sistema di splicing in grado di riconoscere tutti gli

introni presenti in un trascritto primario e rimuoverli è sempre lo stesso. Ciò vuol dire che in tutti i

geni deve essere presente un segnale specifico che permette allo spliceosoma di riconoscere i

bounderies (ovvero tutti i confini esone-introne) e andare a rimuovere l’introne.

Due casi di splicing esplicativi sono:

β globina, essa è codificata da un gene compatto (di piccole dimensioni) con solo 3 esoni e 2

• introni, il tutto in 2000 paia di basi, gli introni sono brevi;

VIII fattore, il suo gene codifica per 26 esoni e 25 introni le cui lunghezze sono notevoli, tanto

• grandi da essere estremamente più grandi della sequenza esonica.

La distrofina è codificata da un altro gene esempio (vista la sua importanza nei processi

• patologici), esso contiene 79 esoni con caratteristiche di ridondanza (tanto è vero che forme

6

tronche sono ancora funzionali) e occupa circa 2x10 paia di basi.

LA SCOPERTA DEGLI INTRONI

Sono state utilizzate due categorie di molecole per arrivare alla scoperta della presenza di

sequenze non codificanti nel DNA:

Enzimi di restrizione: essi sono molti enzimi di origine batterica che hanno la capacità di

• tagliare molecole di DNA (endonucleasi), hanno delle specificità: agiscono su sequenze di DNA

specifiche e tagliano in posizione determinate in due modi:

- Blunt che crea due estremità di uguale lunghezza

- Sticky che crea due estremità di lunghezza ineguale

cDNA: partendo da un RNA si può produrre una molecola di DNA complementare (chiamata

• appunto cDNA) grazie all’utilizzo della trascrittasi inversa che è un enzima tipico dei virus. Si

fornisce un primer (costituito da una sequenza di timine in grado di riconoscere la coda poli A)

che viene usato dalla trascrittasi inversa per cominciare a sintetizzare cDNA da RNA maturo. 34

Utilizzando due specifici enzimi di restrizione BamH1 e EcoRI si è tagliata una sequenza di DNA

codificante per una proteina, si è così ottenuta una banda di circa 700 nucleotidi.

Contemporaneamente si è utilizzato un mRNA maturo per retro trascrivere la sequenza in cDNA,

successivamente sono stati utilizzati gli stessi due enzimi di restrizione e si è ottenuta una banda

di 70 nucleotidi.

Confrontando le due bande ottenute si è osservato come la seconda (derivante da un mRNA

maturo contenente quindi solo esoni trascritti)

Lo sviluppo delle tecnologie di microscopia elettronica ha

permesso di verificare con altri metodi la presenza degli

introni: sono state prodotte delle doppie eliche ibride

DNA/RNA, prima usando mRNA nucleari (quindi non

maturi) poi usando mRNA citoplasmatici (maturi). Le

ibridizzazioni con mRNA nucleare risultavano

completamente appaiate mentre quelle con mRNA

citoplasmatico hanno mostrato come ampie regione di

filamento di DNA non si appaiassero all’mRNA formando

delle anse abbastanza grandi.

Nell’uomo spesso gli introni non hanno una sequenza

breve, vanno da 100 a 2000 nucleotidi comunemente con

alcuni che sono più lunghi di 5000 paia di basi.

SPLICING

Lo splicing avviene mentre la RNA polimerasi sta trascrivendo l’mRNA grazie allo spliceosoma

che viene reclutato grazie a la fosforilazione della serina in posizione 2 sulla catena

carbossiterminale della RNA polimerasi II.

Struttura dello spliceosoma:

Costituito da snRNP U1, U2, U4, U5, U6 (small nuclear ribonucleo proteins), ovvero snRNA

• associati a proteine stesse

i principali snRNA che costituiscono lo spliceosoma si chiamano U1, U2, U4, U5 e U6

• gli snRNP sono simili fra di loro ma presentano delle variazioni distintive.

Gli snRNA vengono prodotti nel nucleo dalla RNA pol II, vengono modificati e nel nucleo vengono

contattati da una particolare esportina che si chiama CRN1, essa veicola snRNA nel citoplasma e

qui viene complessato con proteine a formare la snRNP, successivamente la particella completa

viene traslocata nel nucleo.

Gli spliceosomi riconoscono delle sequenze nei bounderies riconosciute come sequenze

consensus altamente conservate tra i diversi organismi.

Le sequenze consensus si localizzano prevalentemente alla fine degli esoni e alla fine degli introni.

I siti di fine esone e fine introne hanno nomi particolari: sito donatore di splicing che individua il

nucleotide 5’ dell’introne, sito accettore di splicing che individua il nucleotide 3’ dell’introne.

Esistono, oltre alle due posizioni di “inizio” e “fine” lochi che hanno ruoli importanti, quali una

specifica adenina che si trova leggermente spostata verso l’estremità 3’ nell’introne e ne permette

una corretta rimozione. 35

SEQUENZA DI EVENTI DELLO SPLICING

Le prime due particelle snRNP a intervenire nei

• processi di splicing sono U1 e U2, U1 riconosce il

primo nucleotide intronico in 5’, U2 riconosce

l’adenina nel punto di ramificazione e si posiziona

su di essa

U4/U6 forma un complesso che si muove assieme

• (U4 si accoppia sempre a U6 poiché esso è

l’inibitore di U6 che rimane inattivato fino a che non

viene reclutato sull’RNA, a quel punto U4 se ne va),

questo approccia U1 e U2 e li avvicina

U5 va a riconoscere il sito accettore di splicing

• L’introne viene trasformato in “un’ansa” che va a

• avvicinare i due esoni consecutivi

Il sito donatore di splicing (primo nucleotide 5’

• dell’introne) va a formare un legame 2’5’ anomalo

(che si può formare solo perché 3’ e 5’ sono già impegnati) con l’adenina riconosciuta da U5 (U5

avvicina il più possibile i due esoni e stabilizza il complesso stabilizzando la struttura

complessata interna degli esoni rendendoli disponibili a formare nuovi legami fosfodiesterici);

Formato questo legame il “laccio” così generato viene scisso nel sito accettore di splicing e

• rilasciato nel nucleo dove verrà rapidamente degradato da esonucleasi.

Gli snRNA contenuti nelle snRNP si vanno ad appaiare in modo sito-specifico poiché ciascuno

contiene una sequenza di RNA complementare alle sequenze consensus presenti nei siti donatori

e accettori di splicing: lo splicing si basa quindi sulla caratteristica degli acidi nucleici di associarsi

a sequenze complementari.

GLI mRNA

Un mRNA maturo presenta:

7metilguanosina (5’5’); 5 utr, sequenza codificante , 3’ utr, coda poli A

Il capping comincia appena RNA polimerasi libera la prima breve sequenza nucleotidica

Il tailing avviene solamente una volta che la RNA polimerasi ha finito di trascrivere ed è proprio

questo a provocare il distacco di una breve sequenza di RNA che non rientra nell’mRNA.

SPLICING ALTERNATIVO

Si tratta di un processo che permette di

ottenere vari mRNA maturi a partire da un

trascritto primario unico, esso è un processo

altamente regolato e preciso che può andare

a rimuovere o mantenere selettivamente

degli esoni.

Le tipologie di RNA che si possono ottenere

per splicing alternativo sono elevatissime.

Uno stesso trascritto, in tessuti differenti, può

produrre differenti mRNA tradotti: 36

mRNA: esone A-introne-esone B-introne-esone C-introne-esone D-introne-esone E-introne-

esone F

Trascritto maturo nella tiroide: A o B, C, D, E questa sequenza produce la calcitonina

• Trascritto maturo nell’ipotalamo: A o B, C, D, F questa sequenza produce CGRP (calcitonin

• gene-related peptide) .

Similmente avviene per la fibronectina: il pre-mRNA presenta due esoni che nel trascritto maturo

del fibroblasto vengono mantenuti mentre nell’epatocita entrambi gli esoni vengono rimossi

rendendo la proteina solubile. Complessivamente il gene della fibronectina origina 20 isoforme

diverse della proteina.

α tropomiosina costituisce un terzo esempio: a seconda del tessuto in cui viene trascritta

(muscolo scheletrico, muscolo liscio, fibroblasto, encefalo) produce una maturazione differente per

splicing alternato.

Un caso estremo di splicing alternativo si osserva nella molecola di adesione legata alla

sindrome di Down. All’interno del pre-mRNA sono presenti esoni fissi e esoni appartenenti a

diversi gruppi: 12 esoni A, 48 esoni B, 33 esoni C, 2 esoni D, mRNA maturo presenterà tutti gli

esoni fissi e un solo esone per ciascuna delle quattro classi, ciò permette di ottenere teoricamente

38016 diversi trascritti maturi.

TIPOLOGIE DI SPLICING ALTERNATIVI

Splicing a cassetta (come quelli appena visti)

• Splicing mutuamente esclusivo (la presenza di un esone esclude la possibilità di mantenere

• un altro esone)

Splicing con ritenzione degli introni (è possibile che alcune parti di introni rimangano nel

• trascritto maturo)

Splicing con promotore alternativo

SITI DI INIZIO DELLA TRASCRIZIONE ALTERNATIVI

Nei geni spesso si trova più di un sito della trascrizione, molti sono comunque raggruppati vicino

alla TATA box principale mentre in alcuni casi si osserva un sito di inizio alternativo in una

posizione differente: è possibile che TATA box si trovi in un introne (cosa comune) all’interno di un

gene.

Questo, insieme ai sistemi di splicing, splicing alternativi e siti alternativi di poliadenilazione

garantiscono alla cellula la capacità di produrre un’ampia gamma di proteine a partire da 23000

geni.

SEGNALI DI REGOLAZIONE DELLO SPLICING

Attivatori di splicing: Sono successioni di nucleotidi presenti all’interno degli esoni che

• vengono riconosciute da proteine specifiche chiamate SR (Serine and Arginine nell’alfabeto degli

amminoacidi) che indicano allo spliceosoma di agire sulle bounderies vicine.

Inibitori di splicing: Alcuni esoni contengono exon splicing silencer che inibiscono

• l’organizzazione dello spliceosoma sul confine dell’esone su cui sono posti, le sequenze sono

riconosciute dalle proteine hnRNP (heterogeneous nuclear ribonucleo particle);

Il bilancio tra enhancer e silencer va a stabilire il profilo di splicing tipico di una cellula: essenziali

sono le proteine di riconoscimento, esse vanno a determinare de facto la maturazione in ogni tipo

cellulare e sono espresse in modo specifico da ciascuna cellula.

Esistono inibitori e attivatori anche nelle sequenze introniche, esse agiscono sui confini degli

introni su cui sono posizionati inibendo o attivando il reclutamento dello spliceosoma allo stesso

modo. 37

MECCANISMI DI SPLICING SPECIALI

Spliceosoma minore (tipo U12):Utilizza snRNP U11 e U12 che vanno a sostituire il tradizione

• snRNA U1. Riconosce sequenze consensus leggermente diverse ed è particolarmente coinvolto

in alcune forme di splicing alternativo.

Trans splicing: Non è molto diffuso; permette l’unione di esoni provenienti da trascritti diversi a

• formare un mRNA maturo ibrido. Usa le snRNP tipiche con l’aggiunta di snRNP SL che permette,

a seguito della rimozione dell’introne, di unire due esoni non appartenenti allo stesso trascritto.

Il trans splicing è stato utilizzato per alcune terapie geniche:

Si fornisce alla cellula una sequenza mRNA contenente la parte di trascritto non funzionale

preceduta da un introne a monte dell’esone che si vuole andare a sostituire, snRNP SL lo

riconosce come esone utilizzabile nei fenomeni di splicing e lo va a unire alla prima parte del

trascritto producente un mRNA maturo funzionale.

Il sistema tuttavia ha una bassa efficienza e deve sempre avere all’interno delle cellule delle

sequenze di RNA da fornire per il trans splicing.

AUTOSPLICING

Esistono degli introni che sono in grado di togliersi da solo dal trascritto primario, sono divisi in due

gruppi:

gruppo 1: presentano delle caratteristiche particolari, essi anziché avere un’adenina nel punto di

• ramificazione presentano una guanina. La guanina va a interagire con il sito donatore di splicing

e successivamente l’introne si stacca come molecola

lineare. Viene effettuato solo da alcuni organismi.

Gruppo 2: sono estremamente simili agli introni normali,

• presentano un’adenina nel punto di ramificazione e

formano un cappio prima di separare l’introne. Questi

introni sono presenti nelle sequenze trascritte dal DNA

mitocondriale, nei funghi e negli archea.

Si pensa che il sistema di splicing eucariotico si sia evoluto

proprio dal fenomeno dell’autosplicing del gruppo 2, essi

presentano una struttura tipica che ravvia molto le strutture

organizzative degli introni eucariotici. 38

VANTAGGI EVOLUTIVI DEGLI INTRONI

Vantaggio evolutivo: gli introni sono stati mantenuti poiché essi hanno garantito dei vantaggi

evolutivi considerevoli: essi hanno permesso di suddividere una proteina in moduli in modo da

fungere da substrato di evoluzione per altre proteine attraverso il fenomeno dell’exon shuffling: gli

esoni possono essere così spostati da un gene a un altro potendo andare a creare nuove

caratteristiche di una proteina.

Questo aspetto viene confermato dal fatto che esistono le superfamiglie geniche, esse infatti sono

accomunate da domini proteici presenti in proteine con funzioni totalmente differenti (normalmente

1 esone= 1 dominio, a volte 2 esoni= 1 dominio).

Vantaggio funzionale: gli introni permettono, per i fenomeni visti in precedenza, di ottenere una

varietà di proteine, anche con funzioni molto differenti, a partire da uno stesso trascritto,

garantendo quindi una grande variabilità enzimatica a partire da un “ristretto” numero di geni.

LE TEORIE SULL’EVOLUZIONE DEGLI INTRONI

È necessario capire quando si siano evoluti gli introni se negli organismi più semplici (i batteri)

questi non sono mai presenti.

I primi introni si osservano negli archea e in alcuni eucarioti semplici che contengono solo brevi

sequenze introniche e in generale si osserva un mantenimento delle sequenze introniche.

Prima teoria

Gli introni sono stati sviluppati già nel progenota, a partire da questo si sono sviluppati due rami:

uno che a dato sviluppo agli eucarioti (e ha mantenuto gli introni) e l’altro che ha cominciato a dare

origine a archea e procarioti portando a una graduale perdita degli introni (al fine di velocizzare la

trascrizione e la maturazione e di compattare il DNA) vantaggiosa per organismi con un ciclo

cellulare breve (anche gli organismi eucariotici con un ciclo cellulare breve presentano pochi

introni).

Seconda teoria

Gli introni si sono sviluppati successivamente nel corso dell’evoluzione, a favore di questa teoria si

può sostenere che inizialmente quelli che oggi sono esoni, fossero ciascuno singoli geni codificanti

per una catena polipeptidica che poi si andava ad assemblare successivamente nel citoplasma

formando una struttura quaternaria.

SEQUENZE REGOLATIVE NEGLI INTRONI

Gli introni oltre alla essenziale funzione spaziatrice necessaria per la variabilità genetica possono

contenere, al loro interno, dei piccoli geni che codificano una proteina a parte (solitamente piccoli

geni codificanti per alcuni RNA di piccole dimensioni di cui ancora non si sono chiariti tutti i ruoli).

EDITING DELL’RNA

L’RNA maturo va incontro a altre modificazioni, si tratta di un fenomeno per cui nell’mRNA

messaggero vengono inserite, tolte, modificate singole basi. Caso tipico è la trasformazione della

citosina in uracile o la modificazione dell’adenina in inosina.

Questo può portare a modificazione del messaggio o del modulo di lettura.

Caso tipico di editing è quello del trascritto per apo B, se l’mRNA che codifica per la stessa non

viene sottoposto a editing produce una variante chiamate apo B100 (che si associa a VLDL e

LDL) che presenta acido glutammico in una data posizione, se l’mRNA viene sottoposto a editing

si produce un differente codone che non codifica per acido glutammico ma funge da codone di

stop, si genera una proteina tronca che viene chiamata apo B48 (si associa a chilomicroni). 39

PROTEINE CHE LEGANO L’RNA MATURO

proteine che riconoscono il CAP e lo legano

• proteine che riconoscono la coda di poli A e la legano (poli A binding protein o PABP)

• proteine che riconoscono i siti di splicing e vi si legano sopra (exon junction complex o EJC)

• proteine molto eterogene che legano l’RNA eterogeneo

Tutte queste proteine riconoscono parti che devono essere prodotte o trasformate in un fenomeno

di maturazione: il legame delle proteine con l’RNA maturo è importante per riconoscere un mRNA

che ha completato il suo processo di maturazione. Costituiscono un sistema di controllo sulla

maturazione dell’RNA. Esse serviranno per accompagnare l’RNA al complesso del poro e

raggiungere il citoplasma.

I prodotti della trascrizione, finiti, fanno tutti parte del TRASCRITTOMA mentre gli mRNA che

andranno incontro a traduzione entreranno poi a far parte del PROTEOMA una volta tradotto in

proteine, entrambi specifici per ogni cellula.

NEL COMPLESSO UN mRNA CI METTE 5-6 MINUTI PER ESSERE PRODOTTO COME

TRASCRITTO PRIMARIO MENTRE CI METTE ~20 MINUTI PER MATURARE IL DNA, LA

SUCCESSIVA TRADUZIONE PUÒ RICHIEDERE ALCUNE ORE. 40

rRNA e I RIBOSOMI

Sono complessi ribonucleoproteici costituiti da due

subunità, ciascuna con un rRNA e una componente

proteica, sussistono differenze tra ribosomi procariotici e

eucariotici:

i primi presentano 2 rRNA nella subunità maggiore e 1

• rRNA nella subunità minore,

i secondi presentano 3 rRNA nella subunità maggiore

• e 1 rRNA nella subunità minore.

Proteine più o meno complesse che si organizzano in

una struttura tridimensionale che produce la subunità,

essa viene poi traslocata nel citoplasma dove potrà

svolgere la sua funzione.

