Documento completo per esame di Biologia med 3-4

FATTORI GENERALI DI TRASCRIZIONE

I fattori di trascrizione generali sono 6, vengono indicati con TF II (Transcription Factor II –RNA

pol II) A,B,D,E,F,H. Devono essere presenti perché si formi il complesso di pre inizio che

comprende la RNA pol II, il quale si organizza in stretta prossimità del sito di inizio della

trascrizione e dirige l’inizio della trascrizione stessa.

I TF intervengono in momenti diversi e con funzioni diverse.

TF 2D è il fattore generale di trascrizione generale chiave per l’attività della RNA pol II, esso lega il

promotore stesso (quindi individua il promotore e ne permette l’attivazione).

2D caratteristiche:

Contiene una proteina che è in grado di riconoscere specificatamente TATA box (TBP= TATA

• box binding protein)

contiene 11 subunità chiamate TATA box binding protein associated factors (TAF): l’insieme

• di queste proteine crea il primo punto di contatto per gli altri fattori generali della trascrizione.

Produce un angolo di 80° nella molecola di DNA legandosi attorno alla TATA box, ciò produce

• modificazioni strutturali facilmente riconoscibili dagli altri fattori di trascrizione

TF 2A stabilizza TF 2D nella sequenza promotoriale

• TF 2B è responsabile del reclutamento della RNA pol II, esso la raccoglie e la aggancia agli altri

• fattori generali di trascrizione.

TF 2F agisce stabilizzando RNA pol II sul sito di trascrizione in concerto con TF 2B.

• TF 2E richiama TF 2H e lo recluta sulla polimerasi, TF 2H è estremamente importante poiché è

• in grado di aprire la molecola di DNA rendendola leggibile alla RNA pol II, 2H ha attività chinasica

che agisce su una coda C terminale (composta da una ripetizione di 7 amminoacidi avente in

posizione 5 una serina che viene specificatamente fosforilata) della polimerasi, questo permette

il raggruppamento dei fattori di allungamento. 2H rimane associato alla RNA polimerasi e

permette il reclutamento di elementi coinvolti nella riparazione per mezzo del blocco della

trascrizione. 29

SEQUENZA DI INGRESSO TF II

2D entra per primo riconoscendo TATA box e si posiziona su di

essa.

2B si lega alla sequenza BRE (TF 2 B recognition element), 2B è

estremamente importante perché è in grado di segnalare alla RNA

pol II la direzione di lettura del messaggio del gene.

2F aggancia la RNA pol II e 2E porta la polimerasi nella sequenza

indicata da 2D e 2B

2H entra e apre la doppia elica del DNA andando a permettere alla

RNA pol II di iniziare la trascrizione.

RNA pol II comincia la sintesi dell’RNA usando nucleotidi trifosfati.

Tutti i fattori di trascrizione devono assemblarsi a formare il

complesso di pre-inizio poiché esso è necessario affinché la

RNA pol II si leghi alla sequenza, riconosca il filamento

stampo, possa leggere il filamento stampo.

FATTORI DI ALLUNGAMENTO

Completata la fosforilazione ad opera di TF 2H i fattori di

generali di trascrizione vengono rimossi e la RNA pol II può

procedere più rapidamente durante l’attività trascrizionale. I

fattori di allungamento sono molteplici e di vario tipo a

seconda delle necessità della cellula.

PROMOTORI E SEGNALI PER RNA POL I e RNA POL III

Esistono specifiche sequenze promotoriali e fattori di

trascrizione per permettere alla RNA pol I di trascrivere alcuni

geni, in particolare quello codificante per rRNA 45S.

Due importanti esempi di fattori di trascrizione sono:

SL1 che contiene al suo interno una proteina similare a TBP

• che riconosce una sequenza specifica a monte della

regione trascritta

UBF

•

RNA pol III presenta fattori generali della trascrizione che possono agire su sequenze promotoriali

a valle del sito di inizio della trascrizione ma anche a monte del sito di inizio della trascrizione, essa

assume quindi una doppia valenza:

TF 3C lega la sequenza promotoriale sia che si trovi nella regione trascritta sia che si trovi a

• monte. Permette l’assemblaggio degli altri fattori di trascrizione che successivamente

recluteranno RNA pol III.

INIBITORI DELLA TRASCRIZIONE

α amanitina derivata dall’amanita falloide, è un fortissimo inibitore della RNA polimerasi II ed è

• considerato un agente tossico.

ripamicina e la streptomicina legano le subunità β della RNA polimerasi batterica, sono usate

• come farmaci. 30

FATTORI DI TRASCRIZIONE TESSUTO-SPECIFICI

L’ulteriore controllo della RNA polimerasi II permette il differenziamento dei diversi tipi cellulari nei

vari tessuti e riguarda tutta una serie di geni che vengono trascritti e tradotti solamente in alcune

cellule. Questi geni sono espressi in modo tempo-specifico dalle cellule.

In molte specie esistono delle sequenze di DNA che si sono mantenute che vengono riconosciute

da fattori di trascrizione tessuto-specifici, essi sono responsabili dell’aumento e della

diminuzione dell’attività trascrizionale.

Caratteristiche comuni fattori di trascrizione tessuto-specifici:

Un dominio che lega la molecola di DNA riconoscendo delle sequenze specifiche del DNA,

• questo dominio predilige il solco maggiore che è più ampio, forma dei legami H grazie a delle

asparagine con specifici nucleotidi. Il legame risulta specifico.

Un dominio di attivazione, esso è responsabile della interazione con la RNA polimerasi.