Le subunità rimangono normalmente separate e la

traduzione comincia prima con l’interazione della

subunità minore con l’mRNA e poi con la subunità

maggiore.

Gli rRNA sono sequenze nucleotidiche altamente conservate altamente specifiche, esse sono le

dirette responsabili della traduzione; il corredo proteico è estremamente variabile per ogni

organismo poiché le proteine non sono direttamente responsabili della traduzione ma la

coadiuvano.

Gli rRNA sono tutti caratterizzati da estensive strutture secondarie, sono organizzati spazialmente

in molte porzioni formando forcine, anse aperte e la strutturazione degli stessi negli eucarioti e nei

procarioti è molto simile, ciò significa che la struttura secondaria ha un ruolo fondamentale nel

funzionamento dell’RNA ribosomiale.

MATURAZIONE DEGLI rRNA

Una prima maturazione permette di passare da

rRNA 45S ai tre rRNA necessari alla cellula:

rRNA 45S inizialmente va incontro a fenomeni di

editing che portano modificazioni dei nucleotidi per

permettere agli rRNA di assumere una corretta

struttura secondaria, successivamente vengono

tagliati i singoli rRNA.

La maturazione degli rRNA avviene ad opera di

snoRNA che hanno attività catalitica specifica per

questi RNA.

Caratteristiche degli snoRNA:

esistono ~30 tipologie differenti di snoRNA

• assomigliano nella funzione agli snRNA

• hanno funzione catalitica

• per agire devono anche essi complessarsi in

• snoRNP (small nucleolar ribonucleo protein)

maturano il pre-RNA modificando specifici nucleotidi e tagliano le singole sequenze di RNA

• maturi

favoriscono le interazioni con le subunità proteiche

• agiscono tramite riconoscimento e appaiamento di basi complementari

• alcuni sono codificati da geni tradizionali, alcuni si trovano in geni presenti all’interno di introni di

• geni differenti, snoRNA U22 viene codificato da un gene a rovescio, ovvero che ospita negli

introni la sequenza per snoRNA ma una volta prodotti gli esoni, essi vengono degradati mentre

viene mantenuta la sequenza dello snoRNA. 41

LE MODIFICAZIONI DEL PRE-RNA

Le modificazioni sono principalmente due:

isomerizzazione dell’uridina a pseudouridina che porta alla

• formazione della base alternativa

metilazione che può avvenire su diversi nucleotidi

ASSEMBLAGGIO DELLE SUBUNITÀ RIBOSOMIALI

I tempi di produzione delle subunità sono nell’ordine della decina di

minuti.

L’assemblaggio prende luogo nell’area dell’organizzatore

nucleolare.

Il grande pre-rRNA viene maturato

I prodotti di maturazione vengono uniti alle subunità proteiche e

arriva anche rRNA 5S

Le subunità ribosomiali complesse raggiungono il complesso del

poro

Gli elementi vengono traslocati nel citoplasma

CODICE GENETICO

Esso si definisce: continuo, senza sovrapposizioni e senza punteggiatura.

È la codificazione di quello che è contenuto nel nostro genoma. È un linguaggio che utilizza 4

lettere che si organizza in “parole” cioè le triplette: entità che sono sequenze di tre nucleotidi che

vengono poi utilizzate come sistema di lettura del codice genetico.

Il DNA mantiene una organizzazione lineare: il DNA è lineare, l’RNA è lineare, le proteine sono

lineari.

Il codice genetico presenta URACILE e non TIMINA.

Nel codice genetico a parte metionina e triptofano, tutti gli altri amminoacidi sono identificati da più

di una tripletta.

La prima sequenza, oltre a costituire un segnale di inizio per la traduzione, identifica in modo

esclusivo l’amminoacido metionina.

I codoni di stop non codificano per alcuna proteina ma vengono identificati da complessi proteici

che innescano la dissociazione del ribosoma dall’mRNA e dalla catena proteica.

La determinazione del codice genetico è stata effettuata conoscendo il numero degli amminoacidi

presenti all’interno dell’organismo. Attraverso considerazioni matematiche di combinazione è

risultato infatti che 20 amminoacidi potevano essere identificanti univocamente da triplette: 4

amminoacidi in 3 “posti” permettono di ottenere 64 combinazioni (che è il numero di triplette

presenti nel codice genetico) in grado di essere tutte univocamente associate a un solo

amminoacido.

Inizialmente si è andato verificando se il DNA fosse dotato di punteggiatura ma molti esperimenti

hanno mostrato che le triplette si ripetono l’una dietro l’altra senza interruzioni e l’unica cosa che

guida la lettura del codice genetico è il modulo di lettura che individua la prima tripletta e

determina univocamente come verranno lette le triplette successive.

Si è verificato inoltre che matematicamente esistono 64 triplette codificanti con una ridondanza

delle stesse nel codice genetico (ovvero l’identificazione univoca per due triplette diverse di uno

stesso amminoacido) e va sotto il nome di degenerazione del codice genetico. 42

ESPERIMENTO DI BRENNER E CRICK

Sono stati i primi esperimenti che hanno dimostrato che il codice genetico funziona a triplette e che

non c’è presenza di punteggiatura, hanno utilizzato un tipo particolare di fago chiamato fago T4

(facilmente istruibile e facile da coltivare).

I ricercatori hanno creato dei fagi mutanti con singole eliminazioni (o aggiunte) di singole basi in

geni differenti.

Si è osservata poi il comportamento del gene mutante rispetto al wild type (ovvero la forma

normale): ciò che nel trascritto maturo si trovava a monte del nucleotide eliminato veniva letto

normalmente, quello che veniva letto a valle della mutazione cambiava completamente nella

traduzione.

Ripetendo l’esperimento con la eliminazione (o aggiunta) di 2 nucleotidi (anche non consecutivi) si

osservava lo stesso tipo di comportamento nelle varianti mutate.

Andando a rimuovere (o aggiungere) 3 nucleotidi con lo stesso principio si osserva come a seguito

del 1º nucleotide rimosso il messaggio cambi completamente mentre dopo il 3º nucleotide rimosso

la sequenza prodotta ritorni quella presente nel wild type (ovviamente considerando la mancanza

di una parte della traduzione).

ESPERIMENTO DI KHORANA

Questo esperimento ha confermato che il codice genetico è effettivamente costituito da triplette.

Il ricercatore ha creato dei messaggeri artificiali utilizzando nucleotidi specifici e traducendoli in

vitro in proteine:

ha utilizzato ripetizioni di due nucleotidi ottenendo l’alternanza di due amminoacidi nella

• traduzione

ha utilizzato ripetizioni di tre nucleotidi ottenendo la ripetizione di un singolo amminoacido

• ha utilizzato ripetizioni di 4 nucleotidi ottenendo così ripetizioni di 4 amminoacidi differenti

ESPERIMENTO DI NIRENBERG

Il ricercatore ha cominciato un lavoro preciso di determinazione del codice genetico:

ha cominciato a produrre degli mRNA contenenti triplette specifiche (a partire dai più semplici

AAAAAAAAA, UUUUUUUUU, GGGGGGGGG, CCCCCCCCC).

Successivamente alla determinazione dei primi amminoacidi, insieme a Leder, è andando a

decifrare tutte e 64 le combinazioni codificanti per gli amminoacidi.

Nirenberg e Leder hanno utilizzato alcune componenti cellulari tipiche: amminoacil-tRNA, singole

triplette di vario tipo, ribosomi. Essi hanno creato 20 miscele diverse di amminoacil-tRNA

ciascuna con un singolo amminoacido marcato radioattivamente, le miscele sono state mischiate

con triplette e ribosomi, così facendo i ribosomi interagivano con la specifica tripletta introdotta

andando a reclutare un solo tipo di amminoacil-tRNA formando un grosso complesso amminoacil-

tRNA-Ribosoma-tripletta. Per le 20 miscele sono state introdotte tutte le triplette passando poi gli

elementi attraverso una serie di filtri e andando a rilevare in qualche campione di tripletta si

rilevava una attività radioattiva residua (associando così in modo univoco una tripletta a un

amminoacido).

In questo esempio Nirenberg e Leder hanno supposto che le sequenze UAG, UGA e UAA

avessero un ruolo specifico seppur non riuscendo a capirne il ruolo.

CARATTERISTICHE DEL CODICE GENETICO

Presenta delle leggere variazioni nei diversi organismi

• Non è ambiguo in quanto ogni codone corrisponde a un solo amminoacido

• È degenere perché a un amminoacido si associano molteplici codoni, risultando quindi

• ridondante.

Le triplette simili codificano per amminoacidi con le stesse caratteristiche: acido glutammico e

aspartico presentano due nucleotidi su tre uguali con la variazione solamente del terzo, questo al

fine di tamponare eventuali danni da mutazione: se mutando un nucleotide si ottiene un

amminoacido simile si può diminuire il danno al funzionamento della proteina.

È universale

Esistono casi particolari per cui ci sono delle variazioni, come nel caso dei mitocondri. 43

Contiene codoni di inizio e codoni di stop

I codoni non senso (di stop) sono quelli che presentano la maggior variabilità tra gli organismi: per

vari motivi la cellula può aver perso la capacità di esprimere un tRNA relativo a un dato

amminoacido.

Gli amminoacidi che hanno più triplette che li rappresentano sono quelli che vengono normalmente

più espressi all’interno di una sequenza polipeptidica.

Il DNA mitocondriale, che viene letto in modo differente da quello nucleare, presenta una modalità

di traduzione differente e molto eterogenea tra le varie specie.

tRNA

Sono state avanzate diverse ipotesi sulla modalità di interazione tra

amminoacidi e mRNA:

una interazione diretta; esclusa perché molti amminoacidi presentano

• una catena ingombrante o idrofobica che difficilmente interagisce con

una molecola idrofilica

una modificazione degli amminoacidi temporanea che ne permettesse

• la temporanea capacità di agire con RNA, tuttavia risultava

improbabile

la presenza di una molecola mediatrice in grado di interagire

• facilmente interagire con i nucleotidi e con gli amminoacidi.

Il tRNA è una catena nucleotidica particolare in grado di legare sia gli

amminoacidi sia interagire con sequenze nucleotidiche.

Costituito da un singolo filamento di RNA lungo 70-90 nucleotidi con

due porzioni essenziali:

l’anticodone

• l’estremità 3’ che lega l’amminoacido stesso.

Ne esiste uno per ogni amminoacido almeno.

Ha una struttura secondaria tipica chiamata struttura a trifoglio determinata da editing con

sostituzioni specifiche che determinano la formazione di 3 anse e 1 stelo.

Capacità di associare univocamente un codone con un amminoacido.

Lo stelo è il sito accettore dell’amminoacido nella estremità 3’.

• L’anticodone contiene la tripletta complementare al codone che specifica per l’amminoacido

• bersaglio.

l’ansa T è un’ansa importante per l’interazione del tRNA con il ribosoma

• l’ansa D è importante per il caricamento dell’amminoacido sul tRNA ad opera della amminoacil-

• tRNA sintetasi.

Le altre componenti sono sequenze variabili in base al tRNA e all’organismo, fermo restando che

devono poter creare la struttura secondaria tipica (le varie sequenze costituiscono i bracci

variabili)

La sequenza CCA interviene nella reazione di caricamento dell’amminoacido, questa sequenza

viene aggiunta solamente in seguito alla formazione del RNA transfer dopo che è stata verificata la

corretta formazione dello stesso. CCA costituisce quindi un segnale di corretta formazione di tRNA

e se non è presente il tRNA non può interagire con la amminoacil-tRNA sintetasi.

Notevole abbondanza di nucleotidi modificati: pseudouridina, inosina, diidrouridina,

metilguanosina che producono appaiamenti non canonici essenziali per la struttura

tridimensionale.

I nucleotidi conservati costituiscono la componente fondamentale per il funzionamento del tRNA.

44

WOOBLE PAIRING

Si tratta di un fenomeno sia negli eucarioti sia nei procarioti (dove

è più flessibile) che porta alla riduzione effettiva del numero di

tRNA presenti (rispetto ai 61 dal modello teorico): questo perché

un anticodone può riconoscere più codoni dovuto a un

vacillamento del terzo nucleotide del codone e il primo nucleotide

dell’anticodone.

Il wobble pairing riguarda, de facto, il primo nucleotide dell’anticodone e l’ultimo nucleotide del

codone.

La tabella riporta quali interazioni sono possibili in base alla posizione sull’anticodone del primo

nucleotide.

Solo nel sistema di riconoscimento del codone-anticodone esiste questa flessibilità di

riconoscimento.

RUOLO DELLA REAZIONE DI FORMAZIONE DI AMMINOACIL-tRNA

L’unione di un amminoacido a un tRNA è un momento molto delicato e altamente controllato

poiché può ripercuotersi sull’interno sistema di traduzione. Esso assume due funzioni:

-adattatore in quanto esso costituisce il “vero” traduttore del messaggio portando con se uno

specifico amminoacido che può essere unito a specifiche sequenze nucleotidiche;

-energetica poiché l’unione dell’amminoacido con il tRNA sulla sequenza CCA 3’ terminale crea

un legame ad alta energia che costituirà la fonte energetica utilizzata nell’unione degli amminoacidi

a formare la catena polipeptidica nascente.

Il processo chimico è garantito dal complesso dell’amminoacil-tRNA sintetasi costituito da

proteine ATPasiche che assumono un ruolo di controllo (verificano la presenza della tripletta CCA).

Esistono 20 differenti amminoacil-tRNA sintetasi, ciascuna in grado di riconoscere tutti i tRNA che

portano un medesimo amminoacido. Il riconoscimento è dato da interazioni specifiche in posizioni

specifiche del tRNA (sullo stelo ci sono posizioni che permetto di riconoscere che sia il corretto

tRNA con cui entrare in contatto). Le zone di riconoscimento sono:

-una vicina alla sequenza CCA in 3’ terminale

-una parte dello stelo accettore

-una parte dello stelo dell’anticodone.

AMMINOACIL-tRNA SINTETASI

Classe I

Monomeriche o dimeriche

Legano l’amminoacido al carbonio in 2’ dell’adenina della sequenza CCA

Classe II

Dimeriche o tetrameriche

Legano l’amminoacido al carbonio 3’ dell’adenina della sequenza CCA

REAZIONE DI UNIONE AMMINOACIDO-

tRNA

Si svolge in due passaggi fondamentali:

energizzazione: l’amminoacido viene

riconosciuto dalla amminoacil-tRNA

sintetasi e viene legato a un ATP con il

rilascio di un pirofosfato inorganico

trasferimento: grazie al complesso della

amminoacil-tRNA sintetasi l’amminoacido

energizzato viene trasferito sul carbonio

corrispondente del tRNA con il rilascio di

AMP. 45

PROOFREADING

L’enzima può verificare, in modo altamente preciso, il sistema di

aggiunta dell’amminoacido e bloccarlo in due momenti precisi:

la parte di attivazione se ritiene di aver legato l’amminoacido

• scorretto mediante il riconoscimento conformazionale

bloccare la coniugazione tra amminoacido e tRNA

Entrambi i momenti vengono usati e attivati in modo diverso a

seconda dell’aminoacido in questione in base a un riconoscimento

conformazionale dell’amminoacido e del tRNA che può risultare

complesso se l’amminoacido ne presenta uno simile.

La amminoacil-tRNA sintetasi, sfruttando le variazioni

conformazionali prodotte sul tRNA dal legame con un

amminoacido, riconosce se l’amminoacido è quello corretto:

Se l’amminoacido inserito è corretto questo verrà ad essere

alloggiato in una tasca specifica del complesso, chiamato sito di

sintesi

Se l’amminoacido non è quello corretto esso non può rimanere nel

sito di sintesi e si sposta in un'altra tasca chiamata sito di editing

che provvede a scindere il legame del tRNA con l’amminoacido.

Ulteriore sistema di controllo è costituito dalla velocita di

associazione dell’amminoacido alla amminoacil-tRNA sintetasi:

solamente un amminoacido corretto è in grado di permanere nella

sintetasi il tempo necessario a indurre un cambiamento

conformazionale nella stessa che la faccia interagire con il tRNA,

altrimenti l’amminoacido, se incorretto, si dissocia più rapidamente

di quanto serva per farlo interagire con il tRNA.

Si stima che ci sia un errore

di caricamento del DNA

ogni 1000 reazioni.

Porta alla formazione di una

molecola lineare, dovuta

alla associazione di

amminoacidi l’uno dietro

l’altro in una sequenza

determinata a partire da una

molecola di RNA.

È un processo che ha un

bassissimo rateo di errore,

si può vedere come una

successione di eventi

semplici in cui molte

componenti differenti

devono cooperare fra di

loro: rRNA, mRNA, tRNA, le

proteine ribosomiali e

diversi fattori proteici che

organizzano il complesso di

traduzione e lo mantengono

attivo. 46

SINTESI PROTEICA

IL RIBOSOMA

Un ribosoma completo, costituito da entrambe le subunità ha una dimensione di 200 Å e copre 35

nucleotidi.

All’interno del ribosoma sono individuabili alcuni siti molto importanti:

sito P che alloggia il tRNA con la catena polipeptidica nascente (peptidil-tRNA)

• sito A si trova vicino al sito P ed è dove arriva l’amminoacil-tRNA specificatamente richiesto in

• base al codone dell’mRNA in quel momento

sito E dove si trova tRNA una volta che esso si è liberato della catena polipeptidica.

Lo studio tridimensionale ad alta risoluzione dei ribosomi ha permesso di comprenderne la

conformazione, prima di questi studi si pensava che la parte proteica fosse concentrata nella parte

profonda del ribosoma mentre gli studi hanno mostrato che nella parte profonda (e catalitica)

stanno gli rRNA mentre la parte proteica forma la zona periferica del ribosoma.

POLISOMI O POLIRIBOSOMI

Si tratta dell’associazione di molteplici ribosomi che vanno a disporsi in modo ordinato su uno

stesso mRNA, distanziati, in modo da poter produrre tutti quanti la componente tradotta senza

intralciarsi vicendevolmente.

PROCESSO DELLA SINTESI PROTEICA

Tutte le proteine vengono sintetizzate a partire

dall’N-terminale verso il C-terminale con direzione

di lettura 5’-3’ della molecola ribonucleotidica.

La catena polipeptidica nascente si trova legata

• al sito P

Entra nel sito A un amminoacil-tRNA con

• anticodone complementare al codone

Si forma il legame peptidico tra il gruppo

• amminico dell’amminoacil-tRNA e l’ultimo

gruppo carbossilico della catena polipeptidica

grazie a rRNA 28S che sposta la catena

polipeptidica dal tRNA in posizione P al tRNA in

posizione A.

Il ribosoma trasloca in direzione 3’ provocando

• uno spostamento del tRNA nel sito P al sito E e

lo spostamento del peptidil-tRNA dal sito A al

sito P. 47

Le fasi della sintesi proteica sono 3:

Fase di inizio che permette il riconoscimento della tripletta di inizio

• (AUG) che indica il punto preciso di inizio della traduzione. In questa

fase interviene un tRNA particolare chiamato tRNA iniziatore

insieme a un ventaglio ampio di fattori di inizio che sono molecole

proteiche che lavorano in modo coordinato per organizzare,

assemblare, posizione il ribosoma sull’AUG.

Fase di allungamento con cui il ribosoma inizia a leggere e a

• spostarsi di tripletta in tripletta allungando la catena polipeptidica. Il

ribosoma viene aiutato da dei fattori di allungamento che

permettono la traslocazione del ribosoma con idrolisi dell’ATP;

Fase di terminazione: il ribosoma sostanzialmente raggiunge i

• codoni di stop che non presentano alcun tRNA con un anticodone

ma che vengono riconosciuti da delle molecole proteiche chiamate

fattori di rilascio: riconoscono le triplette, si legano dove è il sito A,

inducono un cambiamento conformazionale del ribosoma, un taglio

della catena polipeptidica dal tRNA inducendo il rilascio del prodotto

di traduzione, la cessazione della sintesi proteica e la separazione

delle due subunità.

Tutti i processi richiedono energia e nel complesso c’è un importante

consumo energetico per produrre la proteina.

LA FASE INIZIALE

Prevede l’interazione della subunità minore con il tRNA iniziatore, una volta che il complesso si è

formato esso entra in contatto con mRNA e scorre fino a trovare la tripletta AUG, a quel punto di

ferma. Il tRNA iniziatore è l’unico tRNA che riesce a essere alloggiato direttamente nel sito P senza

essere agganciato a una catena polipeptidica oltre a presentare anticodone UAC (complementare

a AUG).

Fattori di inizio sono vari:

eIF (eukariotic initiation factor) 1 stabilizza il legame tra tRNA iniziatore e subunità minore (40

• S negli eucarioti)

eIF 3 stabilizza le subunità ribosomiali dissociate

• eIF 4B è un fattore importante nello srotolamento dell’RNA

• eIF 4E riconosce e lega il cap 5’ promuovendo il legame dell’mRNA alla subunità minore

• eIF 5 è responsabile del reclutamento della subunità maggiore (60 S

• negli eucarioti)

I fattori di inizio agiscono sull’mRNA svolgendo quelle che sono le possibili

strutture secondarie che l’RNA può acquisire per sue caratteristiche di

sequenza in modo che il ribosoma possa scorre senza intoppi sopra lo

stesso, permettono di cominciare la traduzione solamente se è presente il

cap 5’, reclutano e coadiuvano le subunità.

Il primo evento importante è la formazione del complesso ternario, esso

è costituito dal tRNA iniziatore e da eIF2 legato a GTP.

Il secondo evento è il congiungimento del complesso ternario con la

subunità minore che viene favorito da eIF1, eIF1A, eIF3, eIF 4C. Si forma

così il complesso di pre inizio o complesso 43S

Contemporaneamente l’mRNA viene contattato da eIF 4 (tutti i diversi) che

svolgono tutti i superavvolgimenti che potrebbero essersi creati ma anche

da fattori di inizio che legano il cap 5’ e la coda poli A 3’

L’mRNA complessato con i suoi fattori di inizio interagisce con il complesso

di pre inizio, questo ultimo si attacca in posizione strettamente prossimale

a dove si trova il cap. 48

Il complesso scorre sull’mRNA fino a che

non raggiunge il codone AUG, per muoversi

il complesso di pre inizio idrolizza GTP

legato a eIF 2.

Giunto sul codone start si distaccano eIF2 –

GDP e eIF5 che permettono così l’aggancio

della subunità maggiore, si forma così il

complesso di inizio

IL RUOLO DI eIF2

Permette di organizzare il complesso e fornisce energia legandosi al GTP.

Il complesso di pre-inizio riconosce AUG come codone di start poiché esso

è inserito all’interno di una sequenza nucleotidica (sequenza di entrata

del ribosoma) che viene riconosciuta da altri fattori che coadiuvano il

complesso in modo che non vada a riconoscere come codone star una

sequenza AUG della 5’ utr.

FASE DI ALLUNGAMENTO

A seguito del distacco di eIF2 e eIF5 si avvicina la subunità maggiore e i fattori di inizio vengono

rimossi e sostituiti da fattori di allungamento.

I tRNA cominciano a entrare nel sito A ma quelli incorretti, per mancanza di accoppiamento

chimico, non rimango il tempo sufficiente e quindi si applica solamente il tRNA con l’anticodone

corretto.

Viene attivata la componente catalitica (peptidiltransferasi) del ribosoma e l’energia per spostare

il complesso sui codoni e formare il legame peptidico viene fornita proprio dal legame altamente

energetico degli amminoacil-tRNA.

La formazione del legame peptidico, non richiede energia ed è un processo totalmente a carico

dell’rRNA 28S.

Lo spostamento non avviene contemporaneamente per le due subunità ma avviene prima per la

subunità maggiore e poi per la subunità minore. 49

FASE DI TERMINAZIONE

Il ribosoma prosegue nella sua attività di sintesi fino al codone di stop che non viene riconosciuto

da un tRNA ma da fattori di rilascio che si legano al sito A, idrolizzano una molecola di GTP

rilasciando l’ultimo tRNA e provocano la dissociazione delle due subunità ribosomiali.

DIFFERENZE TRA SINTESI PROTEICA PROCARIOTICA ed EUCARIOTICA

La sintesi proteica procariotica richiede al massimo 2-3 minuti, la sintesi eucariotica alcune ore

Gli mRNA procariotici sono spesso policistronici e ciascuna sequenza codificante viene tradotta da

un ribosoma.

La sequenza AUG scelta come sito di inizio della traduzione nei procarioti si trova in prossimità

della sequenza di Shine-Dalgamo, una sequenza di pochi nucleotidi che si trova la 5’ rispetto

all’AUG e presenta la peculiarità di avere una sequenza nucleotidica complementare a una parte

del rRNA 16S che costituisce la subunità ribosomiale minore nei procarioti, la sequenza di Shine-

Dalgamo permette una corretta individuazione della sequenza AUG di start.

FATTORI DI INIZIO PROCARIOTICI

I fattori di inizio procariotici sono solamente 3:

IF 3 permette il legame della subunità minore al mRNA impedendo il legame con la subunità

• maggiore (deve quindi essere eliminato per assemblare il ribosoma);

IF 2 lega un GTP, questo favorisce poi l’entrata del tRNA iniziatore (formilmetionina tRNA),

• l’idrolisi del GTP permette di proseguire con l’attività di traduzione. La formilmetionina si associa

al codone start negli organismi procariotici (gli archea condividono con gli eucarioti un tRNA

iniziatore a metionina). Essa può essere poi mantenuta eliminando il formile oppure può essere

completamente eliminata da una amminopeptidasi sicché la catena polipeptidica matura

comincerà con il secondo amminoacido inserito.

Complessivamente la fase di inizio vede l’ingresso di IF2-GTP associarsi al tRNA iniziatore per poi

associarsi alla subunità minore del ribosoma, associare l’mRNA, cercare il codone start presso la

sequenza di Shine-Dalgamo ed infine essere raggiunta dalla subunità maggiore del ribosoma.

FATTORI DI ALLUNGAMENTO

Sono importanti perché stabilizzano e velocizzano il sistema.

EF-Tu lega GTP e contemporaneamente si lega a amminoacil-tRNA, l’idrolisi di GTP porta alla

• rotazione del tRNA che induce un avvicinamento ulteriore dell’amminoacido alla catena

polipeptidica nascente. L’idrolisi di GTP avviene solamente quando c’è un corretto appaiamento

codone-anticodone.

EF-Ts

• EF-G

FATTORI DI TERMINAZIONE

RF1, RF2, RF3 che hanno specificità per quanto riguarda 1 e 2 (riconoscono sequenze specifiche

e diverse), 3 lega GTP e favorisce la dissociazione del complesso Ribosoma-tRNA-catena

polipeptidica

ANTIBIOTICI: Molti antibiotici ad oggi in uso hanno come bersaglio specifico il ribosoma stesso

impedendo la traduzione di proteine batteriche, le molecole farmacologiche sono state elaborate

grazie all’analisi approfondita che è stata effettuata sulle strutture ribosomiali.

Tetraciclina

• Streptomicina

• Rifamicina

Gli antibiotici, oltre a bersagliare i ribosomi batterici, possono tuttavia interagire anche con cellule

proprie avendo degli effetti collaterali (interferiscono con i ribosomi batterici presenti nei mitocondri

delle cellule eucariotiche). 50

GLI ERRORI DELLA SINTESI PROTEICA

I ribosomi possono compiere degli errori:

i. Il ribosoma inserisce un amminoacido incorretto ogni diecimila circa;

ii. Il ribosoma può erroneamente spostarsi solo di uno, due o quattro nucleotidi, con una

frequenza di uno ogni cento mila nucleotidi, modificando il modulo di lettura;

iii. Il ribosoma può non riconoscere un codone di stop traducendo il 3’ utr, si tratta di un errore

abbastanza raro con l’inserimento di alcuni amminoacidi come il triptofano (che viene codificato

da una tripletta simile al codone di stop);

iv. Il ribosoma può agire normalmente ma su un trascritto mutato che produce una proteina

mutata, esistono diverse mutazioni relative ai codoni:

- le mutazioni missenso portano al cambio di un nucleotide che può essere più o meno grave

a seconda che la mutazione sia conservativa o meno (sostituendo un codone con uno

codificante per un amminoacido della stessa tipologia o meno).

- Le mutazioni dissenso sono mutazioni che modificano una tripletta in modo che diventi un

codone di stop, il ribosoma lo riconosce e può non produrre alcuna proteina (se il codone

si trova all’inizio della sequenza) o produrre una proteina tronca che può o svolgere una

parte delle sue funzioni o addirittura essere deleteria andando a sottrarre proteine normali

prodotte dall’altro allele alle funzioni cellulari risultando in un dominante negativo.

- Le mutazioni frameshift con inserimento o delezione di un nucleotide sono piuttosto gravi

poiché modificano completamente il modulo di lettura andando a produrre un trascritto

con un significato totalmente diverso, solitamente inoltre la modificazione del modulo di

lettura si accompagnano alla individuazione precoce di codoni di stop che troncano il

prodotto di traduzione.

IL CONTROLLO DELLA CORRETTEZZA DELLA SINTESI PROTEICA

1) I fattori di inizio sono i primi elementi a verificare che un mRNA sia correttamente maturato,

andando a associarsi solo a elementi correttamente maturati.

2) Nei casi di ritenzione di introne in un trascritto di mRNA il ribosoma comincia comunque il

processi di traduzione ma arrivato nell’introne (che presentano tipicamente al loro interno una

sequenza di stop) si viene a trovare vicino a una exon junction complex a valle(le quali in un

trascritto normale vengono semplicemente scalzate dal ribosoma) e sopra un codone di stop,

in questa situazione il ribosoma richiama una serie di proteine chiamate UPF che interrompono

la traduzione, rimuovono il ribosoma dall’mRNA e degradano la sequenza che presentava la

ritenzione dell’introne. Il fenomeno prende il nome di decadimento mediato da nonsenso,

implica l’aggancio del ribosoma alla sequenza e il giro esplorativo della traduzione per cui il

primo ribosoma scorre lungo l’RNA per verificare che questo sia completamente maturato.

3) Il sistema di non stop decay interviene nel caso in cui la cellula si accorga che l’mRNA non

presenta un codone di stop, interviene una serie di proteine che induce il disassemblaggio del

ribosoma prima che questo arrivi alla coda di poli A e non sia più in grado di disassemblarsi. Il

sistema inoltre produce la degradazione dell’mRNA coinvolto.

4) Il sistema no go decay che è stato descritto da pochi anni, interviene quando l’mRNA forma

delle strutture secondarie che vanno a impedire lo scorrimento del ribosoma. Interviene un

corredo di proteine che indicano l’mRNA come non adeguato alla traduzione e ne stimolano la

degradazione. 51

RICODIFICA TRADUZIONALE

Essa permette di inserire amminoacidi particolari, nello specifico due amminoacidi ulteriori ai

normali 20 e poco rappresentati che vengono inseriti in modo altamente selettivo all’interno di una

sequenza nascente poiché i codoni vengono letti in modo alternativo (da cui il nome di ricodifica).

Uno dei due amminoacidi è la selenocisteina che viene prodotta a partire da una serina: la serina

viene legata a un particolare tRNA e successivamente va incontro a modificazioni per cui si

trasforma in selenocisteina. Il ribosoma, leggendo l’mRNA può incontrare un codone di stop che

non viene letto come tale ma come codificante per la selenocisteina; il ribosoma è in grado di

“capire” che codifica per una selenocisteina per la struttura SECIS (selenocisteine insertion

sequence) dell’mRNA. SECIS è una struttura secondaria che fa si che il codone di stop diventi un

codone significato (SECIS è coadiuvato da un fattore di allungamento speciale che riconosce

selenocisteina-tRNA.

L’altro amminoacido è la pirrolisina, essa si trova negli archea e anche in questo caso un codone

di stop viene usato come codone significato per la pirrolisina e anche in questo caso mRNA

presenta una particolare struttura chiamata PYLIS che permette al ribosoma di riconoscere il

codone di stop come codone significato.

BILANCIO ENERGETICO DELLA SINTESI PROTEICA

Caricare tRNA con amminoacido 2 legami fosfoanidridici

• Legare tRNA iniziatore e il ribosoma all’mRNA ~2 legami fosfoanidridici GTP

• 4 legami fosfoanidridici sono necessari per singolo amminoacido senza tenere conto dei processi

• di liberazione del ribosoma e di controllo che necessitano di ulteriore energia:

Per creare una proteina da 100 amminoacidi sono necessari ALMENO 400 legami fosfoanidridici

• (legami ad alta energia).

DESTINO DELLE CATENE POLIPEPTIDICHE

Ogni proteina ha un preciso destino nella cellula che dipende da dei segnali, costituiti da

amminoacidi, che permettono alla cellula di essere traslocata nel compartimento cellulare di sua

competenza.

Ad esempio:

NLS

• NES

• Peptide segnale (è segnale di secrezione sulla gran parte delle sequenze proteine appena

• prodotte che permette di traslocare le proteine dal RER –dove si trovano moltissimi ribosomi-)

L’associazione del peptide segnale a domini transmembrana produce proteine destinante

a essere proteine di membrana

L’associazione di peptide segnale, domini transmembrana e mannosio 6-fosfato (prodotto

nel trans Golgi network da una fosfotransferasi) nelle catene laterali della glicoproteina

costituisce il segnale recettoriale che porta gli enzimi a essere spostati nel lisosoma.

Kdel che è il segnale di ritenzione all’interno del reticolo endoplasmatico, tutti gli enzimi nel

• reticolo endoplasmatico ne sono dotati e ne permette il recupero quando gli enzimi seguono il

normale flusso a valle delle proteine.

Localizzazione mitocondriale, è un segnale complesso dato da molteplici amminoacidi che

• costituiscono una struttura tridimensionale che viene riconosciuto

MODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI

Glicosilazione

• Fosforilazione

• Idrossilazione

• Metilazione

• Lipidazione permette a una proteina senza domini transmembrana di ancorarsi alla membrana

• lipidica

Ubiquitinazione

• Proteolisi (tipico caso dell’insulina, dei collageni)

• 52

IL FOLDING DELLE PROTEINE NEOSINTETIZZATE

Le proteine devono ripiegarsi spazialmente e la cellula utilizza molta energia

per occuparsi del corretto ripiegamento al fine di ottenere un processo quanto

più preciso possibile.

Le proteine neoformate possono spontaneamente andare a ripiegarsi per le

interazioni delle catene laterali oppure possono essere assistite da delle

proteine chiamate HSP (Heat shock protein) che può lentamente andare a

acquisire la sua conformazione. Talvolta le HSP non sono comunque in grado

di permettere una corretta conformazione della proteina, in questi casi la

cellula “etichetta” la proteina errata in modo che venga degradata dal

complesso del proteosoma.

Le chaperonine sono un insieme di proteine (di cui fanno parte le HSP) che

permettono alla proteina di assumere la sua conformazione nativa e

funzionale, le due principali proteine chaperon sono Hsp70 e Hsp60 che

agiscono in momenti e modi diversi sulle proteine.

Hsp70 lega precocemente la catena polipeptidica mano a mano che viene

• prodotta dal ribosoma, il legame impedisce il folding proteico permettendo

così all’intera catena di essere formata prima di strutturarsi, una volta che la

catena polipeptidica è stata prodotta, Hsp70 si allontanano con idrolisi di ATP

e accompagnano la formazione dei legami chimici

Hsp60 formano delle strutture particolari formando delle camere. Le camere sono ambienti

• chiusi proteici in cui vengono inserite le proteine che vengono riconosciute come non

correttamente ripiegate (solitamente il riconoscimento avviene per l’esposizione atipica di alcuni

amminoacidi idrofobici sulla superficie esterna della proteina), si idrolizza l’ATP la cui energia

viene utilizzata per svolgere le interazioni incorrette, si riavvolge correttamente la proteina e

quindi la si lascia libera nell’ambiente cellulare. Il processo può avvenire più di una volta e se il

processo fallisce molteplici volte la proteina viene indirizzata al proteosoma. 53

Le proteine malfoldate hanno caratteristiche di solubilità diversa, sicché tendono a separarsi e

formare degli aggregati proteici (aggregati amiloidi) nella cellula che risultano dannosi (fino alla

morte cellulare). Si osservano proteine malfoldate in malattie neurodegenerative come Huntigton,

Alzheimer, Kreutzfeldt-Jacob.