•

Le classi dei fattori di trascrizione tessuto-specifici sono 4:

Domini di legame tramite elica-giro-elica (HTH)

• Domini di legame tramite elica-ansa-elica (HLH)

• Le cerniere di leucina (Leucine zipper): Sono proteine che presentano una successione di

• Legami H tra di loro formando un legame tra le catene polipeptidiche lasciando libere due

“gambe” che interagiranno con il DNA;

Dita di zinco (Zinc finger): Sono proteine in cui la molecola chiave è lo ione zinco che si mette

• in relazione con 4 diversi amminoacidi creando 4 diverse “dita” che contatteranno il DNA (la

specificità delle dita dipende dagli amminoacidi presenti sul dito), ogni dito è in grado di

riconoscere tre differenti nucleotidi.

Molti fattori di trascrizione non agiscono da singoli fattori bensì vanno a formare dimeri differenti

interagendo fra di loro (creano omodimeri e eterodimeri), questo permette, insieme alle diverse

formazioni proteiche, di riconoscere, con relativamente poche proteine, una vasta gamma di

sequenze nucleotidiche.

RICONOSCIMENTO DELLE INTERAZIONI SEQUENZA-FATTORE DI TRASCRIZIONE T.S.

Questo sistema permette di riconoscere quali fattori di trascrizioni vadano a interagire con quali

sequenze di DNA.

Si prende una sequenza di DNA, la si marca in 3’ o 5’ (a seconda della necessita) con sostanze

radioattive o fluorescenti, si mescola a una proteina di interesse (che nello specifico si pensa

possa legare una specifica sequenza nucleotidica), in seguito si introduce un agente in grado di

tagliere in punti randomici la sequenza di DNA. Si lascia agire l’agente il tempo necessario a

ottenere una singola scissione quindi si effettua una elettroforesi in modo da separare i diversi tratti

di DNA. Si raffronta l’elettroforesi con una di riferimento senza proteina di interesse: il campione

con proteina dovrebbe mostrare una distribuzione a scala interrotto nel punto dove la proteina si è

legata.

Si può usare un raffronto tra diversi estratti cellulari: si usa una sequenza marcata e la si pone a

contatto con l’estratto cellulare, passando poi ciò che si ottiene in un gel con una corsa

elettroforetica si osserverà il posizionamento in una banda specifica dell’elemento considerato

(visto che il legame tra molecola di DNA e proteina ne aumenta il peso e ne varia la corsa

elettroforetica).

Si può anche osservare la sequenza specifica che interagisce con un dato fattore di trascrizione: si

usa sempre una sequenza di DNA, la si fa interagire con una proteina specifica, quindi si separa

(grazie al differente peso) l’insieme di molecola di DNA e proteina che ha interagito e si va poi a

sequenziare il DNA che è stato in grado di interagire. Ciò ha permesso di stabilire quali sequenze

si associano a quali fattori di trascrizione.

Gli studi hanno permesso di osservare sequenze consensus anche in questo ambito. 31

MODIFICAZIONI DELLE PROTEINE ISTONICHE

Le modificazioni vanno a cambiare l’identità della coda istonica perturbando le interazioni tra le

code istoniche e il DNA stesso.

La acetilazione da parte della istone acetiltransferasi rimuove la carica positiva, sicché le code

non agganciano stabilmente in nucleosoma al DNA permettendo allo stesso di essere spostato.

Il processo inverso ancora il nucleosoma al DNA impedendo la trascrizione.

Gli istoni e le loro modificazioni sono responsabili dell’attività trascrizionale, in particolare

l’acetilazione è responsabile della “permissività” di trascrizione dei geni. Le modificazioni post-

traduzionali si vanno a sommare agli effetti ottenuti dai fattori di trascrizione generali e tessuto-

specifici.

COMPLESSI DI RIMODELLAMENTO DELLA CROMATINA

Questi complessi ATP-dipendenti sono in grado di “rilassare” l’interazione che sussiste tra il

nucleosoma e il DNA permettendo di esporre alcune sequenze altrimenti irriconoscibili dai fattori di

trascrizione generali: i complessi di rimodellamento inseriscono le variante istoniche che

modificano le interazioni nel nucleosoma, ciò, ad esempio, permette di esporre la TATA box che

può quindi essere legato dal fattore di trascrizione generale andando a “stimolare” la trascrizione.I

processi post trascrizionale avvengono non solo dopo che l’intero RNA è stato prodotto ma

cominciano quando RNA polimerasi agisce: il capping avviene mentre l’RNA scorre sul gene e le

proteine coinvolte sono reclutate dalla polimerasi stessa, giunta alla fine del gene l’RNA polimerasi

si stacca e avviene il tailing che vede l’aggiunta di una coda poli A (100-250 adenine ripetute).

L’ultimo processo è lo splicing che vede la rimozione di tutti gli introni (sequenze che non

contengono elementi importanti nell’RNA maturo). 32

CAPPING

È il primo elemento di modificazione che prende luogo (perché

l’estremità 5’ è la prima ad essere formata) ed è tipico di tutti gli RNA

eucariotici prodotti dalla RNA pol II. La RNA polimerasi, appena viene

prodotto il 5’ ,recluta le proteine coinvolte nei processi di capping

grazie alla fosforilazione della serina 5 della sequenza amminoacidica

della coda C-terminale, successivamente la RNA pol si muove lungo il

gene.

Essa porta all’organizzazione del 5’ di RNA e produce un cappuccio

protettivo sul trascritto per evitare che venga diger