IL PROTEOSOMA

È costituito da due parti

Un cilindro e due porzioni superficiali (due

“cappucci”), l’insieme è proteico e la parte più

profonda della componente cilindrica contiene una

serie di proteine che hanno attività proteasica.

Una proteina da degradare viene agganciata da un

cappuccio del proteosoma, passa nella parte

cilindrica dove viene scissa in peptidi di piccole

dimensioni, che vengono liberati nella parte opposta

e i peptidi vengono poi scissi a singoli amminoacidi

per essere riutilizzati.

UBIQUITINA

Le proteine da degradare vengono etichettate mediante una piccola proteina di ~70 amminoacidi

chiamata ubiquitina, essa si trova in tutte le cellule ed è altamente conservata in tutti gli

organismi eucariotici. L’ubiquitina possiede una coda di 7 residui di Lys che viene utilizzata o per

agganciare una proteina o per formare delle strutture multiple.

L’ubiquitina svolge più di un ruolo all’interno della cellula ad esempio essa oltre a etichettare le

proteine da degradare può interagire con le code istoniche nel nucleo, l’uso della Lys 48 per legare

proteine determina l’indirizzamento della proteina al proteosoma, diversamente, l’uso della Lys 63

assume importanza in processi biologici completamente diversi.

L’ubiquitinazione è un processo che avviene per passaggi successivi grazie a 3 differenti

complessi proteici: E1, E2, E3.

1. Attacco della ubiquitina a una Cys sul complesso E1, questo provoca una attivazione del

processo di ubiquitinazione

2. Il trasferimento della ubiquitina da E1 a E2. E2 (complesso di coniugazione) è normalmente

agganciato a E3 (ligasi)

3. Riconosciuta la proteina danneggiata il complesso E2/E3 trasferisce l’ubiquitina sulla proteina

54

E2/E3 costituisce un complesso associato e ne esistono diverse varianti che riconoscono differenti

errori sulle proteine.

Solitamente la degradazione è segnalata non da una singola ubiquitinazione ma da una

poliubiquitinazione.

METILAZIONE

I processi di metilazione dei nucleotidi sono dei fenomeni estremamente importanti in quanti

permetto di modificare un nucleotide senza dover andare a rimuoverlo o a sostituirlo.

La metilazione avviene nelle isole a CG (a citosina e guanina), le metilazioni in queste isole

producono pattern di metilazione che alterano l’espressione genetica.

DEGRADAZIONE degli mRNA NEL CITOPLASMA

La degradazione degli mRNA avviene rimuovendo la coda di poli A e rimuovendo il cap, la

privazione delle due strutture che lo etichettano lo rendono irriconoscibile dai fattori di inizio della

traduzione e da libero accesso a delle esonucleasi che danno inizio alla degradazione.

La rimozione della coda di poli A garantisce accesso a un insieme di proteine che si chiama

ESOSOMA che contribuisce a degradare l’mRNA presente nel citoplasma.

LA FERRITINA E LA TRANSFERRINA

Il ferro ha un ruolo essenziale per permette la sopravvivenza dell’uomo e esso va a spostarsi

nell’ambiente cellulare grazie a una serie di proteine che comprendono transferrina (raccoglie e

veicola il ferro), il recettore della transferrina (che permette l’aggancio della transferrina) e la

ferritina.

La transferrina lega il ferro, lega i propri recettori e entra nella cellula grazie a un processo di

endocitosi mediata da recettori, libera il ferro che viene poi preso dalla ferritina. La ferritina è un

grosso complesso proteico che può legare molteplici proteine.

La ferritina funge da “magazzino” di ferro per le necessità dell’organismo e la regolazione del ferro

presente nell’organismo risulta un processo altamente regolato vista la tossicità del ferro stesso.

La regolazione del ferro coinvolge gli mRNA per la transferrina e la ferritina e il recettore della

transferrina:

- mRNA del recettore della transferrina presenta nella regione finale 3’ una sequenza

chiamata sequenza IRE (iron response element) che in presenza di ferro permette

l’attività di una nucleasi che degrada quindi il recettore impedendo la formazione del

recettore per la transferrina, se non c’è ferro la sequenza IRE viene legata da IRE-BP

(binding protein) che protegge l’mRNA impedendo l’attività nucleasica

- mRNA della ferritina presenta sempre la sequenza IRE ma in 5’ e in presenza di normale

quantità di ferro non viene legata da nessuna proteina e va incontro a normale traduzione.

Quando i livelli di ferro diminuiscono considerevolmente la ferritina perde di significato (tutto

il ferro deve essere usato) e quindi la IRE-BP va a legare la sequenza IRE non

permettendo al ribosoma di cominciare la traduzione

miRNA e siRNA

Recentemente sono stati individuati ulteriori sistemi di controllo imputabili a miRNA e siRNA (i

quali sono stati individuati solo di recente viste le loro piccole dimensioni).

Costituiscono due tipologie di RNA di piccole dimensioni che vanno a agire come nei fenomeni di

interferenza da RNA: questo processo vede miRNA e siRNA come regolatori della permanenza

degli mRNA di cui sono responsabili.

Agiscono in due modalità:

-inducono la degradazione di mRNA

-impediscono la traduzione di mRNA

L’effetto complessivo è quello di rendere disponibile meno mRNA per la traduzione e agiscono

usando il sistema della complementarietà (tipico di tutti gli RNA).

Si stima che 1/3 dei geni umani siano controllati da miRNA e siRNA. 55

Gli miRNA sono stati scoperti grazie a degli studi effettuati sullo sviluppo muscolare di

Caenorhabditis elegans:

studiando lo sviluppo muscolare si è pensato di iniettare sulla cavia un mRNA di piccole dimensioni

(circa 20 nucleotidi) e il suo complementare andando a formare un duplex (doppio filamento

RNA). Si è osservato, sorprendentemente, un fenotipo muscolare solamente nel caso

dell’iniezione di entrambi gli elementi il fenotipo era chiaro.

Si è scoperto infatti come funzioni il sistema di controllo per i miRNA:

1. vengono trascritti i pri-miRNA (primary miRNA) a partire da introni di geni-ospiti (in

dipendenza quindi dei loro promotori) o a partire da geni propri con promotori specifici

2. I pri-miRNA formando strutture a forcina nel nucleo appaiando basi complementari

3. I pri-miRNA vengono scissi in pre-miRNA della lunghezza di circa 70 basi grazie a una RNA

endonucleasi III chiamata Drosha coadiuvata dal suo partner Pasha e formano nuove

strutture a forcina

4. I pre-miRNA vengono traslocati nel citoplasma dove Dicer si occupa di maturarli in miRNA che

formano una struttura duplex

5. Una delle due sequenze complementari viene poi incorporata nel complesso RISC (RNA-

induced silencing complex)

I miRNA incorporati in RISC agiscono poi con due metodi:

-complementarietà imperfetta

i miRNA legano una sequenza a loro complementare nella 3’ utr andando a bloccare l’espressione

genetica a livello post-trascrizionale

-complementarietà perfetta

i miRNA inducono un taglio dell’RNA impedendone l’espressione. Questi miRNA trovano sequenza

complementare nella Opening Reading Frame o nella sequenza codificante

miRNA vanno a costituire un sistema di controllo dell’espressione genica all’interno della cellula.

siRNA rappresentano invece un insieme di RNA prodotti a partire da molecole bicatenarie di grandi

dimensioni di RNA che normalmente sono silenti nei geni o sono espressi da patogeni (virus o

batteri). Essi agiscono interferendo specificatamente ed esclusivamente con un mRNA a

loro complementare che solitamente è estraneo alla cellula (visto che gli stessi siRNA sono

prodotti da sequenze atipiche e associate a elementi estranei); costituiscono quindi un sistema

di difesa cellulare da agenti patogeni esterni• È il processo cellulare con la più alta

accuratezza, ha una altissima fedeltà in modo che i pochi errori che vengono introdotti durante

il processo venga corretta durante la replicazione. -9 -10

• L’insieme dei sistemi di controllo permette una accuratezza di 10 o 10 , quindi un errore ogni

≈5 replicazioni

• Tutte le cellule devono replicare il DNA prima di replicarsi

• È un processo complesso che richiede numerosi enzimi e proteine regolatrici che ne hanno

permesso l’evoluzione come procedimento rapido, efficiente e preciso

• È un processo che richiede energia

• Si basa sull’appaiamento complementare delle basi che permette di ottenere due copie di DNA

a partire da una singola copia utilizzando i due filamenti complementari

• La replicazione è catalizzata dalla DNA polimerasi:

i. essa polimerizza deossiNTP in direzione 5’3’. Ciò è dovuto al fatto che la direzione 5’ 3’

è l’unica direzione che permette una corretta analisi della sequenza nucleotidica

e una eventuale correzione della stessa: se ipoteticamente si potesse polimerizzare

in 3’ 5’ si otterrebbe che una volta scisso il nucleotide incorretto si sarebbe rimossa

anche la testa energetica necessaria alla polimerizzazione di testa sicché la sequenza

prodotta non sarebbe più utilizzabile; invece con la polimerizzazione di coda (direzione

5’3’) si può sempre garantire la disponibilità di un singolo nucleotide trifosfato

disponibile a polimerizzare

ii. La DNA polimerasi riconosce esclusivamente i nucleotidi deossigenati in posizione 2’ 56

REPLICAZIONE DEL DNA

MODELLI DI REPLICAZIONE

Sono stati proposti diversi modelli sul

funzionamento della replicazione della

doppia elica del DNA.

Replicazione conservativa: il DNA viene replicato e i due filamenti neosintetizzati sono poi uniti

• a formare una nuova molecola di DNA;

Replicazione semi conservativa: il DNA viene replicato e si formano due molecole di DNA

• ibride composte da un filamento vecchio e un filamento nuovo;

Replicazione dispersiva: il DNA viene replicato e regioni vecchie e nuove dei filamenti vengono

• fusi assieme.

Il modello che è stato poi osservato è la replicazione semi conservativa che si verifica in tutti gli

organismi viventi.

ESPERTIMENTO DI MESELSON-STHAL 15

I ricercatori coltivarono dei batteri in un terreno contenente un isotopo dell’azoto (N ), in questo

modo i batteri per replicare il DNA dovevano usare l’azoto nel terreno di coltura producendo del

DNA pesante. 14

I batteri vennero trasferiti in un terreno contenente normale N e crearono una prima e una

seconda generazione. Separarono il DNA delle cellule di prima e seconda generazione e lo

ultracentrifugarono in una soluzione salina di cloruro di Cesio (utile per creare un gradiente ad

altissime velocità di centrifugazione) per due giorni. Si ottennero così sulle provette delle bande di

deposito dei sali (più in alto sulla provetta si trovavano le componenti più “leggere”) che

15 14

permettevano di capire la quantità di N e N presente nelle generazioni.

Nella prima generazione si osservò una banda intermedia tra quella dell’azoto pesante e quella

dell’azoto leggero, nella seconda generazione si osservò nuovamente una banda intermedia ma

oltre a questa si osservò una seconda banda corrispondente all’azoto leggero.

Basandosi su queste osservazioni, speculando sui diversi modelli solamente il modello della

replicazione semi conservativa spiegava i risultati dell’esperimento.

ESPERIMENTO DI TAYLOR

Utilizzò una cellula di una pianta come organismo per verificare la replicazione semi conservativa

negli eucarioti.

Taylor introdusse della desossitimidina trifosfato radioattiva (usò il trizio per osservare

l’emissione radioattiva) e osservò i cromosomi dopo aver permesso alla cellula di replicare

completamente il DNA e eseguire una replicazione cellulare (durante la mitosi). Osservò come

entrambi i cromatidi fratelli fossero marcati dalla timidina triziata.

Nel ciclo successivo fornì timidina non marcata e osservò che solo uno dei cromatidi era marcato,

l’altro no.

DIFFERENZE TRA REPLICAZIONE E TRASCRIZIONE

Entrambi i filamenti del DNA vengono copiati

• Tutto il DNA viene duplicato nel processo della replicazione

• La DNA polimerasi necessita di un innesco (negli eucarioti poiché nei procarioti il processo è più

• semplice dato che è applicato a una molecola di DNA circolare):

- l’enzima è in grado di iniziare la sintesi solo aggiungendo nucleotidi alla fine di un pezzo pre

esistente che agisce da innesco della reazione;

- l’innesco è costituito da un breve pezzo di RNA che viene eliminato dopo che la sintesi del

DNA è iniziata;

-un altro enzima si occupa di sintetizzare una breve sequenza (priming terminus) sufficiente a

stimolare della DNA polimerasi; 57

La DNA polimerasi, poiché per struttura controlla nucleotidi precedenti, necessita di un innesco e

non va a fare altro che unire i nucleotidi successivi. Il primer verrà in seguito degradato una volta

che la DNA pol si è spostata dal sito di inizio.

È sufficiente un breve tratto per stimolare la DNA polimerasi a agire e la DNA primasi (una

particolare RNA polimerasi) si occupa di fornire il breve tratto sotto forma di RNA, il motivo sta nel

fatto che gli RNA possono essere riconosciuti, rimossi e sostituiti da desossiribonucleotidi.

FORCELLA DI REPLICAZIONE

La replicazione avviene a partire da diverse regioni nel DNA chiamate

origini di replicazione che sono altamente regolate.

La replicazione prende luogo nella forcella di replicazione dove la

doppia elica viene scissa e si procede alla replicazione.

Entrambi i filamenti singoli vengono replicati ma in modi differenti

(perché la crescita del DNA avviene in una sola direzione) poiché essi

sono antiparalleli fra loro e la DNA polimerasi può polimerizzare solo in

direzione 5’3’, ciò significa che la forcella di replicazione è una forcella

asimmetrica.

Un filamento (3’5’) è sintetizzato in modo continuo –esso è il filamento

leader o leading strand-, l’altro viene copiato in modo discontinuo

(quello che rispetto al filamento leader si trova in 5’3’) - è il filamento ritardato o lagging strand-.

Il filamento ritardato sintetizza dei piccoli frammenti mano a mano che la forcella procede chiamati

frammenti di Okazaki che verranno poi saldati assieme per formare un filamento complementare

al filamento ritardato.

PASSAGGI DELLA REPLICAZIONE DEL DNA

1. Apertura della doppia elica e sintesi degli

inneschi: una elicasi apre la doppia elica

del DNA mentre avanti alla stessa una

topoisomerasi (posta più avanti dell’elicasi

sul doppio filamento) si occupa di rilasciare i

superavvolgimenti generati dall’apertura

della doppia elica. Le proteine SSB (single

strand binding) si legano ai filamenti singoli

impedendo loro di riavvolgersi o di formare

delle interazioni all’interno dello stesso

filamento. La DNA primasi sintetizza i

primer di RNA;

2. Allungamento: La DNA polimerasi si lega

agli inneschi e li allunga come nuovi

filamenti di DNA;

3. Rimozione degli inneschi: gli inneschi

vengono rimossi lasciando dei GAP;

4. Riempimento dei gap: il riempimento dei

GAP viene ad opera di un’altra DNA

polimerasi che però lascia un’interruzione tra

il 3’ del filamento che ha sintetizzato e il 5’

del filamento successivo (l’interruzione viene

chiamata nick);

5. Saldatura dei frammenti: una DNA ligasi si

occupa di unire il frammenti di DNA in

un'unica molecola continua di DNA.; 58

INTRODUZIONE ALLE DNA POLIMERASI

Si tratta di un tipo di proteina presente in diverse varianti sia negli eucarioti che nei procarioti,

svolge molteplici funzioni (replicazione, riparazione, ricombinazione), presenta 2 attività tipiche:

- Attività polimerasica in direzione 5’-3’, necessaria per la sintesi del DNA sfruttando dNTP

(desossinucleotidi trifosfato);

- Attività esonucleasica in direzione 3’-5’ necessaria per riparare gli errori di

polimerizzazione;

Le due attività sono mutuamente esclusive: quando l’attività polimerasica è in moto la attività

nucleasica non è in grado di intervenire.

DNA POLOMERASI PROCARIOTICHE

DNA polimerasi I si occupa della replicazione (5’-3’) e riempie i gap;

• DNA polimerasi II ripara il DNA (sintetizza 5’-3’, attività esonucleasica 3’-5’);

• DNA polimerasi III è l’enzima principale che si occupa della replicazione del DNA nei procarioti,

• essa allunga entrambi i filamenti;

DNA polimerasi IV coinvolta solo in casi particolari nella riparazione del DNA;

• DNA polimerasi V coinvolta solo in casi particolari nella riparazione del DNA;

DNA POLIMERASI EUCARIOTICHE

Sono state identificate 15 DNA polimerasi in diversi gruppi di eucarioti con funzioni altamente

specializzate:

DNA polimerasi α: Ha il compito di sintetizzare l’innesco (funge da RNA polimerasi) e allungarlo

• parzialmente prima di staccarsi (∅ attività nucleasica) creando l’initiator DNA (iDNA).

DNA polimerasi β: Implicata solo nella replicazione (∅ attività nucleasica), alta attività di

• proofreading;

DNA polimerasi γ: Enzima che si trova nei mitocondri degli eucarioti, viene codificata dal

• genoma mitocondriale e svolge funzioni di replicazioni indipendenti dalla replicazione nucleare

(sia attività polimerasica che nucleasica);

DNA polimerasi δ: Enzima che agisce sul filamento ritardato (sia attività polimerasica che

• nucleasica), ha una bassa processività;

DNA polimerasi ϵ: Enzima che agisce sul filamento leader (sia attività polimerasica che

• nucleasica), ha una elevata processività (capacità di aggiungere nucleotidi rapidamente senza

sganciarsi dal filamento);

DNA POLIMERASI III

La DNA pol III ha molte subunità, si occupa di replicare entrambi i

filamenti della forcella, è di dimensioni molto più elevate rispetto alle

DNA pol eucariotiche, questo perché deve replicare entrambi i filamenti.

La componente che presenta più subunità è la componente che va a

occuparsi della replicazione del filamento ritardato

Il core catalitico è formato da 3 subunità:

α con attività polimerasica, subunità

• ϵ fornisce l’attività esonucleasica e θ. Se si usa un core catalitico

• separato dal resto delle subunità questo è in grado di replicare lo

stampo fornito.

Il core catalitico si associa a formare una struttura dimerica chiamato Pol III*, l’associazione

avviene grazie a due subunità (una per ciascun monomero) τ. 1

Successivamente a Pol III* si unisce solamente da un lato un complesso γ,δ,δ ,ψ,χ (il quale

funge da clamp loader con una sua subunità) creando Pol III’.

L’oloenzima si forma a partire da Pol III’ insieme a delle subunità β che servono per creare lo

sliding clamp (o pinza molecolare) che servono a legare l’enzima ai filamenti stampo da ambo le

parti. 59

DNA POLIMERASI I

Si occupa di garantire il rimpiazzamento del primer a RNA fornito dalla primasi con una sequenza

di dNTP in modo tale da replicare tutto il DNA, comprese le origini di replicazione.

Essa ha attività nucleasica e polimerasica in direzione 5’-3’.

INTRODUZIONE ALLE DNA POLIMERASI EUCARIOTICHE

Le DNA polimerasi possono essere postate alle varie origini di replicazione grazie a un complesso

di proteine che si assembla continuamente chiamato MCM che permette a PCNA di associarsi allo

stampo fungendo da sliding clamp dove deve andare a legarsi la polimerasi per permettere la

produzione dell’innesco.

SCOPERTA DEL RUOLO DI DNA POL δ e ϵ

Si credeva che a seguito del distacco della DNA pol α si verificasse un polymerase switch in

modo da sostituire direttamente la pol α con la pol δ coadiuvata nel suo ruolo dalla DNA pol ϵ, non

era tuttavia chiaro come la DNA pol ϵ potesse essere coinvolta con il filamento ritardato. Si

pensava che la forcella di replicazione degli eucarioti contenesse una unità di DNA pol α e due

unità DNA pol δ o un complesso DNA pol δ/ϵ.

Dati più recenti hanno mostrato che il procedimento avviene esattamente al contrario dove la DNA

pol δ si occupa del filamento ritardato mentre DNA pol ϵ va a replicare il filamento leader.

DNA POLIMERASI TRANSLESIONE o POLIMERASI ANCELLE

Sono DNA polimerasi translesione servono per riparare particolari danni dove la DNA polimerasi

non è in grado di farlo, queste polimerasi hanno bassa accuratezza e introducono parecchi errori:

riparare il DNA è così importante per la cellula che è meglio avere DNA riparato incorrettamente

che avere DNA “corrotto”.

ACCURATEZZA DELLA REPLICAZIONE

La maggior parte degli errori introdotti durante la replicazione sono corretti proprio a partire dalla

DNA polimerasi (δ e ϵ solitamente negli eucarioti e III nei procarioti).

Gli errori più spesso introdotti e che vengono riconosciuti dal sistema di controllo sono forme

tautomeriche delle basi azotate che vanno a produrre alterazioni anormali. Una volta prodotte le

interazioni se la forma tautomerica atipica ritorna nella forma normale (cosa probabile visto che i

tautomeri non si presentano con uguale frequenza ma uno è preponderante) si forma un ingombro

sterico dovuto alla mancanza di interazioni che mostra alla DNA polimerasi che è presente un

errore nella sequenza dei nucleotidi.

Il riconoscimento di deformazioni steriche è il metodo più comunque utilizzato dalla DNA polimerasi

per verificare il corretto appaiamento delle basi

PROOFREADING DELLA DNA POLIMERASI

DNA pol possiede:

-core proteico

-finger domain

-palm domain

L’attività catalitica è garantita dalla regione del palmo e dal finger domain.

Nella regione del palmo c’è attività polimerasica e esonucleasica: forma con i suoi amminoacidi

dei legami H con i nucleotidi del solco minore del DNA, questi legami si formano solo se i nuovi

nucleotidi aggiunti sono correttamente appaiati; se dovesse essere inserito un nucleotide incorretto

si verificherebbe un rallentamento notevole del processo di polimerizzazione e il DNA sarebbe

lasciato libero di interagire con il sito esonucleasico presente nel palmo all’interno del core

proteico.

Il sito esonucleasico è in grado di agire solamente quando la base inserita è incorretta e la velocità

di polimerizzazione diminuisce quanto basta per far si che il sito nucleasico vada a “agire” più

velocemente sul sito polimerasico.

Una volta che il processo di correzione ha inserito il nucleotide corretto il processo riprende

normalmente e si riformano i legami H della proteina che procede con la polimerizzazione. 60

Il sito polimerasico ha una bassissima Km per l’attività di polimerizzazione (se l’appaiamento è

corretto, altrimenti km cresce considerevolmente)

Il sito esonucleasico invece ha una Km maggiore (10 volte maggiore)

Il nucleotide incorretto modifica la geometria dell'estremità 3' -OH, così il "palmo" della polimerasi

non è in grado di creare legami (bassa affinità per singolo filamento) mentre il sito esonucleasico

(affinità 10 volte maggiore per il singolo filamento) può legare il filamento a sequenza incorretta e

avviare l'attività esonucleasica.

L'incorretto appaiamento dei poni H fa si che non ci sia un corretto allineamento sterico tra due

molecole vicine della sequenza sintetizzata e quindi non possano creare un legame covalente 5' 3'

L’innesco permette all’attività polimerasica di prevalere sull’attività nucleasica, altrimenti ci sarebbe

un sostanziale equilibrio che non permetterebbe alla DNA polimerasi di svolgere il suo compito.

L’utilizzo di questo sistema di controllo permette di ottenere un errore ogni milione di nucleotidi

inseriti anziché ogni diecimila nucleotidi inseriti, tuttavia l’accuratezza della replicazione è più alta

rispetto a questa che va a rappresentare la capacità di limitare l’inserimento di errore a un livello

molto basso. 2+ 2+

Nel dominio del palmo sono presenti due ioni (Zn o Mg a seconda della DNA polimerasi) che

sono tenuti in posizione da due residui di acido aspartico (Asp), essi hanno due funzione differenti:

-

uno deve interagire con il 3’ –OH andando a ossidarlo e produrre un gruppo nucleofilo 3’ –O , l’altro

+

va ad agire con i gruppi fosfato del dNTP in arrivo producendo dNTP e queste interazioni vanno a

contribuire insieme a altre interazioni deboli nella verifica del corretto appaiamento tra il filamento e

il nucleotide trifosfato in ingresso.

Alcune modificazioni conformazionali contribuiscono a riconoscere il corretto nucleotide: quando

entra il dNTP complementare allo stampo una elica presente nel finger domain ruota di 40° e

passa nella sua conformazione chiusa, contemporaneamente gli ioni nel palm domain possono

interagire con dNTP e con un'altra elica che viene a subire delle modificazioni strutturali che

“verificano” il corretto dNTP.

Nel dominio delle dita il filamento stampo viene curvato di quasi 90° proprio in prossimità della

base che è pronta a ricevere un nuovo dNTP per formare un filamento nuovo.

IMPORTANZA DELL’INNESCO A RNA

I sistemi biologici spesso utilizzano un primer per poter permettere alla DNA polimerasi di svolgere

il proprio compito e andare a replicare il DNA. Diverse motivazioni spingono la cellula a utilizzare

inneschi a RNA:

i. La cellula utilizza inneschi a RNA perché questi vengono prodotti da delle RNA polimerasi

particolari (chiamate primasi) che non necessitano di inneschi per poter produrre una

sequenza nucleotidica

ii. La cellula utilizza RNA e non DNA per poter riconoscere la sequenza primer in modo altamente

specifico

iii. La capacità di riconoscimento del primer permette alla cellula di eliminarlo e mediante una

DNA polimerasi andare a produrre una sequenza di desossiribonucleotidi, il sistema utilizza

RNA e poi lo sostituisce perché RNA primer spesso presenta degli errori (pur costituendo una

piccolissima parte dell’elemento copiato) e la rimozione dell’RNA e la sostituzione con DNA da

parte di una polimerasi permette invece di verificare la correttezza dei desossiribonucleotidi

con una precisione molto maggiore delle primasi

L’innesco a RNA viene prodotto dalla primasi nei procarioti (chiamata anche DnaG), negli

eucarioti è data dalla subunità ad attività primasica della DNA polimerasi α 61

SISTEMA MISMATCH REPAIR

Fa parte dei sistemi di riparazione del DNA e interviene anche

coadiuvando la replicazione e permette di abbassare l’errore da uno

ogni milione a uno ogni miliardo di nucleotidi (o addirittura ogni 10

miliardi di nucleotidi).

Il SMR permette di riconoscere una variazione della geometria della

doppia elica quando ci sono due nucleotidi non correttamente

appaiati, opera una correzione per escissione.

¬ Nei procarioti viene analizzato per variazioni da una proteina

chiamata MutS, questa proteina, qualora dovesse riconoscere

una distorsione, storce ulteriormente la doppia elica e ciò provoca

il reclutamento di altre due proteine: MutL e MutH. MutH taglia il

filamento vicino al mismatch agendo con attività endonucleasica,

genera un’interruzione 5’-3’ e a partire da questa il complesso,

con attività esonuclesica, partendo dalla interruzione, va a

degradare la sequenza (LA SEQUENZA CONTIENE IL

MISMATCH MA NON SOLO, INFATTI IL COMPLESSO SCINDE

TUTTA UNA SEQUENZA DI NUCLEOTIDI).

Viene reclutata tutta una serie di proteine per completare il

procedimento: MutS, MutL, MutH, elicasi, DNA polimerasi II,

DNA ligasi sono tutte coinvolte per riconoscere, scindere, aprire,

riparare e riunire il filamento danneggiato.

I procarioti per distinguere quale dei due filamenti è quello nuovo

(che necessita di correzione) ricorrono alla metilazione: una

proteina indipendente da replicazione e riparazione di nome Dam

metilasi metila tutte le adenine presenti nella sequenza GATC (le

sequenze non metilate vengono riconosciute da MutH) dopo un

determinato lasso di tempo (in modo che inizialmente il filamento

neosintetizzato sia distinguibile e riparabile dalle proteine del

sistema mismatch repair)

¬ Negli eucarioti i sistemi mismatch repair sono molteplici e delle

varianti eucariotiche di MutS e MutL (NLH e NSH) con maggiore

specificità (riconoscono diversi tipi di mismatch) –MutH non

presente perché non c’è metilazione - tuttavia il sistema si basa

non sulla metilazione del DNA bensì sul riconoscimento dei nick

ancora non saldati presenti nei frammenti di Okazaki e in questi casi il sistema degrada il

polimero a partire da dove la DNA polimerasi sta sintetizzando fino all’errore per poi permettere

alla DNA polimerasi di riprendere il processo di sintesi (risulta un sistema molto più

dispendioso). Similmente il sistema agisce sul filamento leader: riconosce i nick presenti dove

c’è stato l’inserimento del primer: il primer viene messo sul filamento leader e crea un nick in

5’ , questo viene riconosciuto e così il sistema è in grado di degradare il filamento corretto fino

al primer stesso (risulta così un processo lungo e dispendioso).

I PROCESSI DI CORREZIONE DELLA REPLICAZIONE 5

• Il modo in cui l’enzima verifica che le basi siano appaiate correttamente (1 errore su 10 basi)

6

• Il proofreading (correzione di bozze) aumenta la precisione (1 errore su 10 basi)

9

• Il sistema mismatch repair aumenta la precisione (1 errore su 10 basi) 62

RIMOZIONE DEGLI INNESCHI NEI PROCARIOTI

Nei procarioti la rimozione degli inneschi e il riempimento dei gap è catalizzato

dalla DNA polimerasi I la quale contemporaneamente va a sintetizzare la

sequenza di deossiribonucleotidi sostitutivi.

Tuttavia sono presenti numerosi primer e ciascuno di essi presenta legami

fosfodiesterici tra ribonucleotidi e un particolare legame fosfodiesterico tra

ribonucleotide e deossiribonucleotide, i legami tra i ribonucleotidi vengono

scissi da RnasiH mentre la DNA pol I si occupa del legame RNA-DNA.

RIMOZIONE DEGLI INNESCHI NEGLI EUCARIOTI

La rimozione degli inneschi richiede l’intervento di enzimi specializzati poiché negli eucarioti non

esiste una DNA polimerasi in grado di avere attività esonucleasica di questo tipo (in grado di

rimuovere RNA). Enzimi specializzati rompono i legami esistenti nel primer tra ribonucleotidi

utilizzando RnasiH mentre il legame tra ribonucleotide e deossiribonucleotide viene scisso da

FEN1.

RnasiH riconosce un tratto di RNA che si è ibridizzato con DNA per fungere da primer e lo va a

• rimuovere, il tratto lasciato scoperto viene poi riempito da una DNA polimerasi (parte dalla

sequenza nucleotidica precedente e arriva alla successiva.

RnasiH H riconosce l’RNA ibridizzato e lo degrada fino all’ultimo ribonucleotide poi interviene

• l’esonucleasi specializzata FEN1.

Si è osservato che la DNA polimerasi “scalza” il primer lasciandolo “sporgere” dal doppio filamento

come flap, il flap rimane legato alla sequenza di DNA e si è visto che FEN1 degrada facilmente

sequenze sporgenti dal doppio filamento. FEN1 scinde completamente il legame che esiste nel

doppio filamento e con il frammento a cui il primer è legato permettendo una degradazione

completa dell’innesco.

Il processo non è lineare infatti a seconda della forcella, della sequenza di DNA, della lunghezza

del flap e di altri fattori la rimozione degli inneschi può variare e può richiedere differenti proteine.

Si è osservato che FEN1 oltre alla sua normale attività endonucleasica presenta attività

esonucleasica (5’-3’), l’attività esonucleasica sembra essere utilizzata soprattutto in alcuni processi

di riparazione piuttosto che nei processi di replicazione.

FEN1 è coinvolto anche nella stabilità del genoma: esso permette una rapida rimozione degli

inneschi che se non dovesse avvenire in tempi brevi potrebbe portare (per alcune sequenze di

DNA) a ripiegamenti e interazioni non corrette che andrebbero a compromettere la stabilità del

genoma.

REPLICATION SLIPPAGE

Si tratta di un fenomeno dovuto a una unità ripetitiva presente nel DNA che può “slittare” durante la

replicazione (poiché i nucleotidi sono ripetuti e perciò può essere che alcuni elementi si vadano ad

appaiare prima o dopo la loro corretta posizione) e provocare quindi sul filamento neosintetizzato

una espansione o una contrazione di due o tre nucleotidi (solitamente) che rimangono sporgenti

dalla molecola di DNA lineare poiché non hanno basi complementari con cui andare ad appaiarsi.

La conseguenza è quindi una mutazione a espansione o contrazione.

La rapida attività di FEN1 sugli inneschi evita che ci sono degli slittamenti tra il filamento stampo e

il filamento neosintetizzato (specialmente sul filamento ritardato) poiché rimuovendone

rapidamente la DNA polimerasi può agire per inserire la sequenza complementare e andare a

“fissare” i nucleotidi nella loro posizione. 63

DNA LIGASI

Sono enzimi che si occupano di chiudere il nick lasciato all’interno

dei frammenti di Okazaki dopo l’inserimento delle sequenze

mancanti nei gap.

• Procarioti: l’enzima interagisce con NAD andando poi a legarsi

covalentemente con AMP e rilasciando NMP

• Eucarioti: l’enzima interagisce con ATP lega AMP e rilascia Ppi

L’enzima-AMP interagisce con la parte di nucleotide con il nick e

cede il gruppo AMP al fosfato in 5’, in seguito il fosfato presente sul

5’ prima dell’aggiunta di AMP interagisce con il gruppo alcolico in 3’

formando un legame fosfodiesterico e l’AMP viene rilasciato.

L’energia sfruttata dalla scissione delle molecole energetiche viene utilizzata per formare il legame

fosfoesterico.

DNA ELICASI

Questo enzima è costituito da 6 subunità identiche fra di loro, si

assemblano a dare una struttura non perfettamente simmetrica ma

leggermente schiacciata lateralmente cava centralmente.

L’elicasi procede con velocità differenti a seconda della difficoltà di

andare incontro a attività elicasica (variabile in base al

superavvolgimenti del DNA).

È una proteina che richiede molta energia.

Nei procarioti l’enzima (denominato DnaB) si trova molto vicino alla

primasi e si associa ad essa a formare il primosoma.

Negli eucarioti le elicasi sono molteplici e si associano in un

complesso proteico chiamato MCM2-7 che assume un ruolo simile a

DnaB negli eucarioti.

Delle sei possibili tasche per molecole energetiche:

2 opposte fra loro hanno più probabilità di interagire con ATP, 2 con

ADP + Pi e 2 di essere semplicemente vuote. Questa disposizione si

associa a un cambiamento conformazionale di ciascuna subunità in

modo da avere diverse affinità (per ATP, ADP + Pi e si ottiene

∅),

così una modificazione conformazionale delle sei subunità associate

a dare un ripple effect che, nella struttura tridimensionale, si associa

al “tiraggio” di uno dei due filamenti di DNA attraverso la struttura in

modo da separarlo dal suo complementare.

PROTEINE SSB E RPA

Sono proteine non enzimatiche che sono essenziali per l’attività di

replicazione, esse impediscono che i filamenti complementari si

associno a formare il doppio filamento nuovamente o che ci siano delle interazioni anormali in

grado di formare anse.

Proteine SSB (single strand binding protein) sono presenti nei procarioti.

Proteine RPA che si associano in forma trimerica e svolgono la medesima funzione negli

eucarioti.

Le proteine SSB si legano l’una dietro l’altra e permettono alla DNA polimerasi di leggere

correttamente le basi, esse si associano alla ossatura zucchero fosfato lasciando libere le basi.

Formano legami cooperativi. 64

DNA TOPOISOMERASI

Hanno il compito di rilasciare i superavvolgimenti generati in seguito

all’apertura della doppia elica e sono molteplici sia nei procarioti che

negli eucarioti, intervengono in molteplici processi. Si trovano sempre

di fronte dalla DNA polimerasi e hanno il compito di tagliare dei legami

per permettere il rilascio della tensione accumulata nello svolgimento

della molecola.

Tagliano legami fosfodiesterici e si legano covalentemente al fosfato

del DNA (così facendo preservano l’energia che si verrebbe a

rilasciare con il taglio del legame fosfodiesterico).

Sono identificabili come nucleasi reversibili proprio perché

mantengono l’energia del legame e perciò lo possono riformare

facilmente.

DNA topoisomerasi di tipo I

Scinde un singolo filamento (in maniera indistinta) in modo che lo

stesso possa “attraversare” il suo complementare in modo da

rilasciare la tensione intrinseca alla doppia elica

DNA topoisomerasi di tipo II

Essa taglia entrambi i filamenti, si permette alla regione intatta di

passare attraverso alla rottura, quindi viene risaldata la componente

tagliata.

Questo enzima, a differenza del precedente, richiede energia per il

proprio corretto funzionamento.

Non c’è alcuna variazione chimica nella sequenza e nella struttura del

DNA.

L’enzima si lega reversibilmente (e in modo covalente) al fosfato che va a scindere, esso usa un

amminoacido conservato per creare il legame stabile e per conservare l’energia che verrà

successivamente ritrasferita nella formazione del legame fosfodiesterico.

Le due topoisomerasi generalmente intervengono in processi genetici differenti, nella replicazione

sono entrambe coinvolte e hanno un ruolo coordinato.

Nei procarioti esistono 4 differenti topoisomerasi:

1ª è una topoisomerasi di classe I

3ª è una topoisomerasi di classe I

4ª è una topoisomerasi di classe II

girasi (2ª) è una topoisomerasi di classe II che solitamente interviene nello svolgimento dei

superavvolgimenti procariotici.

Negli eucarioti esistono similmente topoisomerasi:

almeno una di tipo I che in genere interviene nei processi della trascrizione;

Altre topoisomerasi presenti all’interno degli organismi eucariotici con funzioni specifiche. 65

Nell’uomo esistono 5 geni codificanti per 5 differenti isomerasi

3 sono di tipo I

• 2 sono di tipo II

Alcune intervengono in processi come la ricombinazione o in processi non definiti, 1 e 2α

intervengono nella replicazione del DNA.

ORGANIZZAZIONE DEGLI ENZIMI NELLA FORCELLA DI REPLICAZIONE

L’insieme delle proteine sopra descritte si muove in un grande complesso multienzimatico

organizzato.

La forcella di replicazione si organizza in modo tale che il filamento ritardato formi un’ansa per cui

si vada a trovare “parallelo” al filamento leader (entrambi i filamenti posti in direzione 3’-5’).

Lo stesso tipo di comportamento si osserva anche negli eucarioti anche se le proteine coinvolte

sono differenti. L’ansa permette di risolvere il problema dei filamenti antiparalleli seppur sia

necessario produrre sempre un primer e di unire i frammenti che si vengono a formare.

Il processo di associazione della DNA polimerasi alla sequenza nucleotidica avviene proprio grazie

al clamp loader e alla sliding clamp: viene sintetizzato l’innesco, le proteine clamp loader si

occupano di unire la sliding clamp e quindi comincia a polimerizzare la DNA polimerasi.

Si è osservato che nella DNA polimerasi III si associano 3 core catalitici (ciascuno con α, ϵ, θ e

sliding clamp) grazie a tre subunità τ: un core catalitico lavora sul filamento leader mentre gli altri

due lavorano sul filamento ritardato in modo alternato, ovvero mentre uno sintetizza l’altro è pronto

a passare al frammento successivo, presentano quindi sliding clamp e la possibilità di essere

caricati da clamp loader ciascuno successivo all’altro: sintetizzato l’innesco di RNA il clamp loader

(che si trova associato a subunità τ) recluta la sliding clamp (subunità β) e così facendo va a

richiamare le altre subunità necessarie alla formazione del complesso della polimerasi (core

1

catalitici, γ,δ,δ ,ψ, χ), successivamente si associa il secondo core catalitico e comincia il

procedimento di replicazione. Finito la sintesi di un frammento di Okazaki, il core catalitico si

dissocia dalla sequenza ma rimane associato alla subunità τ disponibile a ricominciare la

replicazione su un altro frammento di DNA.

Il complesso così organizzato ha la massima efficienza in modo da produrre più velocemente

possibile coordinando la sintesi con due core catalitici.

I TELOMERI, LA TELOMERASI E LA LORO REPLICAZIONI NELLA CELLULA EUCARIOTICA

Negli eucarioti si pone un problema dovuto alla linearità

dei cromosomi eucariotici per cui la sintesi degli inneschi

e la loro successiva rimozione nel filamento ritardato

andrebbe a provocare un accorciamento della molecola

di DNA ad ogni replicazione (non esiste alcuna DNA

polimerasi in grado di riempire il gap).

Il problema è stato risolto dalla cellula grazie

all’introduzione dei telomeri che sono le estremità di

ciascun cromosoma che contengono sequenze altamente

ripetute non codificanti.

I telomeri consistono in blocchi di migliaia di sequenze

ripetute alle estremità delle molecole di DNA, si tratta di

sequenze caratteristiche quali: GGGTTT (negli eucarioti)

GGGATT (nell’uomo) che si ritrovano in tutti i cromosomi.

La telomerasi è una DNA polimerasi specializzata che

oltre a contenere subunità proteica contiene una piccola

sequenza di RNA che funge da stampo (infatti non si tratta di un ribozima) con una sequenza

ripetuta complementare a quella dei telomeri, essa agisce sulle sequenze presenti all’interno del

filamento parentale andando ad allungarlo in modo che si possa compensare la perdita di DNA con

l’allungamento dell’estremità in cui si andrebbe a perdere nucleotidi.

Poiché essa va ad agire sul filamento parentale non presenta uno stampo da cui poter dedurre che

sequenza produrre utilizza come stampo il filamento di RNA che è contenuto al suo interno. 66

La telomerasi agisce come una trascrittasi inversa poiché usa un suo RNA per retrotrascrivere del

DNA e va a ripetere il ciclo diverse volte per poter allungare sufficientemente la molecola di DNA.

La telomerasi produce degli sticky ends che sono essenziali affinché il telomero possa svolgere la

sua funzione di protezione delle sequenze di

DNA, viene prodotto un filamento di DNA con

estremità 3’ libera molto lunga che assume

diverse conformazioni tridimensionali:

• un’ansa grande chiamata D loop che è

ripiegato come un “uncino”;

• una T loop in cui il filamento singolo va a

ripiegarsi e scalzare una parte del

filamento di DNA accoppiato per dare una

struttura chiusa; quest’ultima struttura è

organizzata con alcune proteine associate

e la sua formazione è necessaria perché

possano proteggere il DNA e non vengano

riconosciuti come errori.

Le proteine che si associano al telomero

influenzano l’attività della telomerasi e quindi

la lunghezza del telomero stesso, alcune

proteine si legano nella regione del telomero a doppio filamento (dove si è accoppiato per dare la

struttura chiusa) e influenzano l’attività della telomerasi, soprattutto inibendola

Cdc13 (associata direttamente al ciclo cellulare) e altre proteine vengono reclutate nel

• momento in cui la cellula va incontro alla replicazione del DNA, Cdc13 recluta la telomerasi e

un coacervo di proteine correlate che permettono ad essa di riconoscere il filamento

parentale, legarvisi e cominciare l’aggiunta di GGGTTA.

TRF1/TRF2 si associa direttamente al telomero dove si presenta a doppio filamento insieme

• ad altre proteine per formare lo shelter proteico in grado di evitare la degradazione o la

“riparazione incorretta” dei telomeri da parte di enzimi di riparazione.

Le proteine nel complesso garantiscono la capacità di: regolare il reclutamento e l’attività della

polimerasi una volta che si è creata, formare la struttura ripiegata, impedire che intervengano

enzimi di riparazione, proteggere il DNA, impedire che i cromosomi si aggreghino.

Le estremità dei cromosomi presentano un numero variabile delle unità telomeriche, le estremità

dei cromosomi contengono una quota variabile di ripetizioni che devono essere mantenute entro

un certo range, il range è poi variabile a seconda del tipo cellulare: cellule in rapida proliferazione

presentano tendenzialmente telomeri più lunghi mentre cellule che non sono più proliferative

presentano dei telomeri di minor lunghezza. La lunghezza dei telomeri è regolata da meccanismi

omeostatici che influenzano la capacità proliferativa della cellula stessa.

La senescenza cellulare è stata dimostrata in vitro con delle colture cellulari in cui si è osservata

(con piastre adeguate e fornendo tutti gli stimoli necessari) che le cellule si accrescevano per un

certo periodo, proliferavano ma la divisione cellulare andava man mano diminuendo fino ad

arrestarsi con la morte delle cellule. È stata osservata la correlazione tra la velocità di

proliferazione e attività della telomerasi che permetteva di stabilire che la telomerasi era coinvolta

nei processi di sopravvivenza e senescenza cellulare.

Nelle cellule tumorali si vede una elevata attività telomerasica, un approccio farmacologico mirato

alla inattivazione della telomerasi sarebbe una cura efficace contro forme tumorali, tuttavia è

necessario che il bersaglio sia altamente specifico in modo da non colpire cellule somatiche che

presentano normalmente una elevata attività telomerasica (come le cellule del midollo osseo,

cellule staminali e cellule germinali).

Nelle cellule staminali e nelle cellule germinali si verifica un’elevata attività telomerasica. 67

Le cellule somatiche di un organismo vanno

man mano perdendo i propri telomeri e si

verifica una diminuzione della attività della

telomerasi poiché essa non è più necessaria

all’organismo come nelle cellule in rapida

proliferazione.

La mutazione delle proteine correlate o della

telomerasi stessa fanno si che i telomeri siano

riconosciuti come sequenze incorrette o che

portino ad un’alterata attività della telomerasi

stessa.

ORIGINI DELLA REPLICAZIONE

Le origini di replicazioni possono essere “accese” o “spente” e sono associate a delle regioni di

DNA non codificante che sono chiamate ori.

Il cromosoma batterico, che è circolare, per stimolare la replicazione necessita solamente di una

singola ori, si originano così due forcelle di replicazione, una procede in senso orario, l’altra in

senso anti orario fino a quando non si incontrano.

I cromosomi degli eucarioti presentano molteplici ori per ciascun cromosoma, esse si attivano

indipendentemente l’una dall’altra.

Quando le ori si attivano ci sono delle proteine chiamate proteine iniziatrici le quali piegano il

DNA a livello della sequenza/regione di DNA destabilizzandolo localmente, l’apertura del DNA in

quel luogo viene chiamata replication bubble (bolla di replicazione) da cui si cominciano ad

assemblare da un lato e dall’altro due forcelle: una procede verso sinistra e una verso destra, nei

due filamenti generati i filamenti leader e i filamenti ritardati sono scambiati di posizioni (poiché la

DNA polimerasi procede solo in direzione 5’-3’ per la polimerizzazione).

L’ori nei procarioti è una regione breve presente in un punto specifico del cromosoma circolare

i. è lunga 245 paia di basi.

ii. Una parte di OriC (origine di replicazione per E. coli) contiene 4 ripetizioni di 9 nucleotidi,

l’altra parte (che si trova a monte) ha 3 ripetizioni di 13 nucleotidi composte, a parte due, da

appaiamenti di A e T; quando viene stimolata la replicazione vengono trascritte proteine

iniziatrici tra cui DnaA che hanno il compito di riconoscere specifiche sequenze, queste

proteine formano delle interazioni molto forti e essendocene molteplici vanno a provocare

una distorsione della regione di DNA adiacente che contiene le ripetizioni di sequenze A e T

(le quali formano solo due legami H) permettendone un’apertura.

Nel lievito S. cerevisiae sono state identifica le prime ori eucariotiche che, pur presentando una

maggiore complessità di quelle procariotiche, costituiscono un modello relativamente semplice.

Le ori di questo organismo

i. sono lunghe 50 paia di basi

ii. sono regioni ricche di sequenze A e T (facili da denaturare)

iii. contengono diversi elementi al loro interno e vengono chiamate sequenze A.R.S

(autonomous replicating sequences) perché sono sequenze di DNA in grado di attivare la

replicazione

iv. si associano a un complesso di proteine (O.R.C. = origin replicating complex) in grado di

riconoscere alcuni elementi tipici e interagendo con le sequenze creano una struttura che

viene facilmente denaturata (attività elicasica).

O.R.C: 68

è formato da 6 proteine associate assieme

• riconosce due sequenze conservate (elemento A e elemento B) tuttavia a differenza dei

• procarioti non è sufficiente a formare la bolla di replicazione ma deve reclutare altre

proteine

svolge due delle tre funzioni che nei procarioti sono unificate: si lega all’origine di replicazione e

• recluta altre proteine ma non aprire esso stesso la doppia elica.

È permanentemente legato all’origine di replicazione

• Il ciclo cellulare è in grado di attivarlo: vengono reclutate delle proteine, nel caso di S. cerevisiae

• Cdc6 e Cdt1: Cdc6 si lega a ORC e recluta Cdt1, una volta che essi sono legati richiamato

un complesso di proteine chiamato MCM

Nei mammiferi le ori

i. sono estremamente difficili da identificare poiché sono estremamente variabili e complesse

ii. sono sequenze lunghe migliaia di nucleotidi

iii. contengono molte proteine che sono in grado di riconoscere le diverse ori presenti

iv. sono molto meno definite che negli organismi inferiori

v. Non esiste una sequenza caratteristica che identifichi le origini di replicazione, sembra che

avanzando nell’evoluzione la replicazione sia andata a coordinarsi con la trascrizione dove

la replicazione comincia in sequenze di DNA più trascritte rispetto ad altre

UNITÀ DI REPLICAZIONE O REPLICONE

Si definisce come una regione di DNA in cui la replicazione si attiva in modo autonomo.

4 6

Ciascun replicone è lungo da 10 a 10 paia di basi, ed è una struttura complessa che contiene al

suo interno 40-80 ori che garantisce una rapida replicazione dell’intera porzione di DNA.

La velocità di replicazione diminuisce all’aumentare della complessità dell’organismo perché

aumenta il controllo che avviene fatto durante la replicazione.

Repliconi differenti di uno stesso cromosoma si replicano in momenti diversi della fase S della vita

cellulare, tipicamente l'eucromatina, meno condensata, viene replicata per prima mentre

l'eterocromatina viene replicata in un secondo momento.

NUCLEOSOMI E LA REPLICAZIONE

Il rapporto che sussiste tre le prime strutture di condensazione della cromatina e l’evento della

replicazione è estremamente importante: durante la replicazione la zona direttamente interessata

deve essere decondensata per permettere il corretto funzionamento della DNA polimerasi ma non

è possibile decondensare tutto il DNA contenuto in una cellula, infatti a valle e a monte di dove si

sta svolgendo la replicazione il DNA si trova nuovamente compattato e ciò è possibile grazie

all’interazione dei nucleosomi con alcuni complessi proteici coinvolti nella replicazione.

I nucleosomi si spostano per permettere il passaggio del complesso di replicazioni. È stato

dimostrato che durante l’evento della replicazione il DNA non si dissocia dagli istoni ma il core

proteico viene parzialmente dissociato in due metà in modo da rendere il DNA disponibile a essere

replicato, la decondensazione coinvolge ≈200 nucleotidi per volta e il nucleosoma va a riformarsi

subito dopo che la replicazione è avvenuta. 69

I complessi di rimodellamento della cromatina permettono

la parziale demolizione degli ottameri istonici.

Gli istoni, dopo che il DNA è stato replicato, devono andare

a ricondensare entrambi i filamenti formatisi e per questo

motivo i geni istonici sono ripetuti centinaia di volte nel

DNA: in modo da garantire un’adeguata produzione di

nuovi istoni quando sono richiesti per condensare la

molecola di DNA in seguito alla replicazione.

Dopo la parziale degradazione del core proteico il

tetramero H3-H4 si assocerà in modo casuale ad un

filamento o all’altro, nel filamento che ha perso il tetramero

questo si andrà a riformare e successivamente (sia dove

sono rimasti dopo la replicazione, sia dove si sono aggiunti

dopo) si assoceranno i due dimeri H2A-H2B a riformare il

core proteico grazie all’intervento di alcuni complessi

proteici denominati cromatin assembly factors.

Negli eucarioti si è visto che la sliding clamp assume un

ruolo fondamentale per reclutare i cromatin assembly

factors:

CAF1 aggiunge nuovi tetrameri dove sono venuti a mancare;

• NAP1 aggiunge i dimeri H2A-H2B dove è già presente il tetramero;

Si basa su enzimi con attività varia che però sono coinvolti anche nella replicazioni: DNA

polimerasi specifiche; ligasi, topoisomerasi ed altre.

La riparazione serve a garantire alla cellula un metodo per riparare errori introdotti nella sequenza

della molecola di DNA di varia origine.

FONTI DI ALTERAZIONE DEL DNA

• Raggi UV

• Radiazioni X e γ

• Particelle cariche ad alta energia

• Radicali liberi e ROS

• Sostanze ad alta attività mutagena (tendono a legarsi ai nucleotidi agendo da agenti

intercalanti: si legano covalentemente ai nucleotidi o ne modificano la struttura con interazioni,

un esempio è il 5-bromo uracile che è in grado di legarsi con legami H con la guanina

spiazzando la citosina e causando importanti distorsioni della normale geometria del DNA)

• Errori di replicazione.

Gli errori che vengono introdotti nella molecola di DNA normalmente permangono per poco tempo

grazie agli svariati sistemi di riparazione di cui è dotata la cellula che riparano tipi diversi di DNA

(alcuni metodi di riparazione sono ridondanti = sistemi diversi riparano gli stessi errori per

aumentare l’efficienza).

Particolarmente gravi sono le rotture dei filamenti del DNA sia che sia un singolo filamento sia che

sia doppio (delezioni di sequenze, rimozioni di basi, perdita di una intera parte della molecola) 70

DANNI PRINCIPALI DEL DNA

• Alterazioni di nucleotidi in cui i singoli nucleotidi vengono alterati:

a) Rottura dello scheletro zucchero fosfato

b) Distacco della base azotata dallo scheletro (è un processo che riguarda sia le pirimidine

che le purine ma si verifica molto più spesso per le ultime, infatti viene generalmente

chiamato depurinazione, questo errore viene facilmente riconosciuto dai sistemi di

riparazione in quanto c’è lo scheletro zucchero-fosfato ma manca la base, così facendo il

sistema di riparazione legge la base complementare e reinserisce quella corretta).

c) Modificazione della base (deamminazione, ossidazione, alchilazione)

a. La deamminazione riguarda G, C e A (poiché presentano un gruppo amminico),

quando si stacca il gruppo amminico dalla citosina con un passaggio

tautomerico questa diventa un uracile. La deamminazione è una alterazione che

modifica la base senza perderla.

• Formazione di legami crociati ovvero legami covalenti tra nucleotidi adiacenti nello stesso

filamento di DNA;

• Rotture dei singolo filamento o di entrambi i filamenti.

Questo tipo di danni, nella maggior parte dei casi, può essere riparata dalla cellula. La cellula

presenta sistemi di controllo del danno molto sviluppati, in particolar modo ha sistemi di riparazione

altamente specializzati per gli errori più frequenti all’interno del DNA.

LA DEAMMINAZIONE

Seppur normalmente le basi presenti negli acidi nucleici siano A,G,C,T e

U le molecole di acido ribonucleico possono contenere basi modificate

(vedesi il caso di tRNA) con importanza anche in processi essenziali al

funzionamento cellulare (wobble pairing codone-anticodone).

Nel DNA si trovano esclusivamente A,G,C,T.

Questo danno, se non riparato, potrebbe portare a gravi mutazioni nel

codice genetico e nella cellula: si otterrebbe, durante la replicazione, la

variazione del nucleotide che sul filamento neosintetizzato da G

diventerebbe A.

LA DEPURINAZIONE

Si tratta della perdita della base azotata sul

nucleotide (depurinazione perché riguarda

soprattutto le purine A e G) ed è facilmente

riconoscibile.

Questo danno può portare a mutazioni gravi

che potrebbero compromettere il

comportamento fisiologico della cellula:

durante la replicazione ci sarebbe la delezione

del nucleotide mancante di base azotata, ciò

provocherebbe una variazione di tutta la

sequenza nucleotidica a valle.

Una cellula normale, in condizioni normali, può subire svariate mutazioni anche in assenza di

agenti mutageni a causa di errori normali all’interno della cellula, per questo motivo è importante

che la cellula, oltre ad un’altissima accuratezza di replicazioni, presenti uno o più sistemi di

riparazione per i vari tipi di errore, in modo da non incorrere in comportamenti tossici o patologici

per l’organismo. 71

LA RIPARAZIONE DEL DNA

Sono sistemi molti efficienti ed efficaci, alcuni di questi riconoscono distorsioni

locali della doppia elica altre il singolo nucleotide alterato. Ciascun meccanismo

di riparazione è catalizzato da enzimi specifici (che possono essere comunque

condivisi con altre vie o altri processi cellulari) tra cui DNA polimerasi, ligasi,

elicasi, topoisomerasi.

IL SISTEMA DI RIPARAZIONE È RINDONDANTE (a prova che l’attività di

riparazione è estremamente importante per la cellula).

La maggior parte dei sistemi di riparazione comporta 3 passaggi:

escissione (operata da endonucleasi): La porzione alterata del filamento

• danneggiato viene riconosciuta e rimossa da nucleasi di riparazione, in molte

vie tuttavia non viene rimossa la parte danneggiata ma anche una porzione a

valle e a monte.

Risintesi (operata da DNA polimerasi):La DNA polimerasi riempie il gap

• utilizzando la copia corretta del filamento complementare come stampo.

Legatura (operata da DNA ligasi): La DNA ligasi sigilla l’interruzione;

Gli enzimi coinvolti appartengono alla stessa classe di enzimi condivisi con vari

processi ma solitamente un tipo di enzima funziona meglio in un processo

piuttosto che in un altro.

LA RIPARAZIONE PER ESCISSIONE DELLA BASE (B.E.R = Base excision

repair)

Interviene solitamente per riparare i danni da deamminazione oltre a alchilazione e ossidazione:

a. Il sistema è in grado di riconoscere l’appaiamento incorretto di nucleotidi e intervengono una

serie di operare l’escissione, viene staccata la base incorretta (che può essere riconosciuta

perché la deamminazione produce basi non presenti nel DNA come uracile, ipoxantina e

xantina). La rimozione della base azotata richiede l’intervento delle DNA glicosilasi che va a

scindere il legame N-glicosidico presente tra base azotata e glucide (desossiribosio). Esistono

differenti glicosilasi: Uracile DNA glicosilasi che scinde il legame se è presente uracile, Xantin

DNA glicosilasi, Ipoxantin DNA glicosilasi e altre (per altre alterazioni).

b. Due enzimi collaborano per fungere da endonucleasi e staccare il nucleotide rimasto senza

base azotata. I due enzimi sono AP (apurinici o apirimidinici) endonucleasi e

fosfodiesterasi.

c. Rimosso il nucleotide una DNA polimerasi (I nei procarioti, β negli eucarioti) inserisce il

nucleotide mancante usando come stampo il filamento complementare integro

d. La DNA ligasi va poi a legare il nucleotide ripristinando la corretta sequenza.

Questa stessa via di riparazione, usando meno enzimi, può intervenire anche nella riparazione di

zuccheri che hanno perso per altri motivi la propria base azotata, interviene quindi anche nella

depurinazione andando a essere un sistema di controllo per gran parte dei danni subiti dal DNA.

LA RIPARAZIONE PER ESCISSIONE DEL NUCLEOTIDE (N.E.R = nucleotide excision repair)

Coinvolge altri tipi di danni relativi soprattutto relativi a importanti deformazione della doppia elica

di DNA date da interazioni incorrette tra le basi (soprattutto pirimidine e soprattutto timina) che al

momento della replicazione porterebbero a una mutazione poiché non potrebbero essere lette

correttamente.

Ha delle somiglianze con il sistema di mismatch repair presente nella replicazione tuttavia agisce

in un ambito differente.

L’esempio qui riportato riguarda la formazione di dimeri di pirimidine per interazioni tra le basi

azotate (si verificano solitamente tra timine ma possono verificare in generale in tutte le pirimidine).

72

a. Interviene un complesso multienzimatico che verifica distorsioni della

doppia elica e non la presenza di nucleotidi alterati e opera una

escissione grazie a specifiche endonucleasi in grado di riconoscere li

filamento mutato. Le endonucleasi tagliano a monte e a valle della

regione con la mutazione (una dozzina di nucleotidi a monte e a valle)

b. Interviene una DNA elicasi per allontanare il segmento scisso dal

proprio complementare (a cui altrimenti rimarrebbe appaiato);

c. Una DNA polimerasi (β negli eucarioti e I nei procarioti) si lega al

filamento integro e lo usa come stampo per sintetizzare la sequenza

mancante;

d. Una DNA ligasi si occupa di ripristinare il normale legame presente

nell’ossatura zucchero fosfato del filamento.

Il sistema N.E.R. comprende un complesso multienzimatico con molte

proteine al suo interno:

nei procarioti sono coinvolte le proteine Uvr A, B, C e D che sono in

• grado di riconoscere distorsioni a livello della doppia elica associata a

vari eventi (tra cui la formazione di legami crociati).

Uvr A e Uvr B cercano distorsioni del DNA e dove le trovano si legano al DNA dove Uvr B piega

localmente la doppia elica reclutando sul DNA Uvr C che agisce come endonucleasi, infine Uvr

D agisce da elicasi.

Negli eucarioti ci sono proteine omologhe a quelle dei procarioti ma più complesse, esse vanno

• da XPA a XPG e sono altamente specializzate. 73

RIPARAZIONE DELLE ROTTURE DEL SINGOLO FILAMENTO (S.S.B = Single Strand Breaks)

Sono danni abbastanza gravi poiché se non viene rapidamente riparato può portare alla perdita di

nucleotidi e conseguentemente a perdita di informazione genetica.

Vengono riparate da diverse vie enzimatiche, la via più frequentemente utilizzata è una via

mediante escissione specifica per le S.S.B, è una via rapida e efficiente che è esente da errori.

Questo sistema si occupa di riconoscere la assenza di un legame, ovvero

riconosce un nick e opera come segue:

a. Escissione mediante specifiche endonucleasi (sono molteplici le proteine

coinvolte in questa azione);

b. La DNA polimerasi comincia il processo di risintesi della sequenza nucleotidica

che presentava un nick;

c. Il segmento “scalzato” da quello neosintetizzato viene degradato e rimosso ad

opera di una esonucleasi ;

d. Una ligasi risalda la nuova sequenza.

Il sistema non si limita a utilizzare una ligasi perché si può essere verificata la

perdita di una o più basi a patire dal nick, per cui per risintetizzare correttamente

tutto quanto viene preferita la sintesi ex novo di tutto il pezzo.

RIPARAZIONE DELLE ROTTURE DEL DOPPIO FILAMENTO (D.S.B. Double Strand Breaks)

Si tratta di una problematica molto grave, la più urgente da riparare per la cellula e può provocare,

oltre a mutazioni, anche la morte cellulare impedendo una corretta ripartizione del materiale

genetico. Esistono due metodi differenti per riparare questo tipo di lesioni (i due metodi sono

assolutamente differenti e tendenzialmente la cellula utilizza il metodo che permette di non

ottenere errori, in caso ciò non sia possibile si reindirizza verso l’altro che introduce sequenze

nucleotidiche errate).

Unione non omologa delle estremità (NHEJ = Non Homologus End Joining)

C’è stato un danno che ha rotto entrambi i filamenti del DNA e può

aver portato alla perdita di nucleotidi da ambo i lati della formazione

iniziale del nick.

Questo sistema cerca di giustapporre le due estremità che sono

state rotte con proteine speciali in grado di riconoscere i punti di

rottura del DNA (questo spiega perché i telomeri presentino il

complemento di proteine in grado di evitare che il sistema NHEJ li

riconosca come errori e li vada a saldare ad altri cromosomi). Le

proteine (Ku70/Ku80DNA-PkcsXRCC4 & DNA ligasi IV è un

reclutamento a cascata di diversi enzimi che poi riparano l’errore)

ristabiliscono le estremità da ambo le parti (producono blunt ends

che possano ricongiungersi) e successivamente le riuniscono.

Questo sistema solitamente comporta una delezione di alcuni

nucleotidi poiché non è possibile recuperare l’informazione che è

andata perduta a seguito della rottura del doppio filamento.

Questo tipo di riparazione a sua volta ha diverse vie una volta che è

stato individuato il D.S.B per tentare, ove possibile, di ripristinare la

sequenza

Ricombinazione omologa (HR = Homologus ricombination)

Se la rottura di un filamento o di ambo i filamenti è avvenuta dopo la replicazione del DNA, quando

ci sono due cromatidi fratelli, è possibile sfruttare il cromatidio che non ha subito mutazioni per

ristabilire la sequenza nucleotidica nel punto di rottura.

È un processo complesso che vede l’avvicinamento di due molecole molto simili (o uguali nel caso

dei cromatidi fratelli) e trasferire l’informazione genetica dall’uno all’altro. Il processo può avvenire

anche tra cromosomi omologhi, tuttavia risulta molto difficile poiché essi possono trovarsi in 74

posizioni differenti all’interno del nucleo, tuttavia in meiosi i cromosomi omologhi sono

appaiati, perciò nel caso della meiosi è possibile utilizzare i cromosomi omologhi per

fare la ricombinazione omologa (gli alleli sono differenti fra di loro ma codificano per

lo stesso elemento si tratta di un errore che o non sussiste –alcuni geni sono

espressi nello stesso modo- o comunque risulta una alternativa migliore alla perdita

di informazione genetica).

Nei vari passaggi dopo la rottura del filamento le due estremità del doppio filamento

vengono contattate da un complesso enzimatico che produce dei primer single

strand a livello delle quali si possono legare le proteine RPA reclutando A51/A52

(a51 è l’omologo di Rec A nei procarioti che è l’enzima centrale della

ricombinazione), a51 è in grado di riconoscere nella regione omologa la sequenza

integra e formare una struttura a filamenti incrociati con varie proteine coinvolte tra

cui BRCA1, BRCA2, XRCC2, XRCC3, Mre11, Rad50, Rad51, Rad52, Xrs2.

Si tratta di un sistema che fattualmente può avvenire o dopo la replicazione del DNA

o in meiosi.

VIE ALTERNATIVE DI RIPARAZIONE

Esistono altre vie che la cellula è in grado di utilizzare per andare a riparare elementi del DNA tra

cui:

1. Blocco della trascrizione

la RNA polimerasi può replicare un gene e riscontrare un errore non risolvibile tale da formare

la trascrizione. Questi costituiscono segnali specifici per l’attivazione di sistemi di riparazione.

Esiste una riparazione accoppiata alla trascrizione che si basa sul N.E.R.: se la RNA

polimerasi trovasse un dimero di timidine bloccherebbe la replicazione, alla regione di

andrebbe a associare la proteina CSB che recluterebbe il complesso di enzimi delle vie di

riparazioni viste sopra per permettere alla RNA polimerasi di riprende la normale trascrizione.

2H permette il reclutamento delle proteine coinvolte in questo tipo di riparazione.

2. Blocco della replicazione

Analogamente al blocco della replicazione, la DNA polimerasi può trovare errori che inducono il

blocco della replicazione. Nello specifico la DNA polimerasi può procedere fino all’errore che

non le permette di procedere, a quel punto la forcella di replicazione si blocca e agisce da

segnale per il reclutamento di particolari DNA polimerasi in grado di “scavalcare” l’errore e

continuare il processo. Queste sono dette DNA polimerasi di translesione (le principali sono

DNA pol IV e DNA pol V nei procarioti, DNA pol η, ι, κ,

ζ sono alcune di quelle eucariotiche), appartengono

alla famiglia delle DNA polimerasi Y e hanno la

caratteristica di non essere rigide rispetto alla sequenza

da replicare poiché:

I. Hanno una maggiore flessibilità per i nucleotidi in

ingresso (non c’è necessita di appaiamento), essi

vengono semplicemente aggiunti per superare la

lesione;

II. Non hanno attività di proofreading;

III. Non hanno attività esonucleasica 3’-5’;

IV. Hanno bassa processività;

V. Sono in grado di produrre solo brevi sequenze

per poi sganciarsi e far riprendere la replicazione; 75

RISPOSTA SOS

Negli eucarioti ciascuna DNA polimerasi translesione assume importanze in tipi di translesioni

differenti.

Nei procarioti ne esistono solo due e complessivamente, essi sono dotati di un sistema che

garantisce la sopravvivenza dell’organismo (che hanno cicli cellulari molto brevi) anche dopo

massicci danni al DNA pur comportando delle mutazioni: la risposta S.O.S. È una risposta

complessa che si basa sul sistema RecA/LexA (essi hanno una azione antagonistica reciproca).

Quando il sistema si attiva porta a valle la trascrizione di geni che sono in grado di inibire la

replicazione e la divisione permettendo alla cellula di riparare i danni.

¬ Normalmente LexA funge da repressore della risposta SOS

¬ Danni al DNA inducono RecA a scatenare la risposta SOS (indipendentemente dalla presenza

di LexA basata sull’attivazione di regioni di RecA e la sua trascrizione): espressione di geni che

codificano per diversi enzimi di riparazione

¬ RecA attiva l’attività autoproteolitica di LexA

LA FOTORIATTIVAZIONE

È un meccanismo basato su un enzima specifico: DNA fotoliasi, esso agisce per riparare danni

causati tipicamente dalle radiazioni UV, si tratta di un approccio più diretto alla risoluzione del

problema della formazione dei dimeri di purine rispetto al sistema N.E.R.

L’enzima è inattivo in assenza di luce e solo le radiazioni vicino o all’interno dello spettro UV ne

stimolano un cambiamento conformazionale che agisce direttamente sul dimero andando a

rompere i legami covalenti che si sono formati tra gli anelli purinici.

Il normale funzionamento dei processi di riparazione permette alla cellula di riparare i 500000

danni quotidiani a cui è normalmente sottoposta. Problematiche patologiche possono insorgere

quando la cellula è sottoposta a un eccesso di elementi mutagenici (agenti chimici, radiazioni) che

portano alla incapacità della cellula di ripararsi (e quindi va o incontro a morte cellulare o può

diventare una cellula tumorale) oppure ci può essere un malfunzionamento di alcuni sistemi di

riparazione che portano alla formazione di malattie.

Ci sono ≈100 geni differenti coinvolti nella riparazione del DNA e una mutazione a uno solo di essi

può avere conseguenze gravi sulle capacità della cellula di gestire i danni.

Xeroderma pigmentoso (da cui prendono il nome le proteine eucariotiche del sistema di

riparazione N.E.R.) è una malattia genetica autosomica recessiva che colpisce il sistema di

riparazione N.E.R; presenta una ipersensibilità alla luce, aumentata insorgenza di carcinomi.Tutti i

viventi replicano il DNA, il processo risulta più semplice nei procarioti mentre negli eucarioti si tratta

di un processo più complesso che viene chiamato mitosi ed è l’unico evento cellulare osservabile

al microscopio, addirittura al microscopio ottico, poiché mentre avviene questo processo i

cromosomi sono condensati così tanto che sono visibili al microscopio. 76

PROCESSI DI DIVISIONE CELLULARE

MITOSI

La mitosi, per convenzione, è stata suddivisa in diverse parti:

-profase;

Il passaggio della cellula dalla fase G2 del ciclo cellulare alla mitosi (che comincia

proprio con la profase) non è un evento precisamente definibile, gradualmente dentro

al nucleo i cromosomi cominciano a condensarsi, cominciano ad apparire evidenti i

cromosomi e le strutture dei cromatidi, contemporaneamente il centrosoma gradualmente si

duplica e questi cominciano poi ad allontanarsi organizzando i microtubuli in una struttura bipolare

(si sta formando il fuso mitotico). Scompare il nucleolo perché i cromosomi si stanno condensando

e quindi esso si va a disorganizzare.

-prometafase

In questa fase l’involucro nucleare gradualmente si disgrega in piccole vescicole, fatto ciò il fuso è

libero di agganciare i cromosomi. Il processo è casuale: i microtubuli si trovano in una situazione

dinamica di allungamento/accorciamento e possono andare a contattare (una volta che si sono

associate) alcune proteine presenti sul cinetocore di entrambi i cromatidi fratelli.

-metafase

Quando tutti i cromatidi fratelli hanno preso contatto con i microtubuli dei centrosomi e la struttura

si è stabilizzata si entra in metafase, tutti i cromosomi si trovano allineati sullo stesso piano nella

posizione più distante dai centrosomi a formare la piastra metafasica. I cromatidi fratelli fino a

questo punto erano tenuti assieme nel centromero perché lì le molecole di DNA sono tenute

assieme da delle anse di cromatina strettamente associate che vengono associate da delle

proteine specifiche (facenti parte della famiglia delle coesine e condensine) per cui i cromatidi

possono essere separati.

-anafase

Durante questa fase il fuso comincia a cambiare le sue caratteristiche: i microtubuli legati al

centrosoma cominciano ad accorciarsi rapidamente trascinano con se, in direzioni opposte, i

cromatidi fratelli.

Altri microtubuli, che tengono assieme i due poli del fuso, si allungano ulteriormente per

allontanare i due poli del fuso mitotico.

-telofase

I cromosomi sono arrivati ai poli, il fuso comincia a depolimerizzarsi e intorno a ciascun polo del

fuso cominciano a polimerizzarsi nuovamente le lamìne per costituire la lamina nucleare e

l’involucro nucleare.

-citochinesi

È un processo che comincia con la telofase e vede la costrizione della zona centrale della cellula

da parte di una cintura di actina e miosina chiamato anello contrattile che si contrae fino a che i

due citoplasmi non sono completamente separati.

Sono delle suddivisioni convenzionali, non è possibile infatti stabilire esattamente il passaggio

dall’uno all’altra, fase centrale del processo è la metafase. Si tratta di un processo che va da

un’ora e mezza alle tre/quattro ore al massimo.

LA STRUTTURA DEL CROMOSOMA IN METAFASE

In metafase si osserva che ciascun cromosoma è costituito da due cromatidi fratelli identici fra di

loro che sono uniti a livello del centromero (costrizione primaria) e possono presentare una

costrizione secondaria (nell’uomo si osserva per i cromosomi 13,14, 15, 21,22) nel caso abbiano

una componente di nucleolo, i telomeri sono visibili solamente come le estremità dei cromosomi

altamente condensati.

Ciascun cromatide va incontro a modificazioni degli istoni, legami con proteine non istoniche come

le condensine che tengono vicine molte anse cromatiniche. 77

Altre proteine non istoniche si occupano di tenere uniti i cromatidi fratelli, in questo caso si tratta di

coesine che formano delle strutture in grado di tenere vicino le due molecole di DNA.

Il centromero non ha alcun ruolo al di fuori del processo di replicazione cellulare, si tratta di una

sequenza molto grande di nucleotidi che permette l’associazione di specifiche proteine che

formano il cinetocore che fungono da ponte fra i microtubuli del fuso e il centromero (tra fuso

mitotico e DNA).

IL CENTROMERO

Fa parte dell’insieme di DNA annoverato tra quello altamente ripetuto. Pur essendo una struttura

presente in tutti gli eucarioti (che hanno replicazione cellulare mediante mitosi) l’organizzazione del

DNA dei centromeri di ciascun organismo è tipica.

S. cerevisiae contiene un centromero lungo 120 paia di basi, l’elemento centrale ha oltre il 90%

• di nucleotidi A e T, ha 3 elementi (1 e 3 interagiscono con i microtubuli grazie al cinetocore).

Schizosaccharomyces pombae è anche esso un lievito che presente

• un centromero di 40000 paia di basi.

Gli insetti presentano dalle 400 kbp in su;

• 6

I mammiferi (uomo) arrivano fino a 10 paia di basi, è presente un

• elemento ripetuto centrale di 170 paia di basi che lega 30-40

microtubuli denominato DNA alfoide o α satellite.

Tipicamente contiene brevi sequenze modulari ripetute in segmenti

lunghi centinaia di nucleotidi e ogni segmento a sua volta viene ripetuto

in un ampio cluster.

IL CINETOCORE

È un complesso proteico specializzato che si assembla su ciascun centrosoma all’inizio della

replicazione in maniera tale da formare un disco proteico in modo che i centrosomi possano

essere legati ai microtubuli del fuso mitotico.

Proteine del cinetocore sono: CENP-A, CENP-B, CENP-C, CENP-D che si legano a livello del

DNA centromerico.

CENP-A è una variante dell’istone H3 mentre le altre sono proteine di origine differente.

IL CENTROSOMA

Chiamato anche centro organizzatore dei microtubuli o

MTOC, è una regione che contiene anche i centrioli, i quali sono

formati da microtubuli.

Prima ancora che la cellula entri in profase il centrosoma

comincia a essere duplicato, durante la fase G2 esso viene

replicato e man mano i due centrosomi formatisi cominciano a

distanziarsi per creare la struttura bipolare.

Permette di formare la struttura che garantisce la separazione del

materiale genetico e avviene prima della fase M del ciclo

cellulare.

In una cellula si osservano due centrosomi solo nelle cellule che

stanno andando incontro a replicazione cellulare mentre in interfase è presente solamente un

centrosoma. Il centrosoma contiene i due centrioli normalmente organizzati fra di loro che nei primi

istanti della fase M cellulare si separano appena formando un “abbozzo” da cui si originerà poi il

secondo centrosoma.

Organizza le fibre del fuso stesso che sono costituite da microtubuli. 78

CICLO DEL CENTROSOMA

Il primo evento che avviene è la formazione dell’aster: una struttura di microtubuli che si dipartono

dai due centrioli del centrosoma.

La struttura a “raggi” che si organizza alle coppie di microtubuli si modifica perché i due aster si

muovono verso posizioni opposte dell’involucro nucleare stesso “scivolando” sopra di esso.

Questo crea delle modificazioni di alcuni microtubuli che accompagnano lo spostamento degli

aster si allungano e a questo punto si comincia a formare il fuso mitotico stesso.

1. Il fuso comincia ad organizzarsi molto precocemente in profase (è uno degli eventi iniziali

della divisione cellulare)

2. Il fuso si organizza come una struttura complessa, soprattutto quando, disgregatosi l’involucro

nucleare, può entrare in contatto con il centrosoma attraverso la mediazione delle proteine

del cinetocore

3. Il suo ruolo cambia poiché non solo organizza il fuso mitotico ma anche contatta i cromosomi

e comincia le fasi successive di segregazione.

Nel fuso mitotico maturo si possono individuare tre tipologie differenti di microtubuli che hanno

nomi e funzioni diverse a seconda della loro forma e delle loro interazioni:

microtubuli del cinetocore: sono quei microtubuli che alla fine dei poli del fuso raggiungono i

• cromosomi (nella zona del centromero). Sono microtubuli che partono dal polo,

raggiungono e contattano i cromosomi, essi successivamente saranno responsabili del

movimento dei cromosomi.

microtubuli interpolari: sono microtubuli che si dipartono dai poli del fuso e mettono in

• contatto i poli stessi: i microtubuli interpolari si sovrappongono nella parte centrale del fuso

mitotico senza interagire con i cromosomi, questi sono importanti per distanziare i poli del

fuso mitotico man mano che procede la divisione cellulare.

microtubuli astrali: sono i primi ad essere organizzati intorno ai centrioli e sono importanti per

• posizionare i poli del fuso, permettono di mantere i poli del fuso in una posizione fissa,

direzionano e legano i poli del fuso.

IL FUSO MITOTICO

• Il fuso mitotico presenta inizialmente microtubuli particolarmente instabili;

• Il movimento del fuso mitotico rispetto ai cromosomi è garantito dalla possibilità di

allungamento dei microtubuli in direzione + e dalla possibilità di perdere tubulina in direzione –

• Esso comincia ad organizzarsi precocemente con la formazione degli aster, la struttura si

stabilizza quando i due aster entrano in contatto grazie ai microtubuli che presentano alcune

proteine in grado di legare in modo dinamico nella zona dei microtubuli interpolari

• Zona di particolare importanza è la parte centrale del fuso mitotico, qui si osservano tutte le

estremità + dei microtubuli interpolari osservando come tutti i microtubuli presentino l’estremità

– (anche quelli astrali) rivolta verso i poli del fuso

• I microtubuli interpolari si interdigitano nella parte centrale e si vengono così a evidenziare

due emifusi che sono parti simmetriche e opposte del fuso mitotico, gli emifusi hanno

caratteristiche tipiche per ogni cellula.

Quando l’involucro nucleare nella prometafase viene frammentato in vescicole

che si distribuiscono nella cellula in divisione. I cromosomi si sono compattati

e i microtubuli del fuso possono accedere agli stessi grazie all’interazione con

il cinetocore. Il contatto dei microtubuli con il cinetocore è casuale e dopo che

c’è stato l’aggancio tra cinetocore e microtubuli comincia un lento processo di

movimento che risulta, nelle prime fasi, casuale: ci sono sia allungamenti che

accorciamenti dei microtubuli, inoltre il primo contatto non è solitamente

diretto ma laterale e avviene con solo un microtubulo presente su solo uno

dei due poli. In seguito l’altra parte del cinetocore viene agganciato da altri

microtubuli andando per tentativi: ci può essere un aggancio incorretto o un

aggancio con microtubuli provenienti dallo stesso polo, questi legami però

risultano instabili. Quando è stato stabilito un contatto con ambo i poli

l’interazione si modifica e passa da laterale a diretta (i microtubuli vengono

chiamati microtubuli del cinetocore). 79

• Le interazioni che prendono luogo non sono sempre corretto ed è

solitamente necessario andare per tentativi al fine di stabilire la corretta

interazione tra fuso mitotico e cromosomi;

• Movimenti di trazione dei microtubuli del cinetocore, insieme a altri

movimenti dei microtubuli astrali (inizialmente caotici e poi coordinati)

permettono ai cromosomi di andare a organizzarsi nella piastra

metafasica dove viene momentaneamente trattenuto grazie all’effetto treadmilling che

produce un bilancio nullo dell’aggiunta di tubulina;

• La separazione dei cromatidi fratelli (che fa parte della anafase) vede la necessità fisica di

spostare i cromatidi ma anzitutto la necessità di separarli fisicamente (sono tenuti assieme da

coesine). I due cromatidi sono separati dalla separasi

che taglia le coesine, essa è una proteina mantenuta

inattiva all’interno della cellula perché si complessa

con un’altra proteina, la securina. La securina è

controllata (per il legame con la separasi) dalla

proteina APC/C (anafase promoting complex), a

sua volta APC/C deve essere attivato nell’anafase

grazie alla fosforilazione da parte di un complesso

ciclina-dipendente (M-Cdk).

M-Cdk recluta Cdc20 che si lega al complesso APC/C

inattivo e lo va ad attivare. APC/C attivo va a agire sul

complesso securina/separasi inducendo la

separazione delle due parti e l’ubiquitinazione e

degradazione della securina, infine la separasi

attivata agisce sulle coesine andando a scinderle di

modo da liberare i cromatidi fratelli.

L’ANAFASE

Durante l’anafase si verifica il movimento dei cromatidi verso i poli opposti del fuso mitotico.

Essa viene suddivisa in due parti:

Anafase A

I cromatidi cominciano a muoversi per accorciamento dei microtubuli del cinetocore che vanno

incontro a una veloce depolimerizzazione. Intervengono le proteine motrici dei microtubuli stessi:

Le proteine motrici (famiglia delle dineine) sono agganciate al cinetocore e si muovono sul

microtubulo inducendone la depolimerizzazione

Anafase B

Intervengono anche i microtubuli interpolari scorrendo fra di loro andando ad accentuare il

fenomeno di separazione dei cromatidi fratelli.

L’allontanamento dei poli del fuso e garantito da delle proteine motrici dei microtubuli (chinesine

mitotiche), che permettono lo scorrimento reciproco dei microtubuli interpolari.

L’effetto è ulteriormente

amplificato dalla trazione

esercitata dai microtubuli astrali

con l’ausilio di proteine motrici

ancorate alla membrana che

scorrono sui microtubuli creando

una forza di trazione dei poli del

fuso verso il plasmalemma. 80

CITOCHINESI o CITOCINESI o CITODIERESI

Questa fase di divisione del citoplasma che porta alla

formazione delle due cellule figlie ha inizio già

nell’anafase, si organizza già la struttura dell’anello

contrattile. La separazione del citoplasma va anche sotto

il nome di segmentazione poiché si tratta dalla semplice

separazione di due unità per formazione di una struttura

intermedia.

L’anello contrattile è costituito da strutture di actina su cui

agiscono le miosine, esso si forma esattamente dove viene indicato dal fuso mitotico, nella parte

centrale dello stesso, grazie ai microtubuli che durante la mitosi raggiungono la membrana

plasmatica.

Il fuso deve forzatamente indicare alla cellula dove organizzare l’anello contrattile.

Nelle cellule epiteliali c’è un piano di divisione molto rigidamente individuato, deve essere lungo

l’asse maggiore della cellula stessa: l’orientamento del fuso è fondamentale per ottenere una

corretta divisione della cellula e esso si può organizzare correttamente perché i microtubuli astrali

del fuso mitotico interagiscono con un anello di molecole di dineina che si trovano vicino al

“collo” della cellula epiteliale. L’interazione traina il fuso mitotico e lo posiziona precisamente,

indicando alle cellule stesse quale è il piano di divisione.

Le due cellule si separano per scivolamento dei microtubuli

dell’anello contrattile l’uno rispetto all’altro che provoca un

restringimento a livello dell’equatore del fuso mitotico, quando l’anello

contrattile si contrae molto produce il corpo intermedio ovvero un

anello contrattile di dimensioni ridotte con una concentrazione molto

elevata di microfilamenti di actina con le miosine.

Nella fase finale le membrane sono così vicine che per le proprietà

idrofobiche della membrana stessa si possono unire andando a

riformare la membrana stessa.

L’EVOLUZIONE DEL PROCESSO DI DIVISIONE CELLULARE

I processi di divisione cellulare degli eucarioti superiori si sono evoluti

da processi più semplici che si presentano in alcuni organismi meno

complessi.

I dinoflagellati, le fibre del fuso mitotico permangono all’esterno

dell’involucro nucleare e la separazione avviene perché i cromatidi

fratelli si ancorano all’involucro nucleare mentre i microtubuli

attraversano l’involucro per dare polarità alla separazione senza

entrare in alcun modo in contatto con i cromatidi.

Alcuni dinoflagellati e gli ipermastigoti creano un canale all’interno

dell’involucro stesso, i cromatidi attraverso i loro cinetocore sono

attaccati all’involucro nucleare ma possono interagire con i

microtubuli che si agganciano quindi all’involucro nucleare dove si

trovano i cinetocori.

Nei lieviti l’involucro nucleare rimane completamente intatto e la

struttura del fuso mitotico si forma all’interno dell’invocluro nucleare,

mediano la separazione dei cromosomi dall’interno del nucleo.

Tutte e tre le modalità sopra descritte sono dette mitosi chiuse

perché non prevedono la scomparsa dell’involucro nucleare.

La mitosi aperta è quella tipica degli eucarioti superiori. 81

RICONOSCIMENTO DELLE FASI DELLA MITOSI

Profase si osservano i cromosomi che appaiano definiti ma non particolarmente “densi”;

• Metafase si osserva una maggiore “densità” dei cromosi;

• Anafase si osserva una separazione dei cromatidi fratelli che rimangono particolarmente densi.

ANOMALIE ANAFASICHE

È possibile che alcune cellule, perché danneggiate, diano delle anafasi anomale come nel caso

della condivisione di cromosomi che creano dei “ponti” per cui non si riesce ad avere una

separazione del citoplasma, perciò si originerà una cellula binucleata.

Le anomalie anafasiche sono tipiche di cellule danneggiate da Radiazioni, sostanze chimiche e

non è infrequente che si tratti di cellule tumorali. 82


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Appunti completi di tutte le lezioni di Biologia integrate grazie allo studio e all'ausilio di informazioni e immagini reperite individualmente. Può essere utilizzato per preparare l'esame completamente in quanto sono presenti tutte le informazioni necessarie. Gli appunti sono riferiti all'anno accademico 2015/2016 ma possono essere utilizzati anche da studenti di anni successivi in quanto il programma è lo stesso. I professori erano la professoressa Braghetta, Il professor Bonaldo e il professor Moro.


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in medicina e chirurgia 1 (ordinamento U.E. - 6 anni)
SSD:
Università: Padova - Unipd
A.A.: 2016-2017

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher GabrieleMonetti di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biologia generale e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Padova - Unipd o del prof Braghetta Paola.

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